沉淀蛋白质的常用方法.docx
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沉淀蛋白质的常用方法.docx
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沉淀蛋白质的常用方法
沉淀蛋白质的常用方法(TCA、乙醇、丙酮沉淀蛋白操作步骤)
TCA-DOC
Forprecipitationofverylowproteinconcentration
1)Toonevolumeofproteinsolution,add1/100vol.of2%DOC(Nadeoxycholate,detergent).
2)Vortexandletsitfor30minat4oC.
3)Add1/10ofTrichloroaceticacid(TCA)100%vortexandletsitONat4oC(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintain indarkbottleatcareful,usegloves!
!
!
).
4)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).[OPTION:
Washpellettwicewithonevolumeofcoldacetone(acetonekeepat–20oC).Vortexandrepelletsamples5minatfullspeedbetweenwashes].
5)Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryair.ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
NormalTCA
ToeliminateTCAsolubleinterferencesandproteinconcentration
1)ToasampleofproteinsolutionaddTrichloroaceticacid(TCA)100%toget13%finalconcentration.Mixandkeep5min–20oCandthen15min4oC;orlongertimeat4oCwithoutthe–20oCstepforlowerproteinconcentration.Suggestion:
leaveONiftheproteinconcentrationisverylow.
(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintain indarkbottleatcareful,usegloves!
!
!
).
2)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
3)ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
AcetonePrecipitation
Toeliminateacetonesolubleinterferencesandproteinconcentration
1)Addto1volumeofproteinsolution4volumesofcoldacetone.Mixandkeepatleast20min–20oC.(Suggestion:
leaveONiftheproteinconcentrationisverylow).
2)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
3)Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.
EthanolPrecipitation
UsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidineHydrochloridebeforePAGE-SDS
1)Addto1volumeofproteinsolution9volumesofcoldEthanol100%.Mixandkeepatleast–20oC.(Suggestion:
leaveON).
2)Spin15min4oCinmicrocentrifugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
3)Washpellet with90%coldethanol(keepat–20oC).Vortexandrepelletsamples5minatfullspeed.
4)Drysamplesundervaccum(speedvac)ordryairtoeliminateanyethanolresidue(smelltubes).ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.
TCA-DOC/Acetone
UsefulmethodtoconcentrateproteinsandremoveacetoneandTCAsolubleinterferences
1.Toonevolumeofproteinsolutionadd2%Nadeoxycholate(DOC)to%final(for100μlsample,add1μl2%DOC).
2.Mixandkeepatroomtemperatureforatleast15min.
3.100%trichloroaceticacid(TCA)toget10%finalconcentration(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintain indarkbottleatcareful,usegloves!
!
!
).
4.Mixandkeepatroomtemperatureforatleast1hour.
5.Spinat4oCfor10min,removesupernatantandretainthepellet.Drytubebyinversionontissuepaper.
6.Add200μloficecoldacetonetoTCApellet.
7.Mixandkeeponiceforatleast15min.
8.Spinat4oCfor10mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.
9.Removesupernatantasbefore(5),dryairpellettoeliminateanyacetoneresidue(smelltubes).ForPAGE-SDS,resuspendsamplesinaminimalvolumeofsamplebuffer.
10.(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
AcidifiedAcetone/Methanol
UsefulmethodtoremoveacetoneandmethanolsolubleinterferenceslikeSDSbeforeIEF
1)Prepareacidifiedacetone:
120mlacetone+10μlHCl(1mMfinalconcentration).
2)Prepareprecipitationreagent:
Mixequalvolumesofacidifiedacetoneandmethanolandkeepat-20oC.
3)Toonevolumeofproteinsolutionadd4volumesofcoldprecipitationreagent.MixandkeepONat-20oC.
4)Spin15min4oCinmicrofugeatmaximumspeed(15000g).Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissuepaper(pelletmaybedifficulttosee).
5)Drysamplesundervaccum(speed-vac)ordryairtoeliminateanyacetoneormethanolresidue(smelltubes).
TCA-EthanolPrecipitation
UsefulmethodtoconcentrateproteinsandremovalofGuanidineHydrochloridebeforePAGE-SDS
1)Dilute10-25μlsamplesto100μlwithH2O
Add100μlof20%trichloroaceticacid(TCA)andmix(preparationof100%TCA:
454mlH2O/kgTCA.Maintain indarkbottleatcareful,usegloves!
!
!
).
2)Leaveinicefor20min.Spinat4oCfor15mininmicrocentrifugeatmaximumspeed.
3)Carefullydischargesupernatantandretainthepellet:
drytubebyinversionontissue(pelletmaybedifficulttosee).
4)Washpelletwith100μlice-coldethanol,dryandresuspendinsamplebuffer.
5)IncasetherearetracesofGuHClpresent,samplesshouldbeloadedimmediatelyafterboilingfor7minat95°C
6)(ThepresenceofsomeTCAcangiveayellowcolourasaconsequenceoftheacidificationofthesamplebuffer;titratewith1NNaOHor1MTrisHCltoobtainthenormalbluesamplebuffercolour.)
PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichmentKit-PIERCE
ThePAGEprepKitenablesremovalofmanychemicalsthatinterferewithSDS-PAGEanalysis:
guanidine,ammoniumsulfate,othercommonsalts,acidsandbases,detergents,dyes,DNA,RNA,andlipids.
PIERCE:
#26800-PAGEprepTMProteinClean-upandEnrichmentKit (pdf)
ChloroformMethanolPrecipitation
UsefulmethodforRemovalofsaltanddetergents
1)Tosampleofstartingvolume100ul
2)Add400ulmethanol
3)Vortexwell
4)Add100ulchloroform
5)Vortex
6)Add300ulH2O
7)Vortex
8)Spin1minute@14,0000g
9)Removetopaqueouslayer(proteinisbetweenlayers)
10)Add400ulmethanol
11)Vortex
12)Spin2minutes@14,000g
13)RemoveasmuchMeOHaspossiblewithoutdisturbingpellet
14)Speed-Vactodryness
15)Bringupin2XsamplebufferforPAGE
Reference:
Wessel,D.andFlugge,U.I.Anal.Biochem.(1984)138,141-143
蛋白质浓缩——方法很全113 0
徐炉李2011-05-2814:
35
楼主
蛋白质浓缩——方法很全-丁香园论坛-医学/药学/生命科学论坛
蛋白质浓缩方法总结
一个简便的方法你可以试试:
找一透析袋,底部扎紧,袋口扎一去底的塑料或玻璃试管,将待浓缩的液体从管口灌入透析袋中,将整个装置挂在冰箱中,或者用电风扇吹,液体干后可再继续加入,直至样品浓缩至所需体积。
如必要,可事先将待浓缩液用蒸馏水或去离子水透析以去盐分,然后再按上述方法浓缩,这样可以避免浓缩后盐份过高。
此法简便易行,我们实验室常用此法浓缩。
浓缩后的液体可以用吸管从试管口吸出,而且透析袋只要不破裂,可以反复使用。
可以用millipore公司的amiconultra-15cenfilterunitetrifugalunits。
每个30多元,但是效果非常好。
只需要将培养上清加入,然后高速离心后即可直接得到无菌的浓缩液。
对于新的透析袋有化学杂质,需要处理,为了去除这些杂质,通常我们用10mmol/L的碳酸氢钠,1mmol/L的EDTA溶液煮沸30min,之后用双蒸水充分冲洗,之后放在EDTA溶液4度保存!
防止微生物污染!
!
冷冻干燥或peg20000都可以
此种方法就是超滤浓缩,使用方式有的是离心,有的是加压,有的二者皆用。
除了amicon之外,我知道赛多利斯也是很有名的供应厂家,就是做天平很出名的那家德国公司。
超滤浓缩这种方式的确太方便了,而且除了有浓缩作用外,还有脱盐功能,速度又快,比传统的透析好多了,实验室用和生产用型号都能找到。
不过据介绍,不能反复用!
而且价格大家也知道了,30元左右,一般一个包装25个,100个,单个还不知道卖不卖。
根据中国国情,呵呵,我建议没经费的实验室还是不要考虑啦;如果时间不紧张,不怕花几天时间,用25元/米的透析袋一样可以达到效果。
冷冻干燥的体积当然越小越好了,如果你的蛋白很稳定那-70度应该没有什么问题的,我觉得冷冻干燥时间长,如果量不大直接用沉淀的方法浓缩就可以了。
浓缩的目的是使体积小这样快,而体积很大的话冷冻干燥慢,如果你的冷冻干燥机的真空、泵很好,那么体积大也没有关系,但是要保证你的液体的高度别超过2cm那其实也是很快的,所以关键看你样品的体积和你机器的好坏了。
可以试一下下面这个简单的办法:
直接向要浓缩的蛋白质样品中加入sephadexG25干粉,待干粉吸水后离心取上清即可,这样离子强度保持不变,又达到了浓缩的目的
我是用双蒸水进行除盐的,就是在刚开始的时候要多换几次双蒸水,一般24小时就可以了。
楼上占战友们所说的millipore的超滤离心管我本来想买的,但考虑到价格的问题就放弃了。
将样品放在透析袋中,注意留出一半的容积,(以免水将透析袋涨破)24小时后将透析袋放入20%的分子量为10000的聚乙二醇中,一般几个小时就可以了。
我买的是进口分装的PEG,感觉不错。
希望能对你有所帮助。
三氯乙酸沉淀可能会使蛋白变性的,那么再用PBS或别的缓冲液都难溶解,所以我觉得如果要想保持蛋白的活性还是别用这样的方法。
电泳样品当然可以,但是要注意你的样品用缓冲液难溶解,可以直接加电泳上样缓冲液就可以了,没有必要再用PBS溶解。
三氯乙酸沉淀后,样品要用丙酮洗,然后要吹干,然后可以重新溶解
般可以将样品放入透析袋,再将周围撒多点PEG20000,半天能够浓缩10倍以上
如果打算用PEG的话,要选择好PEG的型号,某型号透析袋透过分子量的大小,还好考虑你的目的蛋白分子量的大小。
我用过PEG2000,回收很方便。
它的熔点很低,大约只有50度。
就现在的天气,把它平铺在磁盘里,自然干燥就行了。
不建议大家选用太小分子量的Peg,要根据透析带来选择,我一般是选用透析膜能通过分子量的两倍以上的Peg,如果大家只用来做Western,用蔗糖就行了。
1)我们在做sds-page的时候,样品的浓缩是用1M的三氯乙酸,离心以后再加丙酮进行清洗,把三氯乙酸除去,如果三氯乙酸没有除干净的话,样品加了LOADINGBUFFER以后会变成黄色,不知道你有没有出现这种现象个人认为秀芬兰旁边的黑糊糊的一团东西可能是样品中的一些小分子的物质。
2)有的样品处理过程一样,但宽窄不一,原因可能是样品中的盐浓度不一致,盐浓度过高会显著影响蛋白质的电泳,使蛋白质条带明显变宽,有时还会成微笑状。
我的经验与老兄不同:
1.胶中蛋白条带宽窄不一原因是:
因为蛋白结合电荷量不同!
即所加样品中蛋白含量不同!
2.盐浓度过高不会显著影响蛋白质的电泳.我用硫酸铵分级沉淀时蛋白未透析.sds-page蛋白条带没有变化!
你可做个对照看一下!
取待浓缩样品1mL,加入100uL三氯醋酸,振荡混匀后于4oC静置30后离心(10000X10min),去除上清,沉淀中加入1mLacetone(-20oC预冷),剧烈振荡混匀后.10000rpmX5min,此步可以重复一次以保证三氯醋酸可以完全除去,最后将管子在室温放置30分钟干燥后溶解于缓冲液中电泳分析。
如果不是预冷的丙酮,可以在低温冰箱中静置10分钟即可。
看到大家在论坛上经常讨论这个问题,我也凑凑热闹!
关于TCA沉淀蛋白作为SDS-PAGE上样的准备在本论坛的贴子很多,各种各样的protocols都有,不过总结来说都是含两个方面,一是TCA沉淀,二是用丙酮洗去残留的TCA!
也许是大家做上游做的多了,对于这个不太熟悉;也许是大家提供的方案太多,仔细看都不太相同,乱了思绪,我也提提我的看法,希望能理清思绪!
TCA沉淀蛋白的方法据我所知,最早是lowry于1951年发表在JBC上的一篇题为“PROTEINMEASUREMENTWITHTHEFOLINPHENOLREAGENT”上用过的,当然这篇文章也就是著名的lowry法定量蛋白的提出篇!
随后在很多文献,包括现今新的处理蛋白的文献中也有采用,可见这个方法如何的被青睐!
具体操作方面,不管你用什么4:
1的体积比也好,还是摩尔浓度(1MTCA)也好,一般TCA的终浓度在5%-10%(W/V)都可以!
我从书上节选了这么样的一段英文,大家可以看看:
Weroutinelyprecipitatesampleswithtrichloroaceticacid(TCA)beforeSDS-PAGE.
Thisconcentratesthesamples,eliminatesagreatdealofbuffervariability,anddenaturesproteinasesandsubstratesinarapidstepthatdoesnotallowtimeforextensiveartifactualproteolysi
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- 沉淀 蛋白质 常用 方法