用16SrDNA方法鉴定细菌种属.docx
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用16SrDNA方法鉴定细菌种属
用16SrDNA方法鉴定细菌种属
一、实验目的
1。
掌握16SrDNA对细菌进行分类的原理及方法;
2.掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。
二、实验原理
细菌rRNA(核糖体RNA)按沉降系数分为3种,分别为5S、16S和23SrRNA。
16SrDNA是细菌染色体上编码16SrRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中。
16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。
包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。
是一种快速获得细菌种属信息的方法.
16SrDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟,其种类少,含量大(约占细菌RNA含量的80%),分子大小适中,存在于所有的生物中,其进化具有良好的时钟性质,在结构与功能上具有高度的保守性,素有“细菌化石”之称.在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝,5S、16S、23SrDNA的拷贝数相同。
16SrDNA由于大小适中,约1。
5Kb左右,既能体现不同菌属之间的差异,又能利用测序技术较容易地得到其序列,故被细菌学家和分类学家接受。
16SrRNA的编码基因是16SrDNA,但是要直接将16SrRNA提取出来很困难,因为易被广泛存在的RNase降解,因而利用16SrDNA鉴定细菌,其技术路线如下:
细菌基因组的提取:
PCR的基本原理:
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性——退火——延伸三个基本反应步骤构成:
①模板DNA的变性:
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板DNA与引物的退火(复性):
模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火——延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。
二、操作步骤
1、细菌基因组DNA提取;
2、PCR扩增;
3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测;
4、扩增片段回收;
5、DNA片段测序。
三、结果处理与分析
在回收扩增片段时,紫外灯下条带呈现绿色荧光,将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来,放入已称重的2ml离心管中,空的离心管为1。
02g,放入回收的凝胶后为1.42g,,则凝胶为400mg,因此加入的BindingBuffer为1200μl。
我们小组选用B116Ssequence,以下为制作进化树过程:
1、根据B116S基因序列,到NCBI上比对,确定其种属
(1)NCBI主页(http:
//www.ncbi。
nlm。
nih。
gov/)依次点击进入BLAST
(2)选择nucleotideBLAST
(3)将B1序列复制到文本,框里ChooseSearchSet处点复选按钮others,最后点BLAST
(4)点击BLAST后,数据进行提交.BLAST结果如下:
图中“Evalue”指标与其他指标不同,它的数值越小相似程度越高,其他几个(如Totlescore)都是数值越高相似度越高。
我组将数据按照Querycover从100%开始从大到小排列,从不同相似度一共选出14组数据。
(5)导出数据
数据导出格式选择FASTA:
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- 16 SrDNA 方法 鉴定 细菌 种属