玉米种子室内检验学习心得.docx
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玉米种子室内检验学习心得.docx
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玉米种子室内检验学习心得
学习心得
1、扦样分样技术
1、袋装种子扦样频率
a1-4 个容器,每个容器扦取 3 个初次样品;
b5-8 个容器,每个容器扦取 2 个初次样品;
c9-15 个容器,每个容器扦取 1 个初次样品;
d16-30 个容器,种子批中扦取 15 个初次样品;
e31-59 个容器,种子批中扦取 20 个初次样品;
f60 或更多容器,种子批中扦取 30 个初次样品。
以前扦样有时没有严格按照这个标准来取,以后取样要
严格按照标准执行。
2.制备送验样品
(1)需磨碎的种类 100g,不需磨碎的为 50g;
(2)真实性样品 100g。
3.机械分样法
混合 2-3 次,对分递减分至所需重量,每类样品要独立
分取。
4.如果发现种子异常,要进行异质性检测判定。
2、抓关键技术环节,控制影响因素
1.检验员(人)
(1)熟悉有关的法律、法规规定
对种子法还不熟悉,种子检验理论和技术还有待加强和
提高。
(2)具有良好的职业道德
爱岗敬业,诚实守信,客观公正,遵纪守法等。
2.种子生活力和种子活力
种子生活力:
种子发芽的潜在能力或种胚具有的生命力。
反映的是种子发芽率和休眠种子百分率的总合。
种子活力是指在广泛的环境条件下,决定可接受发芽率
的种子批的活性和性能那些特性的综合表现。
与种子田间
出苗质量密切相关。
3.发芽结果计算与表示
当重复正常幼苗百分率都在容许差距范围内,则取其平
均数;当重复间超过容许差距时,要重新试验。
4.发芽试验数据修约
a)先将正常幼苗百分率修约至最接近的整数,0.5 进位,
并与其余部分(不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子)
百分率整数部分的数值相加。
如果总和为 100,则修约程序
结束。
b) 执行 a)程序后的总和不是 100,则在不正常幼苗、硬实、
新鲜种子和死种子百分率中找出小数部分最大数值者,将
此修约至整数,并作为最终结果。
并与其余部分百分率整
数部分的数值相加。
如果其总和为 100,则修约程序结束。
c)执行 b)程序后的总和不是 100,继续重复执行 b)程序,
直至获得总和为 100。
d)执行 b)和 c)程序时,凡小数部分均相同的,按照下列顺
序优先进行修约:
不正常幼苗、硬实、新鲜种子和死种子。
5. 发芽试验重复间和重复试验间超差的处理:
(1)假如四次重复间最高和最低值的差距在容许误差范围
内,该发芽试验的结果是可靠的。
将各重复的平均数修约
成最接近的整数,查容许误差表,如重复间的最大差异小
于规定的容许误差,则认为结果是可信的。
容许误差至少
适用于正常幼苗种类。
(2)当重复间的差距超过表中最大容许误差时,应采用同
样的方法重新试验。
如果第二次结果与第一次结果相符合,
即其差异不超过表中规定的容许误差,则填报两次试验的
平均数。
(3)如果第二次结果与第一次结果不相符,即其差异超过
表中所示容许误差,则采用同法第三次试验,如果三次试
验的结果相符合,即其差异不超规定容许误差,则填报三
次试验结果的平均数。
如果三次试验结果不相符,即其差
异超过规定容许误差,则三次试验结果进行两两比较,取
不超过容许误差的一对结果的平均值作为最后结果。
若第
三次试验仍得不到符合要求的结果,则应考虑人员操作、
仪器设备或其他反面原因。
三、实验室质量管理
1、质量法规
对《产品质量法》、《标准化法》、《种子法》、《农作物种
子标签和使用说明管理办法》等的学习有待进一步学习。
2、质量与检验
(1)从过程管理的角度来看,质量绝对不是检验出来的,
预防产生质量,检验不能产生质量;
(2)合格产品不是检验出来的,而是干出来的;
(3)检验可以发现不合格产品。
3、种子检验室质量管理
应建立相适应的有效的管理体系,形成文件,将抽样到
结果报告各环节检验活动标准化、制度化。
管理体系文件
一般包括四个层次:
《质量手册》、《程序文件》、《作业指
导书》、《记录格式》。
4、试验要求
(1)若发现试验结果异常,试验人员不要轻易下结论,应
认真查记录、查计算、查操作、查试剂、查方法、查样品,
找出原因后有针对性地进行复验。
(2)要认真及时做好原始记录,要求所有的实验内容都要
有原始记录,不得漏记。
5、记录控制要求
(1)试验数据应用中性笔或钢笔在实验同时记录在原始记
载表上,不应事后抄录,也不应漏记。
试验中出现的异常
情况也应及时记录。
书写要求工整、清楚、真实、准确、
完整。
不准用铅笔记录,不得随意涂改、乱写、乱画和折
叠。
当发生笔误时,用“-”注销,并在“-”上方由本
人更正,加盖改正章。
(2)试验原始记录要按年编目成册,做好标识,归档保管。
(每年做一次整理归档)。
6、检测数据修约规则
(1)称重规定:
1g 以下保留四位小数,1~10g 保留三位
小数,10~100g 保留二位小数,100~1000g 保留一位小
数。
(2)在净度分析中,各成分之和是 99.9%或 100.1%,
从最大值(通常是净种子成分)增减 0.1%。
(3)数字修约规则:
“四舍六入五成双”法则。
(4)检测室报出数值最右的非零数字为 5 时,应在数值后
面加“( + )”或“( -)”或不加符号,以分别表明已进行
过舍进或未舍未进。
四、净度分析水分测定
1、净种子
未成熟的、瘦小的、皱缩的、带病的或发过芽的种子单
位都应作为净种子。
2、试验样品的分取
试验样品至少含有 2500 个种子单位的重量,玉米种子不
少于 900 克。
3、净度分析称重计算
(1)如果增失超过原试样重量的 5%,必须重做。
(2)如增失小于原试样重量的 5%,则计算各组分百分率。
各组分百分率的计算应以分析后各种组分的重量之和为分
母,而不用试样原来的重量。
(3)若分析的是全试样,各组分重量百分率应计算到一位
小数。
若分析的是半试样,各组分重量百分率应计算到二
位小数。
4、净度分析容许差距
实际差距容许范围内,取其平均值。
如超过,再分析一
份试样,若分析后的最高值和最低值差异没有大于容许误
差 2 倍时,填报三者的平均值。
4、净度分析容许差距
若一种组分的结果为零,须在适当空格内用“-0.0-”
表
示,若其一组分少于 0.05%,则填报“微量”。
五、玉米品种鉴定技术-SSR 标记法
1、SSR 技术特点
•多态性丰富,分辨能力强,每个位点最多可含有十多个等
位基因;
•较高重复性,针对于每个位点设计特异性引物,扩增均为
特异性目的片段扩增;
•前期研发基础强,有大量已知染色体位置的共享位点;
•为共显性标记,能准确区分不同等位变异;
•为中性变异标记;
•数据形式为具体片段长度,能够实现数据标准化;
•技术非常成熟,检测方法简便易行;
•SSR 技术易于推广,不受专利限制。
2、DNA 提取的原则
(1)保证 DNA 结构的完整性;
(2)将蛋白质、多糖、多酚等杂质降低到最低程度;
(3)排除有机溶剂和金属离子的污染;
(4)纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质;
(5)排除其他核酸分子的污染。
3、快速碱煮法
(1)碱:
在碱性环境下裂解细胞,使 DNA 变性,从而达到
提取的目的。
碱能够使 DNA 变性,且不会复性,并缠结成
网状物质析出最终加入 TE 溶液溶解。
(2)煮:
煮沸的方式能够代替液氮冷冻法,抑制 DNA 酶的
活性,防止煮沸还能够代替研磨,破坏细胞壁和细胞膜,
释放出 DNA。
4、核酸提取注意事项
•最好使用新鲜材料,低温保存的样品材料不要反复冻融
•材料应适量,过多会影响裂解,导致 DNA 量少,纯度低
5、DNA 提取量少
(1)主要原因
实验材料不佳或量少;破壁或裂解不充分;沉淀不完全;
洗涤时 DNA 丢失
(2)解决方法
尽量选用新鲜(幼嫩)的组织;样品预处理充分;适当延
长高温裂解时间;用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒;低温沉
淀,延长沉淀时间,加沉淀辅助物
6、PCR 扩增
(1)PCR,是指在 DNA 聚合酶催化下,以母链 DNA 为模
板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步
骤,体外复制出与母链模板 DNA 互补的子链 DNA 的过程。
是一项 DNA 体外合成放大技术,能快速特异地在体外扩增
任何目的 DNA。
(2)一是被扩增的 DNA 所需量极小,理论上讲一个分子
就可以用于扩增了;二是扩增效率高,几个小时就扩增
1000 万倍以上。
7、PCR 反应体系及循环条件
PCR 反应是 Taq 酶以 dNTP 为原料,以一对寡核苷酸引
物为起点,以被扩增的 DNA 序列为模板在 PCR 热循环仪中
进行的扩增反应。
标准的 PCR 过程分为三步:
1.DNA 变性(90℃-96℃):
双链 DNA 模板在热作用下,氢键断裂,形成单链 DNA。
2.退
火(25℃-65℃):
系统温度降低,引物与 DNA 模板结合,
形成局部双链。
3.延伸(70℃-75℃):
在 Taq 酶(在 72℃
左右,活性最佳)的作用下,以 dNTP 为原料,从引物的
5′→3 ′端延伸,合成与模板互补的 DNA 链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA 含量即增加一倍。
8、模板 DNA 对 PCR 反应的影响
(1)模板纯度:
蛋白、酚类、多糖等杂质会抑制 PCR 反应;
(2)模板完整性:
模板 DNA 降解会导致 PCR 无扩增产物;
(3)模板浓度:
实验表明:
在一定范围内 PCR 的产量随模
板的浓度的升高而显著升高。
模板的量与循环数要匹配,如
果循环数一定,模板的量太少,会出现阴性结果或条带很弱;
模板的量太多,则会出现条带弥散,模糊不清。
(4)PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度
(5)PCR 反应体系中引物的浓度一般为 0.1~0.5umol/L,
在此范围内,PCR 的产物量基本相同。
(6)若引物量过低会导致 PCR 产物量降低,而如果引物量
过高,则会引起碱基的错配和非特异性扩增、生成引物二
聚体,从而使目的 DNA 片断的扩增量下降。
(7)通常引物量应当 10 倍于靶序列。
此外,引物的 Tm 值
与退火温度相关,故引物的 Tm 值最好在 55~80℃的范围。
(8)高浓度 dNTP 易产生错误掺入,过高则可能不扩增;
但浓度过低,将降低反应产物的产量。
(9)PCR 中常用终浓度为 50-400μM 的 dNTP。
四种脱氧三
磷酸核苷酸的浓度应相同,如果其中任何一种的浓度明显
不同于其它几种时(偏高或偏低),就会诱发聚合酶的错误
掺入作用,降低合成速度,过早终止延伸反应。
(10)此外,dNTP 能与 Mg2+结合,使游离的 Mg2+浓度降低。
因此,dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2+浓
度。
(11)耐热 DNA 聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳
离子。
(12)反应体系中 Mg2+浓度过低,会显著降低酶的活性;
而 Mg2+浓度过高时,又使酶催化非特异性扩增增强。
(13)Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与 PCR 产物解
链的温度,从而影响扩增片度的产率。
(14)由于在 PCR 反应体系中的模板 DNA、dNTP、引物中的
磷酸基团均可与 Mg2+结合从而降低反应体系中的 Mg2+的
浓度,而耐热 DNA 聚合酶需要的是游离的 Mg2+,因此,一
般 Mg2+的加入量应比 dNTP 的总浓度高 0.2~2.5mmol/L。
(15)在不同的反应体系中模板 DNA、引物以及 dNTP 的量
各不相同,因此应根据具体的情况来确定特定 PCR 反应体
系中 Mg2+的最适浓度。
9、PCR 循环条件
①模板 DNA 的变性:
模板 DNA 经加热至 95℃左右一定时间
后,使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离,
使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;
②模板 DNA 与引物的退火(复性):
模板 DNA 经加热变性成
单链后,温度降至 60℃左右,引物与模板 DNA 单链的互补
序列配对结合;
③引物的延伸:
DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的
作用下,以 dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补
配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板 DNA 链互补
的半保留复制链。
在最后一个循环后,反应在 72℃维持 5-15 分钟。
使引
物延伸完全,并使单链产物退火成双链。
10、无扩增产物
(1)原因
模板含有抑制物,模板含量低;该 Buffer 对样品不合
适;引物设计不当或者引物发生降解;反应条件不适,退
火温度太高,延伸时间太短。
(2)对策
纯化模板;更换 Buffer 或者调整浓度;重新设.引物;
降低退火温度,延长延伸时间。
11、PAGE 电泳检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为 PAGE(Polyacrylamide
gel electrophoresis),是由丙烯酰胺(简称 Acr)单体和
少量交联剂甲叉双丙烯酰胺(简称 Bis)通过化学催化剂
AP(过硫酸铵)和加速剂 TEMED(四甲基乙二胺)形成的三
维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓
度。
聚丙烯酰胺凝胶具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效
应。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离,且分离效
果好。
12、注意事项
(1)在配制胶时,过硫酸铵最好现配现用,不要先配
AP(过硫酸铵)溶液,因为 AP 很容易变质。
而且过硫酸铵
固体时间过久也会失效的。
(2)电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH 值上升,
缓冲能力减弱,从而影响电泳效果。
建议经常更换电泳缓
冲液。
(3)丙烯酰胺为神经剧毒和可疑致癌物,实验过程中应穿
工作衣,戴手套并加倍小心。
13、SSR 技术在品种真实性鉴定中的应用
(1)成对比较
a)与来自农业部品种权保护的标准样品比较;
b)与已审定品种标准样品比较;
c)与模仿对象进行比较。
(2)数据库比较
a)在品种权保护中,辅助筛查申请品种的最近似品种,
代替原来由申请者自行提供。
b)在国家和各省区试中,鉴定区试品种是否与已知品种
雷同,并作为品种能否推荐审定的必要条件。
c)在种子市场打假中,鉴定市场抽检的品种仿冒了什么
已知品种。
14、纯度鉴定流程
(1)引物筛选
利用至少 10 个核心引物进行筛选和评估(杂交种取 20
粒),一方面确定该纯度问题是以自交苗、回交苗、其它类
型杂株还是遗传不稳定造成的,一方面挑选出合适的双亲
互补型引物进行下一步鉴定。
(2)样品鉴定
从待测样品中随机取样至少 100 粒种子,利用确定下
的若干引物进行进一步鉴定,并利用这些引物综合判定待
测杂交种的纯度。
如果是自交苗造成的,采用其中 1 个互补型引物即可;
如果是回交苗造成的,则应采用 2-4 个能够综合判定出
回交苗的互补型引物;
如果是其它杂株,则根据实际情况选择 1-2 个能够将杂
株鉴定出来的互补型引物;
如果是遗传不稳定,则尽量剔除一致性极差的位点,
对一致性表现较相近的引物中选择 1-2 个进行鉴定。
(3)结果表示
根据所选引物对各单株的检测结果,综合判定待测杂
交种的纯度,如果提供了父母本的话,原始记录中需要区
分自交苗(NM)和其它类型杂株(NQ,含回交苗、异品种
等造成的杂株);如果没有提供父母本的话,原始记录中只
需提供杂株(即自交苗也是杂株的一种)。
品种纯度检测结果按以下公式计算:
P(%)=
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