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proBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
PROBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
杨隆秋1李昌琪2常业恬1徐军美1戴茹萍1*
1中南大学湘雅二院麻醉科,湖南长沙410011中国
2中南大学人体解剖和神经生物学教研室,湖南长沙410011中国
*通讯作者
【摘要】 目的研究大鼠后足切割后PROBDNF在脊髓和背根神经节的表达及注射PROBDNF后大鼠的行为学变化。
方法16只大鼠随机分为切割组和对照组,切割组建立后足切割模型,取两组大鼠的脊髓和背根神经节行免疫荧光实验;腹腔注射不同剂量的抗PROBDNF抗体,腹腔注射抗PROBDNF抗体和抗BDNF抗体,鞘内注射抗PROBDNF抗体和抗BDNF抗体,足底注射抗PROBDNF抗体,而后建立切割模型,行切割后机械刺激缩足阈值测定。
结果切割1小时后大鼠背根神经节PROBDNF的表达增强,脊髓PROBDNF的表达没有明显变化;腹腔注射抗PROBDNF10mg/kg对大鼠切割疼痛止痛作用最明显;鞘内注射抗BDNF有明显的止痛作用,腹腔注射抗PROBDNF有明显的止痛作用;足底注射抗PROBDNF止痛作用不明显。
结论PROBDNF在转运至脊髓之前已经转变为成体BDNF或者与其受体结合,腹腔注射PROBDNF具有明显的止痛效果,并且其止痛作用有封顶效应。
【关键词】PROBDNF;切割痛;免疫荧光;行为学
TheeffectsofPROBDNFoncuttingpaininratswiththehindpawincision
Long-QiuYang1,Chang-QiLi2,Chang-YeTian1,Jun-MeiXu1andRu-PingDai1*
Address:
1DepartmentofAnesthesia,Xiang-YaSecondHospital,CentralSouthUniversity,Changsha,PRChinaand2DepartmentofAnatomyandNeurobiology,Xiang-YaCollegeofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha,PRChina
Email:
;
CorrespondingauthorRu-PingDai*-
【Abstract】 ObjectiveTostudyPROBDNF’sexpressioninthespinalcordanddorsalrootgangliaafterrat’shindpawincisionandthechangesofbehaviorafterPROBDNFinjection.Methods16ratswererandomlydividedintocuttinggroupandcontrolgroup.cuttingmodelweresetupinratsofcuttinggroup.Immunofluorescencetestdetectedthespinalcordanddorsalrootgangliafromtwogroupsofrats.Weestablishedcuttingmodelandmeasuredhind-pawwithdrawalthresholdafterincisionafterintraperitonealinjectionofdifferentdosesofanti-PROBDNFantibodies,intraperitonealinjectionofanti-PROBDNFantibodyandanti-BDNFantibody,intrathecalinjectionofanti-PROBDNFantibodyandanti-BDNFantibodyandplantarinjectionofanti-PROBDNFantibody.ResultsPROBDNF’sexpressionwasenhancedindorsalrootganglion1hourafterincisionanditsexpressioninspinalcordhadnosignificantchange.Intraperitonealinjectionofanti-PROBDNF10mg/kghadthemostobviouspaininhibition.Intrathecalinjectionofanti-BDNFhadobviousanalgesiceffectandsodidintraperitonealinjectionofanti-PROBDNF.PROBDNF’splantarinjectionhadnoobviousanalgesiceffect.ConclusionPROBDNFhadbecomematureBDNForcombinedwithitsreceptorinpriortotransportationtothespinalcord.IntraperitonealinjectionofPROBDNFhadobviousanalgesiceffect,andtheroleofitsanalgesiahadceilingeffect.
【Keywords】PROBDNF;Cuttingpain;Immunofluorescence;;behavior
前言
神经营养因子家族成员之一脑源性神经营养因子(BDNF)分子量为12.4-kDa,在调节神经元的存活、生长、分化方面扮演着重要的角色。
近年来的研究发现BDNF还有一个重要的功能是作为一个疼痛的中枢性调质出现,因为它在伤害性疼痛刺激出现时无论在脊髓水平还是在脊髓上水平都是重要的感觉神经传递调质[1,2,3,4],而且在许多形式的痛觉过敏表现出的中枢敏感化也起关键作用[5,6]。
我们以前的研究发现[7]切割疼痛引起的同侧背根神经节和腰段脊髓中BDNF的上升与切割诱发的痛觉过敏有关,并且鞘内注射BDNF对大鼠切割疼痛有明显的抑制作用,而腹腔注射效果不明显。
众所周知,对于术后患者如果鞘内给药止痛一则操作复杂,二则是一种有创的穿刺不易为临床推广,所以我们把目光对准PROBDNF。
目前国内外关于脑源性神经营养因子在疼痛中的作用尚无统一的认识,而且其前体(Pro-BDNF)对疼痛作用的研究尚未见报道,所以我们建立一种大鼠后足切割疼痛模型来模拟外科手术术后疼痛来研究ProBDNF对切割后疼痛的影响。
材料与方法
1大鼠切割疼痛模型的建立及主要器材、试剂来源
健康、成年、雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠(体重150-250克),湖南农业大学实验动物中心提供。
在安静、无强光、室温22±10℃、12小时日夜交替的环境中饲养3天后实验。
应用含1.5%异氟醚的氧气迅速麻醉后,将大鼠的右后足用络合碘消毒,按照Brennan[8]的方法使用10号手术刀片从足底近端0.5cm处向趾部行一约1cm长的纵向切口,切开皮肤后用眼科镊挑起足底肌肉并切割至骨膜,保持肌肉肌腱及其附着点完好。
压迫止血,用4-0的外科缝线缝合皮肤两针,保持切口皮肤对合整齐。
全部手术时间控制在5分钟内,术毕消毒切口,涂红霉素眼膏。
实验用抗BDNF及抗PROBDNF血清由澳大利亚Flinders大学周兴富博士惠赠,VonFrey纤维丝购至美国Stolting公司,TD5002型电子秤购至浙江余姚金诺天平仪器公司,荧光显微镜购至日本Olympus公司,微量移液器购至日本Nichiryo公司,冰冻切片机购至德国Leica公司,显微照相系统、图像分析系统购至Moticimagesadvance。
2免疫荧光实验
16只SD大鼠随机分为两组,每组8只,分别是切割组(Ⅰ组),对照组(Ⅱ组),Ⅰ组大鼠按照1所示方法建立后足切割模型,1小时后与Ⅱ组大鼠立即用10%水合氯醛(8ml/kg,i.p)麻醉,待大鼠深度麻醉以后,迅速剪开胸腔,从左心室插管至升主动脉内,用0.9%生理盐水灌注(约250ml),见右心室流出液基本无色后,以4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PH值7.20)500毫升灌注固定,约60分钟后,待大鼠四肢变硬后,取出与坐骨神经相连的腰段脊髓和背根神经节置于上述的4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液中室温后固定4小时。
然后置于30%蔗糖的0.01mol/L磷酸缓冲液(PH值7.4)中4℃至标本沉底(约48小时)。
取沉底标本,进行连续恒冷冰冻切片,脊髓片厚30μm,背根节片厚25μm,每隔5张切片收集1张置于0.01mol/L磷酸缓冲液中4℃保存备用。
使用上述脊髓和背根神经节切片,使用玻片法进行免疫荧光染色,过程如下:
1)裱片,自然晾干过夜
2)用含0.3%TritonX-100的5%正常牛血清白蛋白室温封闭2小时
3)弃去封闭液,加入多克隆sheep抗PROBDNF一抗液(1:
200),4℃冰箱中孵育过夜
4)PBS振动洗片5分钟×3次
以下过程避光操作
5)Cy3标记的羊抗sheepIgG(1:
200)室温孵育2小时
6)PBS振动洗片5分钟×3次
7)甘油与0.01MPBS(1:
1)封片,置入-20℃冰箱暂存
8)荧光显微镜下观察,照片
3痛觉行为学检测
痛觉过敏检测根据Chaplan等[9]描述的使用尼龙von-Frey纤维检测方法,结果使用软件进行计算。
痛觉过敏的行为学检测是将大鼠放置在金属纤维编织的平台上,上罩一个透明的有机玻璃罩。
于老鼠安静约20分钟后进行行为学测试,用不同粗细的von-Frey纤维触顶大鼠后足,von-Frey纤维触顶部位为切口中部边缘1mm出,保持纤维呈“S”型,持续6秒钟以上仍然不出现缩足反应记录为阴性。
在刺激时间内或者von-Frey纤维离开时出现快速的缩足反应记录为阳性,大鼠在金属网上的活动不记录为阳性。
出现阳性反应就依次递减(选用相邻的较细的von-Frey纤维)刺激强度,回缩阴性就依次增大刺激强度(选用相邻的较粗的von-Frey纤维)。
依次记录6次回缩反应以及记录最后一次刺激所对应的刺激重。
5分钟后重复一次,把两次测量的结果用“X”表示阳性,用“O”表示阴性输入软件计算,可以得到此时大鼠的痛觉评分,即大鼠损伤侧后肢的机械刺激缩足阈值(pawwithdrawalthreshold,PWT)。
3.1腹腔注射抗PROBDNF对大鼠后足切割疼痛影响的量效关系
40只SD雌性大鼠随机分为五组:
Ⅰ组腹腔注射抗Pro-BDNF30mg/kg,稀释成1毫升(n=8);
Ⅱ组腹腔注射抗Pro-BDNF10mg/kg,稀释成1毫升(n=8);
Ⅲ组腹腔注射抗Pro-BDNF3mg/kg,稀释成1毫升(n=8);
Ⅳ组腹腔注射IgG1毫升(n=8);
Ⅴ组腹腔注射IgG1毫升(n=8);
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组腹腔注射药物15分钟后切割右后足、缝扎,测切割后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈;Ⅴ组为不切割组,测注射后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈。
3.2腹腔注射抗BDNF和抗ProBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
32只SD雌性大鼠随机分为四组:
Ⅰ组腹腔注射抗Pro-BDNF10mg/kg稀释成1毫升,(n=8);
Ⅱ组腹腔注射抗BDNF10mg/kg[7]稀释成1毫升,(n=8);
Ⅲ组腹腔注射IgG稀释成1毫升,(n=8);
Ⅳ组腹腔注射IgG稀释1毫升(n=8);
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组腹腔注射药物15分钟后切割右后足、缝扎,测切割后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈;Ⅳ组为不切割组,测注射后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈。
3.3鞘内注射抗BDNF和抗ProBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
鞘内置管模型[10]:
大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉后取俯卧位,背部剃毛消毒后铺洞巾,摸清两侧髂棘,其连线为L6,在L3-4间隙处作长约2cm的皮肤纵切口,切开该处背棘肌的筋膜,切断L3-4及L4-5棘间韧带,分离L4棘突两侧肌肉,切除L4棘突和邻近椎板,暴露L4与L3棘突间隙,以18G注射针尖仔细分离此间隙上下的筋膜及肌肉组织,大鼠脊柱尽量向前卷曲,再以25G针轻轻穿破黄韧带,用巾钳夹住L3椎板并往上提,经黄韧带破口插入导管,方向务必与脊柱呈纵轴平行,过黄韧带后再穿过一层硬膜,导管插入2cm,使开口的头端适位于L1-2,导管固定后,注入生理盐水0.1ml冲洗导管并观察插管处有无液体外溢。
经皮下隧道将导管的另一端引出于颈背部,外露3cm固定,并夹闭导管外口,以防脑脊液外溢,逐层缝合肌肉和皮肤,局部敷以青霉素粉。
术后大鼠单独置于干净的塑料笼中喂养,自然饮水进食,置管3d后鞘内注射2%的利多卡因20μl,如出现双下肢麻痹、拖地,则可认为置管确在蛛网膜下腔,10μlNS冲管后3天后用于鞘内给药。
32只SD雌性大鼠随机分为四组:
Ⅰ组鞘内注射抗Pro-BDNF10mg/kg稀释成30微升,(n=8);
Ⅱ组鞘内注射抗BDNF10mg/kg稀释成30微升,(n=8);
Ⅲ组鞘内注射IgG稀释成30微升,(n=8);
Ⅳ组鞘内注射IgG稀释30微升(n=8);
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组鞘内注射药物15分钟后切割右后足、缝扎,测切割后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈;Ⅳ组为不切割组,测注射后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈
3.4足底注射PROBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
16只SD雌性大鼠随机分为两组:
Ⅰ组右侧足底注射抗Pro-BDNF300微克稀释成50微升,(n=8);
Ⅱ组右侧足底注射生理盐水50微升,(n=8);
Ⅰ、Ⅱ组足底注射药物15分钟后切割足底注射处,缝扎,测切割后30min,1h,3h,6h,1d,3d的机械痛阈
4图像获取与分析
使用HPIAS-1000图像分析系统进行图像分析。
应用连接于显微镜的数码相机获取图像,确保所以图像均为原始图像。
5统计方法
应用SPSS13.0软件分析数据,数据应用平均值±标准差(X±S)表示,计量资料的组间比较采用两样本t检验,以p<0.05作为判断差异显著性的标准。
结果
1免疫荧光实验
切割1小时后大鼠背根神经节PROBDNF的表达与对照组相比明显增强。
如图1所示,图中蓝色部分表示背根神经节的神经元细胞胞核。
B
Figure1:
Pro-BDNFinDRG.
LEFT:
1hafterincision,RIGHT:
control
切割1小时后大鼠脊髓PROBDNF的表达与对照组相比没有明显变化。
如图2所示,图中蓝色部分表示脊髓的神经元细胞胞核。
B
Figure2:
ProBDNFinspinalcord.
LEFT:
1hafterincision,RIGHT:
control
2痛觉行为学检测
2.1腹腔注射抗PROBDNF对大鼠后足切割疼痛影响的量效关系
注射PROBDNF30mg/kg、10mg/kg后0.5小时、1小时、3小时、6小时大鼠右后足的机械痛阈明显高于注射PROBDNF3mg/kg和IgG组,相比较有统计学差异,p<0.05;但是注射PROBDNF30mg/kg、10mg/kg两组0.5小时、1小时、3小时、6小时大鼠右后足的机械痛阈无明显差别,相比较无统计学差异,p>0.05。
见图3
图3腹腔注射抗PROBDNF对大鼠后足切割疼痛影响的量效关系
*p<0.05
2.2腹腔注射抗BDNF和抗ProBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
腹腔注射抗PROBDNF10mg/kg后0.5小时、1小时、3小时、6小时大鼠右后足的机械痛阈明显高于注射抗BDNF10mg/kg和IgG组,相比较有统计学差异,p<0.05;但是注射BDNF10mg/kg和注射IgG两组0.5小时、1小时、3小时、6小时大鼠右后足的机械痛阈无明显差别,相比较无统计学差异,p>0.05。
见图4
图4腹腔注射抗BDNF和抗ProBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
*p<0.05
2.3鞘内注射抗BDNF和抗ProBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
鞘内注射抗BDNF10mg/kg后0.5小时、1小时、3小时、6小时大鼠右后足的机械痛阈明显高于注射抗PROBDNF10mg/kg和IgG组,相比较有统计学差异,p<0.05;但是注射PROBDNF10mg/kg和注射IgG两组0.5小时、1小时、3小时、6小时大鼠右后足的机械痛阈无明显差别,相比较无统计学差异,p>0.05。
见图5
图5鞘内注射抗BDNF和抗ProBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
*p<0.05
2.4足底注射PROBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
足底注射PROBDNF300微克和注射NS两组各时间点大鼠右后足的机械痛阈无明显差别,相比较无统计学差异,p>0.05。
见图6
图6足底注射PROBDNF对大鼠后足切割疼痛的影响
讨论
术后疼痛是人体受到手术伤害刺激后的一种反应,是继麻醉、手术创伤之后对病人的又一次打击。
术后疼痛最主要是切割疼痛,切割疼痛也是一种创伤,疼痛治疗的好坏对术后恢复及手术效果有直接影响。
切割痛是一种独特而常见的急性疼痛,包括静息疼痛和机械诱发疼痛[8],非NMDA受体与切割导致的疼痛以及痛觉过敏有关[11,12,13]。
这些证据表明,切割疼痛与其它的病理性疼痛有着不完全相同的机制。
神经营养因子由神经元细胞合成,并以轴突运输方式转运至末梢[14,15]。
而对于脑源性神经营养因子而言,其合成和顺行转运可以在神经元内进行,但是小胶质细胞也能合成及释放[16]。
脑源性神经营养因子所具备的能顺行转运至神经末梢的能力是其与其它的神经营养因子的明显区别。
脑源性神经营养因子在炎性疼痛和神经病理性疼痛的产生机制中起了重要的作用,其在切割疼痛中的作用我们以前的研究也有重要的发现。
值得注意的是,除了脑源性神经营养因子之外,其前体PROBDNF也能顺行转运,并可能有重要的生理功能[17]。
ProBDNF是BDNF的一种存在方式,ProBDNF是否有生理功能仍然有争议。
Matsumoto等[18]认为ProBDNF是一种暂时的合成介质,作为一种细胞外配体的未必有生理功能。
Yang[19]提供的一些数据显示ProBDNF能被细胞分泌并且作为配体起作用调节神经元功能。
前面的免疫荧光实验发现切割后一小时背根神经节PROBDNF的表达明显增加,而在脊髓其表达不增加,说明PROBDNF是在中枢水平之前就发挥了生物学功效。
腹腔注射PROBDNF对大鼠切割疼痛有明显的抑制作用,而鞘内注射效果不明显。
在另一方面这个结果又从行为学方面证明了我们上面的推测。
既然已经证明PROBDNF是在脊髓水平之前发挥其生物学功效,那么到底是在局部组织还是在背根神经节产生的呢?
足底注射PROBDNF的实验结果提示足底注射PROBDNF并没有明显的止痛作用,说明局部组织并没有PROBDNF的产生,所以我们推测PROBDNF是由背根神经节神经元细胞分泌,在转运至脊髓之前已经转变为成体BDNF或者与其受体结合。
其对切割疼痛具体的机制尚需要进一步的实验证明。
我们的研究发现腹腔注射PROBDNF对大鼠切割疼痛有明显的止痛作用,而且30mg/kg和10mg/kg的用量止痛作用远远大于3mg/kg,但是30mg/kg和10mg/kg两者比较没有统计学区别,说明PROBDNF的止痛作用有其封顶效应,其对切割疼痛的抑制作用只能部分抑制,证明PROBDNF的产生只是切割疼痛产生机制的一部分。
综上所述,PROBDNF是由背根神经节神经元细胞分泌,在转运至脊髓之前已经转变为成体BDNF或者与其受体结合。
腹腔注射PROBDNF具有明显的止痛效果,并且其止痛作用有封顶效应,证明PROBDNF的产生只是切割疼痛产生机制的一部分。
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