浅论伤寒沙门菌鞭毛素基因fljBz66的克隆表达及其多克隆抗体的制备.docx
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浅论伤寒沙门菌鞭毛素基因fljBz66的克隆表达及其多克隆抗体的制备
浅论伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66的克隆表达及其多克隆抗体的制备
【摘要】目的:
克隆表达H:
z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66,并纯化制备相应的多克隆抗体。
方法:
利用PCR技术从H:
z66阳性伤寒沙门菌基因组DNA中得到鞭毛素基因fljB:
z66,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)上并在大肠埃希菌JM109中进行表达;fljB:
z66的表达产物经Ni柱纯化后作为抗原免疫兔以制备多克隆抗体。
结果:
经PCR及序列分析证实,伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66被成功导入表达载体pET28a(+),并在大肠埃希菌JM109中获得了高效表达,以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体。
结论:
成功克隆表达了H:
z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66,并制备了相应的多克隆抗体,为今后深入研究H:
z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制奠定了基础。
【关键词】伤寒沙门菌;fljB:
z66;多克隆抗体
[Abstract]Objective:
TocloneandexpresstheflagellingenefljB:
z66ofH:
z66positiveSalmonellaentericaseroverTyphi,andpreparetheantiz66polyclonal:
SpecificprimersweredesignedtoamplifytheflagellingenefljB:
z66fromthechromosomeDNAofH:
z66positiveSalmonellaentericaseroverTyphi ampliconwasinsertedintotheexpressionvectorpET28a(+),whichwasthentransferredto JM109tobe recombinantproteinFljBHis6waspurifiedwithNiTEDpackedcolumnandwasusedasimmunogentopreparethepolyclonal:
PCRandsequencinganalysisdemonstratedthattheflagellingenefljB:
z66ofH:
z66positiveSalmonellaentericaseroverTyphiwasinsertedintothevectorpET28a(+)andwasexpressedhighlyin rabbitantiz66polyclonalantibodywasprepared:
ThisstudywasafoundationtoresearchthemechanismunderlyingthetheunidirectionalflagellarphasevariationofH:
z66positiveSalmonellaentericaseroverTyphi.
[Keywords]SalmonellaentericaseroverTyphi;fljB:
z66;polyclonalantibody
伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphi)是沙门菌属中一种重要的人类肠道致病菌。
鞭毛(flagella)是细菌的动力装置,也是沙门菌的一种重要毒性因子[1]。
沙门菌鞭毛可分为基体、弯钩和细丝三部分。
基体部被包埋在细菌内外膜中,有中央小管。
细丝部在菌体外侧通过弯钩部和基体部相连,主要由一种称之为鞭毛素(flagellin)的蛋白质构成。
大多数的鞭毛抗原血清型如鼠伤寒沙门菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)有两种不同的鞭毛素编码基因,位于染色体不同部位,称之为两相菌株(biphasicstrain),常以fliC和fljB表示其一、二相鞭毛素基因。
1981年Guinee等在伤寒沙门菌中发现一种新的z66鞭毛抗原。
2004年Huang等发现伤寒沙门菌z66抗原的编码基因具有二相鞭毛素基因的结构特征,即存在fljBA样基因簇结构。
H:
z66阳性伤寒沙门菌只能从z66抗原表达转为d或j抗原表达,为单向不可逆变化。
最近研究表明,z66抗原的编码基因位于一罕见的线性质粒中,而且这种单向相变换是与缺失了线性质粒含fljBA的kb末端区域有关[5,6],但造成这种缺失的机制尚不明确。
我们推测鞭毛与相应的抗体结合后,可以启动胞内一系列基因表达调节,最终通过某些关键基因的表达改变,致线性质粒缺失含fljBA的部分结构而实现鞭毛表达的相变换。
本研究旨在克隆表达H:
z66阳性伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66,并制备其相应的多克隆抗体,为深入研究H:
z66阳性伤寒沙门菌的单向相变换机制提供必要的条件。
1材料和方法
材料
菌种和质粒野生型伤寒沙门菌GIFU10007,JM109(DE3)、质粒pET28a(+)、一相鞭毛素伤寒沙门菌Ty2均由本室保存。
主要试剂和仪器DNA聚合酶pfu、限制性核酸内切酶BamHⅠ,XhoⅠ和T4DNA连接酶购自宝生物工程有限公司(大连,TaKaRa);IPTG,dNTP和DNA胶回收试剂盒购于Promega公司;其他试剂均为进口或国产分析纯。
核酸紫外检测仪(EppendorfBiophotometer),PCR仪(ABI2700),凝胶成像系统(GeneGeniusBIOIMAGINGSYSTEM),蛋白电泳仪(Biorad),离心机,超声破碎仪。
实验动物新西兰大白兔2只,由江苏大学实验动物中心提供。
方法
伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66的获得根据从基因库中检索到的fljB:
z66基因序列,利用引物设计软件设计了上、下游引物PfljB:
z66A和PfljB:
z66B,并分别在5′端添加BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点序列。
PfljB:
z66A:
GCGGATCCATGGCACAAGTCATTAATAC(下划线为BamHⅠ酶切位点)
PfljB:
z66B:
AACTCGAGACGCAGCAGAGACAGTAC(下划线为XhoⅠ酶切位点)。
挑取GIFU10007菌落,加1ml超纯水,沸水浴10min后离心,上清液中即含基因组,以此作为模板,以fljB:
z66基因上、下游引物PfljB:
z66A和PfljB:
z66B为引物,用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因,并用1%琼脂糖凝胶电泳观察扩增产物。
重组载体的构建与鉴定用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物,BamHⅠ和XhoⅠ同时双酶切PCR回收产物和表达载体pET28a(+),酶切产物用酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后,用T4DNA连接酶16℃过夜连接。
连接产物用热激法转化至大肠埃希菌DH5α。
挑取若干连接产物转化菌单菌落,分别划线接种于加有氨苄西林的LB平板上,37℃培养6h后,收集上述菌体和空载体转化菌体于30μl纯净水中,震荡混匀后加等体积的酚/氯仿抽提、离心,上清10μl上样,%琼脂糖凝胶电泳观察质粒大小,筛选阳性克隆质粒。
提取阳性克隆质粒,采用双酶切和PCR方法鉴定阳性克隆,再通过DNA序列分析以最终确认(序列分析由上海生工生物工程技术服务有限公司完成)。
阳性克隆质粒热激法转化至大肠埃希菌JM109,具体方法参考文献。
大肠埃希菌表达fljB:
z66条件的优化挑取新鲜的含重组质粒pET28a(+)fljB:
z66的大肠埃希菌JM109单菌落及含空质粒pET28a的对照大肠埃希菌JM109单菌落分别置于1mlLB培养液中(氨苄西林100μg/ml),37℃振摇过夜,次日将饱和菌液以1∶100稀释度加入4mlLB培养液中37℃振摇2~3h后至D(600nm)为~,加入IPTG至终浓度分别为,,1mmol/L,分别于30℃和37℃继续振摇4h进行诱导后,10000r/min离心5min,沉淀悬于100μlTE溶液中4℃超声破碎后离心(12000r/min,15min),收集上清液进行SDSPAGE。
表达蛋白的纯化在上述表达的优化条件下200ml菌体培养液离心收集菌体,用PBS()洗涤2次,按照每克菌(湿重)加入10ml过柱缓冲液(20mmol/LTrisHCl,;200mmol/LNaCl;1mmol/LEDTA)的比例重悬菌体,超声破碎后离心(4℃,12000r/min,30min)收集上清液(粗提物)。
用过柱缓冲液稀释粗提物至10mg/ml的浓度,以1ml/min流速上样稀释的粗提物于Ni柱中。
用12倍柱床体积的过柱缓冲液冲洗柱,移除未结合的蛋白;用洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。
EP管收集洗脱液,每管1ml,共收集10管,用紫外分光光度计检测各管在280nm处的光密度。
取收集的各管纯化上清10μl加等体积的2×样品缓冲液,沸水浴10min,进行SDSPAGE。
兔抗Z66多克隆抗体的制备合并收集的纯化上清,经PBS透析后,用等体积弗氏完全佐剂乳化,按每只兔50μg抗原剂量,1ml每只,背部皮下多点注射,同时肌肉注射百日咳疫苗ml。
之后,每隔2周用弗氏不完全佐剂与抗原溶液以1∶1比例乳化,剂量减半加强免疫一次,共加强4次,末次免疫2周后颈动脉放血制备抗血清。
抗血清通过硫酸铵盐析再经透析除盐等步骤制备初步纯化的兔抗Z66多克隆抗体,分装后-20℃保存备用。
ELISA测定抗体的效价,抗体与野生型伤寒沙门菌GIFU10007全菌蛋白进行Westernblotting以检测抗体的特异性。
2结果
伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66的表达载体的构建
以GIFU10007为模板,PCR扩增获得了与预期大小相符的1467bp的DNA片段。
将该片段用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆到表达载体pET28a(+)上,转化至大肠埃希菌DH5α,得到转化子,所携带的质粒命名为pET28a(+)fljB:
z66。
提取该质粒,经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切可以得到约1467bp的外源片段,大小与PCR产物一致(图1),这说明表达载体pET28(a)上成功地连接上长约1467bp的fljB:
z66基因。
重组蛋白的表达与纯化
伤寒沙门菌鞭毛素基因fljB:
z66在大肠埃希菌JM109中实现了表达,在不同温度和不同浓度的IPTG诱导下,蛋白表达量有一定的差异。
在最佳的条件即37℃,IPTG终浓度为1mmol/L进行诱导4h,表达的蛋白主要在上清中,上清经Ni柱纯化获得FljBHis6,结果见图2,第7泳道即为纯化的FljBHis6。
M:
低相对分子质量标准蛋白;1:
空菌全菌蛋白;2:
空质粒转化子全菌蛋白;3:
重组表达菌全菌蛋白;4:
重组表达菌包涵体;5:
重组表达菌上清;6:
Ni柱纯化FljBHis6的穿梭液;7:
Ni柱纯化FljBHis6
图2FljBHis6蛋白表达及纯化的SDSPAGE
Fig2SDSPAGEanalysisofFljBHis6protein
expressionandpurifucation
兔抗z66多克隆抗体的制备
将经Ni柱纯化的FljBHis6免疫兔制备兔抗z66多克隆抗体,ELISA测定纯化后的抗体效价为1∶20000,Westernblotting显示纯化后的抗体与抗原反应的特异性良好(图3)。
3讨论
沙门菌的鞭毛素蛋白单体多为50~60ku,多肽中央约100个氨基酸残基的区域具有高度可变性,空间结构位于细丝外表,为鞭毛(H)抗原的决定区。
血清学检查已发现有近100种不同的沙门菌H抗原,被命名为a至z和z1至zN。
据H抗原和菌体(O)抗原特性,已有2200多种沙门菌的血清型被发现。
大多数的血清型为两相菌株,如鼠伤寒沙门菌,在二相鞭毛素基因fljB下游紧邻的fljA是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因,fljA可在转录后水平上抑制FliC的表达;在fljBA的上游,存在一特殊的巨型发夹样结构(hix)包括了fljBA的部分启动区域;发夹样结构中还有一编码重组酶(recombinase)的hin基因,Hin可帮助调节该发夹环部结构的方向,从而影响fljBA启动区域方向的正确性,如“开关”样控制fljBA的表达,因而在任何时候只有一种鞭毛素蛋白得以表达。
我们的研究表明H:
z66阳性伤寒沙门菌是一特殊两相沙门菌,在二相鞭毛素基因fljB:
z66下游紧邻着一fljA样基因。
最近我们证实了fljA样基因也是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因[10]。
H:
z66阳性伤寒沙门菌在抗H:
z66鞭毛抗体诱导下能发生从fljB:
z66到fliC:
d/j的单向性鞭毛相变换,这种单向不可逆变化被证实是由于缺失了线性质粒含fljBA的kb末端区域有关,但造成这种缺失的机制至今尚不明确。
最近的研究表明鞭毛可作为鼠伤寒沙门菌的外部特殊感受器,感受环境湿度和温度,发挥对自身鞭毛基因的表达调节作用[11,12]。
据此,我们推测伤寒沙门菌的鞭毛可作为一种特殊的外部感受器,与相应的抗体结合后,介导胞内一系列基因表达调节,实现这种单向性鞭毛相变换。
为了证实这种推测,我们需要体外用抗z66的抗体来诱导伤寒沙门菌的这种单向相变换,本研究通过鞭毛素基因fljB:
z66的克隆与表达获得大量鞭毛素蛋白,以此作为抗原成功制备了兔抗z66的多克隆抗体,为下一步研究奠定了基础。
【参考文献】
[1]SchmittCK,IkedaJS,DarnellSC,et ofallcomponentsoftheflagellarexportandsynthesismachinerydifferentiallyaltersvirulenceofSalmonellaentericaserovarTyphimuriuminmodelsoftyphoidfever,survivalinmacrophages,tissuecultureinvasiveness,andcalfenterocolitis[J].InfectImmun,2001,69(9):
5619-5625.
GuineePAM,JansenWH,MassHME,et unusualHantigen(Z66)instrainsofSalmonellatyphi[J].AnnMicrobiol,1981,132(3):
331-334.
HuangX,PhungLV,DejsirilertS,et andcharacterizationofthegeneencodingthez66antigenofSalmonellaentericaserovarTyphi[J].FEMSMicrobiolLet,2004,234
(2):
239-246.
TamuraK,SakazakiR,KuramochiS,et ofHantigenZ66ofRphaseinculturesofSalmonellaserovartyphioriginatedfromIndonesia[J].EpidemiolInfect,1988,101
(2):
311-314.
BakerS,HardyJ,SandersonKE,et novellinearplasmidmediatesflagellarvariationinSalmonellatyphi[J].PLoSPathog,2007,3(5):
e59.
BakerS,HoltK,WhiteheadS,et linearplasmidtruncationinducesunidirectionalflagellarphasechangeinH:
z66positiveSalmonellatyphi[J].MolMicrobiol,2007,66(5):
1207-1218.
周丽萍,邹昕,张伟利,等.伤寒沙门菌fljA样基因表达载体的构建[J].江苏大学学报:
医学版,2006,16(6):
461-464.
HeXS,RivkinaM,StockerBA,et regionIVofSalmonellagenefliCdencodesadominantsurfaceepitopeandastabilizingfactorforfunctionalflagella[J].JBacteriol,1994,176(8):
2406-2414.
YamamotoS,Kutsukakemediatedposttranscriptionalcontrolofphase1flagellinexpressioninflagellarphasevariationofSalmonellaentericaserovarTyphimurium[J].JBacteriol,2006,188(3):
958-967.
[10]ZouX,HuangX,XuS,et ofafljAgeneonalinearplasmidastherepressorgeneoffliCinSalmonellaentericaserovarTyphi[J].MicrobiolImmunol,2009,53(4):
191-197.
[11]WangQ,SuzukiA,MaricondaS,et wetness:
anewroleforthebacterialflagellum[J].TheEMBOJ,2005,24(11):
2034-2042.
[12]MashimoT,HashimotoM,YamaguchiS,ethypersensitivesitesoftheflagellarswitchcomponentFliGinSalmonellaentericaserovarTyphimurium[J].JBacteriol,2007,189(14):
5153-5160.
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