食品营养强化剂 低聚半乳糖标准文本食品安全国家标准.docx
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食品营养强化剂低聚半乳糖标准文本食品安全国家标准
食品安全国家标准
食品营养强化剂低聚半乳糖
11 范围
本标准适用于以乳糖为原料,经环状芽孢杆菌及GB2760批准使用的菌种生产的β-半乳糖苷酶催化水解半乳糖苷键,将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖,同时通过转移半乳糖苷的作用,将水解下来的半乳糖苷转移到乳糖分子,生成的食品营养强化剂低聚半乳糖。
12 结构式、分子式和相对分子质量
结构式
分子式
(C6H11O5)n,n为2~8。
相对分子质量
300~2000(按2007年国际相对原子质量)
13 产品分类
按形态分为:
低聚半乳糖粉
低聚半乳糖液的直接干燥产品。
低聚半乳糖液
低聚半乳糖的液体产品。
14 技术要求
感官要求:
应符合表1的规定。
表1 感官要求
项目
指标
检验方法
粉末
液体
色泽与状态
白色或微黄色粉末
淡黄色至黄色黏稠液体
取适量试样置于清洁、干燥的白瓷盘或烧杯中,在自然光线下,观察其色泽和状态,并嗅(品)其味
气味
无异味
无异味
滋味
味甜
味甜
理化指标:
应符合表2的规定。
项目
指标
检验方法
粉末
液体
低聚半乳糖含量(以干基计),w/%
≥
57
57
附录A中A.2
乳糖含量(以干基计),w/%
≤
23
23
附录A中A.3
葡萄糖含量(以干基计),w/%
≤
22
22
附录A中A.4
可溶性固形物含量,w/%
≥
—
73
附录A中A.5
水分,w/%
≤
5.0
—
GB5009.3直接干燥法a
硫酸灰分,w/%
≤
0.3
0.3
附录A中A.6
pH
—
2.8~5.5
附录A中A.7
铅(以Pb计)/(mg/kg)
≤
0.5
0.5
GB5009.12
a取样量1g,精确至±0.1mg;干燥温度和时间分别为105℃±2℃和3h。
注:
商品化的低聚半乳糖产品应以符合本标准的低聚半乳糖为原料,可添加符合质量规格标准要求的麦芽糊精、乳清蛋白粉制成的产品。
表2 理化指标
微生物指标:
应符合表3的规定。
项目
指标
检验方法
菌落总数/(CFU/g)
≤
3000
GB4789.2
大肠菌群[MPN/g(mL)]
≤
3.0
GB4789.3
霉菌/(CFU/g)
≤
50
GB4789.15
酵母菌/(CFU/g)
≤
50
GB4789.15
凝固酶阳性的葡萄球菌(1g)
不得检出
SN/T2154
沙门氏菌
未检出/25g
GB4789.4
表3 微生物指标
附 录 A
检验方法
A.1 一般规定
本标准所用试剂和水,在没有注明其他要求时,均指分析纯试剂和GB/T6682-2008中规定的三级水。
试验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品,在没有注明其他要求时,均按GB/T601、GB/T602、GB/T603的规定制备。
试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时,均指水溶液。
A.2 低聚半乳糖含量的测定
高效液相色谱双柱法
方法提要
试样用水提取后,分别利用钙型阳离子交换柱、氨基柱分离,高效液相色谱-示差检测器测定,面积归一化法进行定量。
试剂和材料
除另有说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
乙腈:
色谱纯。
半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖、低聚半乳糖五糖、低聚半乳糖六糖、低聚半乳糖七糖、低聚半乳糖八糖混合溶液(20mg/mL)。
分别称取适量的半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖、低聚半乳糖五糖、低聚半乳糖六糖标样,用适量的水溶解,配制成20mg/mL的各标准溶液。
半乳糖二糖、乳糖、异乳糖混合溶液(20mg/mL)。
称取适量的半乳糖二糖、乳糖、异乳糖标样,用适量的水溶解,配制成20mg/mL的各标准溶液。
仪器和设备
高效液相色谱仪,带示差检测器。
超声清洗器。
分析步骤
试样液的制备
称取试样1.0g,加适量的水溶解,于超声波振荡器中振荡10min,用水定容至100mL刻度,混匀,0.2μm微孔滤膜过滤,用于钙型阳离子交换柱测定;称取试样5.0g,加适量的水溶解,于超声波振荡器中振荡10min,用水定容至100mL刻度,混匀,0.2μm微孔滤膜过滤,用于氨基柱测定。
参考色谱条件
钙型阳离子交换柱参考色谱条件
钙型阳离子交换柱(6.5mm×300mm,5µm);或具有同等性能的色谱柱。
检测器温度:
40℃。
流动相流速:
0.5mL/min。
柱温:
80℃。
进样量:
20µL。
流动相:
高纯水。
氨基柱参考色谱条件
氨基柱(250mm×4.6mm,5µm);或具有同等性能的色谱柱。
流动相:
乙腈:
水=70:
30。
流动相流速:
1.0mL/min。
检测器温度:
40℃。
柱温:
35℃。
进样量:
20µL。
定性测定
按照钙型阳离子交换柱参考色谱条件(A.2.1.4.2.1)稳定好高效液相色谱,将半乳糖、葡萄糖、乳糖、低聚半乳糖三糖、低聚半乳糖四糖、低聚半乳糖五糖、低聚半乳糖六糖混合标准溶液(A.2.1.2.2),注入高效液相色谱仪中,记录不同聚合度糖的保留时间,与待测样品中组分的保留时间进行定性,面积归一化法测定各组分相对百分含量,定性色谱图参见附录B。
按照氨基柱参考色谱条件(A.2.1.4.2.2)稳定好高效液相色谱,将半乳糖二糖、乳糖、异乳糖混合标准溶液(A.2.1.2.3)注入高效液相色谱仪中,面积归一化法测定各组分相对百分含量,定性色谱图参见附录B。
结果计算
钙型阳离子交换柱,试样中组分i占总糖的相对百分比含量按照式(A.1)计算:
……………………………………(A.1)
式中:
DPi——试样中组分i占总糖的百分含量,%;
Ai——试样中组分i的峰面积;
∑Ai——试样中所有各组分的峰面积的总和。
氨基柱,试样中乳糖在总二糖中的百分比含量按照公式(A.2)计算。
……………………………………(A.2)
式中:
X乳——试样中的乳糖在总二糖中的百分含量,%;
A半——试样中的半乳二糖的峰面积;
A异——试样中的异乳糖的峰面积;
A乳——试样中的乳糖的峰面积。
试样中低聚二糖(含二糖)以上组分占总糖中的百分比含量按照公式(A.3)计算。
=100-
-
-
×
……………………………………(A.3)
式中:
Gn——试样中的低聚二糖(含二糖)以上组分占总糖中的百分含量(占干物质),%;
DP半——试样中的半乳糖在总糖中的百分含量,%;
DP葡——试样中的葡萄糖在总糖中的百分含量,%;
DP2——总二糖(半乳糖二糖、乳糖、异乳糖)在总糖中的百分含量,%。
精密度
在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的5%。
高效离子交换色谱法(仲裁法)
方法提要
用磷酸盐缓冲液提取试样中游离的低聚半乳糖和乳糖,采用半乳糖苷酶将提取液中低聚半乳糖和乳糖酶解,将提取的初始溶液和酶处理过的溶液分别用高效离子色谱仪测定。
第一步测定初始溶液中游离的半乳糖和乳糖,第二步测定从低聚半乳糖和乳糖中释放出的半乳糖总量。
利用乳糖和半乳糖的含量计算试样中低聚半乳糖的含量。
试剂和材料
除另有说明外,所有试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。
磷酸二氢钾。
三水磷酸氢二钾。
浓盐酸。
氢氧化钠。
无水醋酸钠。
乙腈:
色谱级。
半乳糖苷酶:
活性约50000U/g,来源于米曲霉的。
无水半乳糖:
纯度≥99%。
乳糖:
纯度≥99%。
磷酸盐缓冲液(0.2M,pH6.0)
分别称取22.0g磷酸二氢钾和6.0g三水磷酸氢二钾,于适量的水中溶解,用水稀释至1L,120℃高压灭菌器中灭菌30min,备用。
盐酸溶液(0.1mol/L)
吸取0.83mL浓HCl加水稀释至100mL。
氢氧化钠溶液(50%,碳酸钠杂质含量小于1%)
称取100g氢氧化钠,加100mL水,搅拌至完全溶解,静置至碳酸钠沉淀,上层液体澄清(约需10天)。
不用时密封。
氢氧化钠溶液(0.1M)
取5.4mL氢氧化钠溶液(A.2.2.2.12),加无二氧化碳的水定容至100mL。
β-半乳糖苷酶溶液(2000U/mL)
取适量半乳糖苷酶(A.2.2.2.7)混悬于磷酸盐缓冲液中,制成最终活力单位为2000U/mL的酶溶液,使用前充分振摇混悬液,酶混悬液制备后8h内使用。
乙腈溶液(20%,体积比)
取200mL乙腈(A.2.2.2.6)加水稀释定容至1L。
氢氧化钠溶液(250mmol/L)
取13.9mL氢氧化钠溶液(A.2.2.2.12),转移至1L容量瓶中,去离子水定容至刻度,使用前脱气30min。
乙酸钠溶液(1mol/L)
称取82.04g无水乙酸钠,用适量的水溶解并转移至1L容量瓶中,水定容至刻度,0.2μm滤膜过滤。
使用前脱气30min。
半乳糖标准储备液(1000mg/mL)
取一定量半乳糖在105℃烘箱中干燥4h,准确称取100mg干燥后的半乳糖,加水溶解并转移至100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
乳糖标准储备液(950mg/mL)
取一定量乳糖在105℃烘箱中干燥4h。
准确称取100mg干燥后的乳糖,加水溶解并转移至100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
注:
上述烘干后的乳糖乘以0.95即为无水乳糖重量。
葡萄糖标准储备液(1000mg/L)
称取一定量葡萄糖在105℃烘箱中干燥4h,准确称取100mg干燥后的葡萄糖,加水溶解并转移至100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
半乳糖、乳糖、葡萄糖混合工作液(100mg/L)
分别移取半乳糖、乳糖、葡萄糖的标准储备液(1000mg/L)各10.0mL,于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
仪器和设备
高效离子色谱仪:
配备脉冲安培检测器(PAD)。
色谱柱:
阴离子交换色谱柱(250mm×3mm),保护柱(50mm×3mm)。
pH计。
分析天平:
精度0.1mg。
水浴锅振荡器。
移液器:
100μL及1000μL
离心机:
在11000×g操作。
离心管:
2.0mL。
超声清洗机:
带有脱气功能。
涡旋混合器。
色谱参考条件
柱温:
30℃;
流动相:
洗脱梯度见表A.1;
表A.1梯度洗脱程序表
时间(min)
A%氢氧化钠溶液(250mmol/L)
B%醋酸钠溶液
(1mol/L)
C%水
0.00
8.0
0.0
92.0
10.00
8.0
0.0
92.0
12.00
6.0
0.0
94.0
25.00
6.0
0.0
94.0
26.00
50.0
50.0
0.0
36.00
50.0
50.0
0.0
36.50
50.0
0.0
50.0
42.00
50.0
0.0
50.0
43.00
8.0
0.0
92.0
48.00
8.0
0.0
92.0
流动相流速:
0.4mL/min;
进样量:
20μL。
分析步骤
标准溶液的制备
分别量取半乳糖、乳糖和葡萄糖混合标准工作液(A.2.2.2.21)0.5mL、1.0mL、2.0mL、
5.0mL、10.0mL置于100mL容量瓶中,用水稀释至刻度,制成系列混合标准工作溶液,见表A.2。
按照色谱条件A.2.2.4进行测定,以各组分的浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线。
表A.2半乳糖、乳糖和葡萄糖标准溶液
半乳糖(μg/mL)
乳糖(μg/mL)
葡萄糖(μg/mL)
0.50
0.475
0.50
1.00
0.95
1.00
2.00
1.90
2.00
5.00
4.95
5.00
10.00
9.50
10.00
试样液的制备
准确称取取0.1g试样(精确至0.001g),用适量的磷酸盐缓冲溶液(A.2.2.2.10)溶解并转移到100mL容量瓶中,摇匀,盐酸溶液(A.2.2.2.11)和用氢氧化钠溶液(A.2.2.2.13)调节pH至5.7~6.3之间,然后用磷酸盐缓冲溶液(A.2.2.2.10)定容至刻度,混匀。
试样液的处理
A.2.2.5.3.1乳糖和总低聚半乳糖的酶解试样的制备
吸取制备的试样液10mL(A.2.2.5.2),移入100mL容量瓶中,标记为A1,吸取1mL半乳糖苷酶溶液(A.2.2.2.14),放入A1中,用铝箔纸密闭,轻轻摇匀。
A.2.2.5.3.2乳糖和半乳糖的初始试样溶液制备
吸取1mL半乳糖苷酶溶液(A.2.2.2.14),加入100mL容量瓶中,标记为A0,在100℃水浴加热10min使酶失活,放至室温,再吸取制备的试样液10mL(A.2.2.5.2)放入A0中,用铝箔纸密闭,轻轻摇匀。
A.2.2.5.3.3试样酶解
将含有活性酶A1和失活酶A0的2个100mL容量瓶在(60±2)℃水浴中持续温和振摇30min(从混合物温度达到60℃开始计算加热时间,振摇过程中避免形成水沫或空气泡沫),然后将A0、A1两个处理溶液,用冰浴冷却至室温。
A.2.2.5.3.4向A0、A1两个100mL容量瓶中,各加入20%乙腈溶液(A.2.2.2.15)5mL,用水定容,混匀。
分别取适量上述处理后溶液至离心管中,10000×g离心10min,上层水相用0.2μm滤膜过滤。
试样测定
分别吸取离心后的试样溶液适当稀释后,稀释倍数为D,按照色谱条件(A.2.2.4)进样测定样液中的半乳糖、乳糖含量,根据标准品的保留时间进行试样中各糖组分的色谱峰的定性;根据标准工作曲线计算试样中的半乳糖、乳糖含量,试样及标准品的色谱图见附录C。
结果计算
根据色谱分析结果,按照下列公式计算初始试样A0中游离的半乳糖、乳糖含量,酶解产物A1中总半乳糖含量,最终计算出低聚半乳糖的含量。
样液A0中游离半乳糖的计算
试样A0中游离半乳糖含量以半乳糖的质量分数w1计(占干物质),数值以%表示,按式(A.4)计算:
…………………………………(A.4)
式中:
w1——试样中游离半乳糖的含量,单位为(g/100g)
A1——标准曲线上查得的半乳糖的含量,单位为微克每毫升(μg/mL);
V1——试样制备定容体积(mL);
V2——试样酶解处理后定容体积(mL);
D——样液A0的稀释倍数;
m——试样质量,单位为克(g);
V3——试样酶解时取试样制备的体积(mL)。
样液A0中游离乳糖的计算
试样A0中游离乳糖含量以乳糖的质量分数w2计(占干物质),数值以%表示,按式(A.5)计算:
………………………………(A.5)
式中:
w2——试样中游离乳糖的含量,单位为(g/100g);
A2——标准曲线上查得的乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V1——试样制备定容体积(mL);
V2——试样酶解处理后定容体积(mL);
D——稀释倍数;
m——试样质量,单位为克(g);
V3——试样酶解时取试样制备的体积(mL)。
计算游离的乳糖酶解释放的半乳糖含量
试样A0中游离的乳糖水解释放的半乳糖以半乳糖的质量分数w3计(占干物质),数值以%表示,按式(A.6)计算:
…………………………………(A.6)
式中:
w3——游离的乳糖水解释放的半乳糖含量,单位为(g/100g);
1.9——折算系数。
样液A1中总半乳糖的计算
试样A1中总半乳糖含量以半乳糖的质量分数w4计(占干物质),数值以%表示,按式(A.7)计算:
………………………………(A.7)
式中:
w4——试样中总半乳糖含量含量,单位为(g/100g);
A3——标准曲线上查得的A1液中半乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V1——试样制备定容体积(mL);
V2——试样酶解处理后定容体积(mL);
D——稀释倍数;
m——试样质量,单位为克(g);
V3——试样酶解时取试样制备的体积(mL)。
样液A1中低聚半乳糖水解释放半乳糖的计算
样液A1中低聚半乳糖水解释放半乳糖的含量以半乳糖的质量分数w5计(占干物质),数值以%表示,按式(A.8)计算:
…………………………………(A.8)
式中:
w5——样液A1中低聚半乳糖水解释放半乳糖的含量(g/100g)。
试样中低聚半乳糖含量的计算
试样中低聚半乳糖的质量分数w6计(占干物质),数值以%表示,按式(A.9)计算:
…………………………………(A.9)
式中:
w6——试样中低聚半乳糖的含量,单位为(g/100g);
k——低聚半乳糖与酶解释放的半乳糖换算系数,
的推荐值为1.3559,也可按照附录D进行测定。
精密度
在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的5%。
A.3 乳糖含量的测定
高效液相色谱双柱法
分析步骤
同A.2.1.4,
结果计算
试样中乳糖的质量分数W乳计(占干物质),数值以%表示,按式(A.10)计算:
W乳=
×
……………………………………(A.10)
W乳——试样中的乳糖的含量,%;
X乳——试样中的乳糖在总二糖中的百分含量,%;
DP2——总二糖(半乳糖二糖、乳糖、异乳糖)在总糖中的百分含量,%。
精密度
在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的5%。
高效离子交换色谱法
分析步骤
吸取制备的试样液10mL(A.2.2.5.2),移入100mL容量瓶中,加水定容至100mL混匀,溶液过0.22µm滤膜过滤,适当稀释后进离子色谱仪测定,稀释倍数为D4。
结果计算
乳糖含量以乳糖的质量分数w乳计(占干物质),数值以%表示,按式(A.11)计算:
………………………………(A.11)
式中:
W乳——试样中乳糖的含量,单位为(g/100g);
A2——标准曲线上查得的乳糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V1——试样制备定容体积(mL);
D——稀释倍数;
m——试样质量,单位为克(g);
精密度
在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的5%。
A.4 葡萄糖含量的测定
高效液相色谱双柱法
分析步骤
同A.2.1.4。
结果计算
同A.2.1.6.1。
高效离子交换色谱法
分析步骤
吸取制备的试样液10mL(A.2.2.5.2),移入100mL容量瓶中,加水定容至100mL混匀,溶液过0.22um滤膜过滤,适当稀释后进离子色谱仪测定。
结果计算
葡萄糖含量以葡萄糖的质量分数w葡计(占干物质),数值以%表示,按式(A.12)计算:
………………………………(A.12)
式中:
w葡——试样中葡萄糖的含量,单位为(g/100g);
A2——标准曲线上查得的葡萄糖的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V1——试样制备定容体积(mL);
D——稀释倍数;
m——试样质量,单位为克(g);
精密度
在重复性测定条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过其算术平均值的5%。
A.5 可溶性固形物含量的测定
仪器和设备
手持糖量计
分析步骤
仪器校正
分开两面棱镜,用洁净玻璃棒取2滴重蒸蒸馏水于固定的棱镜面上,立即闭合棱镜,停留几秒钟,使试样达到棱镜温度,以重蒸蒸馏水在20℃,相当于固形物含量为零,对准光源,观察明暗分界线。
若明暗分界线不在零点,调节糖量计的调节螺母,直至明暗分界线与零点重合。
测定
清洁棱镜面并保持干燥,用玻璃棒取少量试样于固定的棱镜面上,立即闭合棱镜,停留几秒钟,使试样达到棱镜温度。
从标尺上读取固形物质量分数,再重复检测一次,每个试样至少测定二次,取算术平均值报告其结果。
A.6 硫酸灰分的测定
仪器和设备
高温炉。
试剂和材料
硫酸。
分析步骤
称取试样1g(精确至0.0001g),放入已灼烧至恒重的瓷坩埚中,在电炉上缓缓灼烧至完全炭化,冷却至室温。
加入0.5mL硫酸使湿润,低温加热至硫酸蒸汽出尽。
然后移入高温炉中800℃±25℃灼烧至恒重。
结果计算
灼烧残渣以质量分数w8计,数值以%表示,按公式(A.13)计算:
…………………………………(A.13)
式中:
w8——试样中的硫酸灰分的质量分数,数值以%表示;
m5——灼烧后瓷坩埚与残渣质量,单位为克(g);
m6——空坩埚质量,单位为克(g);
m4——试样与空坩埚质量,单位为克(g)。
实验结果以平行测定结果的算术平均值为准。
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值与算术平均值的比值不大于1%。
A.7 pH的测定
仪器
酸度计:
精度0.01pH,备有玻璃电极和甘汞电极(或复合电极)。
分析步骤
按仪器使用说明书调试和校正酸度计。
用新煮沸冷却的中性蒸馏水配制30%的低聚半乳糖液待测液。
然后,用水冲洗电极探头,用滤纸轻轻吸干,将电极插入待测样液中,调节温度调节器,使仪器指示温度与溶液温度相同,稳定后读数。
所得结果表示至一位小数。
附 录 B
(资料性附录)
双柱法测定低聚半乳糖的谱图
图B.1钙型阳离子交换柱测定低聚半乳糖的色谱图
图B.2氨基柱测定低聚半乳糖的色谱图
附 录 C
(资料性附录)
高效离子交换色谱法测定低聚半乳糖的谱图
图C.1高效离子交换色谱法测定半乳糖、葡萄糖和乳糖的色谱图
图C.2高效离子交换色谱法测定样品酶解的色谱图
图C.3高效离子交换色谱法测定灭活样品的色谱图
附 录 D
(资料性附录)
低聚半乳糖中半乳糖平均分子数测定方法
D.1 方法提要
试样用水提取后,分别利用钙型阳离子交换柱、氨基柱分离,高效液相色谱-示差检测器测定,面积归一化法进行定量测定,计算低聚半乳糖中半乳糖平均分子数,然后按照公式计算k值。
D.2 试剂和材料
同A.2.1.2。
D.3 仪器和设备
同A.2.1.3。
D.4 分析步骤
同A.2.1.4。
D.5 参考色谱条件
同A.2.1.4.2。
D.6 定性测定
同A.2.1.6。
D.7 试样测定
同A.2.2.5.4。
D.8 结果计算
钙型阳离子交换柱测定组分的计算
试样中组分i占总糖的相对百分比按照式(D.1)计算。
…………………………………………(D.1)
式中:
DPi——试样中组分
占总糖的百分含量,%;
Ai——试样中组分
的峰面积;
∑Ai——试样中所有各组分的峰面积的总和。
氨基柱测定组分计算
试样中低聚二糖在总二糖中的百分比含量按照式(D.2)计算。
…
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