水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选生理学研究及配合力分析廖泳祥.docx
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水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选生理学研究及配合力分析廖泳祥
分类号S511.01学号S2*******
四川农业大学
硕士学位论文
水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选、生理学研究及配合力分析
廖泳祥
指导教师吴先军教授
学科专业作物遗传育种
研究方向水稻遗传育种
2009年6月
SichuanAgriculturalUniversity
AThesisSubmittedfortheMasterDegree
StudiesonScreeningofIdentificationMethod,PhysiologicalCharacteristicsandCombiningAbilityAnalysisofPre-harvestSproutingToleranceinRice
ByYongxiangLiao
DirectedbyProf.XianjunWu
In
SichuanAgriculturalUniversity
Ya’an,Sichuan,P.R.China,625014
Jun,2009
论文独创性声明
本人郑重声明:
所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。
尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:
年月日
关于论文使用授权的声明
本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定,即:
学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
研究生签名:
年月日
导师签名:
年月日
目录
中文摘要I
英文摘要III
第一章作物穗发芽研究综述1
1研究方法1
2作物穗发芽生理生化机制2
2.1淀粉酶3
2.2内源赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)3
2.3穗部及籽粒特征与穗发芽5
2.4环境因素6
3作物穗发芽化学调控6
3.1外源ABA6
3.2穗萌抑制剂和穗芽克7
3.3多效唑和植物提取物8
4作物穗发芽抗性的遗传机制8
5作物穗发芽抗性的分子生物学研究9
5.1作物穗发芽抗性相关基因研究9
5.2作物穗发芽抗性分子标记10
6目的与意义11
第二章杂交水稻制种不育系穗发芽抗性鉴定方法的研究12
1材料与仪器12
1.1材料12
1.2仪器12
2方法12
2.1田间试验12
2.2穗发芽抗性鉴定13
2.3种子吸水速率测定13
2.4统计分析方法13
3结果与分析14
3.1水稻不育系(同型保持性代替)穗发芽抗性初步鉴定14
3.2鉴定方法的评价14
3.3吸水速率与穗发芽相关分析18
4讨论19
第三章水稻制种中杂交种子穗发芽生理特性研究20
1材料、药品和仪器20
1.1材料20
1.2主要试剂20
1.3主要仪器21
2试验方法21
2.1田间试验21
2.2人工雨室诱导穗发芽21
2.3淀粉酶活性测定22
2.4赤霉素和脱落酸含量测定22
2.4.1样品中激素的提取22
2.4.2激素含量测定22
3结果与分析24
3.1杂交种子成熟过程中淀粉酶活性的变化24
3.2杂交种子内源赤霉素含量和脱落酸含量的变化25
4讨论26
第四章水稻发芽敏感性配合力分析27
1材料与仪器27
1.1供试材料27
1.2主要仪器28
2试验方法28
2.1田间试验28
2.2穗发芽敏感性测定28
2.3分析方法28
3结果与分析28
3.1配合力方差分析28
3.2一般配合力和特殊配合力分析29
3.3亲本表型与一般配合力和特殊配合力关系30
3.4群体配合力方差估算30
3.5遗传率的估算31
4讨论32
参考文献:
33
致谢39
在读期间发表或撰写的论文41
中文摘要
水稻杂交种子收获前穗发芽是一个较为普遍的现象,严重影响杂交水稻种子产量和质量,制约着杂交水稻的推广。
目前,我国生产上应用的大部分不育系对穗发芽敏感性较高,收获期遇到阴雨天气极易引起穗发芽。
如何控制水稻穗发芽已经成为水稻育种中一个重要课题。
本试验对水稻穗发芽抗性鉴定方法进行筛选,探讨了杂交种子穗发芽过程中的生理特性,并对杂交水稻发芽敏感性配合力进行分析。
主要结果如下:
1.水稻穗发芽抗性鉴定方法筛选
采用3种方法,即塑料袋整穗保湿发芽、籽粒培养皿发芽和人工雨室诱导穗发芽,对冈46A、D69A等10个水稻不育系和蜀恢527配制的杂交水稻制种组合杂交种子进行穗发芽抗性鉴定。
初步鉴定出D23A和D65A等较抗穗发芽的不育系。
塑料袋整穗保湿发芽、籽粒培养皿发芽和人工雨室诱导穗发芽,均能对水稻穗发芽抗性进行评价。
相比之下,以塑料袋整穗保湿发芽更为准确、适用,适合对育种材料进行大规模鉴定。
利用籽粒培养皿发芽鉴定水稻不育系穗发芽抗性时,以授粉后15d和20d为适当的时期,以两次发芽率加权值为鉴定指标较为合适。
利用塑料袋整穗发芽鉴定不育系穗发芽抗性时,以授粉后25d、30d和35d为适当的时期,以3次整穗发芽率加权值为鉴定指标较为合适。
2.水稻制种中杂交种子穗发芽生理特性
利用易于穗发芽和不易穗发芽不育系D69A和D23A分别与蜀恢527杂交,测定杂交种子发育过程中淀粉酶和内源激素的含量变化。
制种组合D69A/蜀恢527杂交种子穗发芽率为44.84%,比D23A/蜀恢527(穗发芽率为5.59%)易于穗发芽。
授粉后15d至完熟的籽粒灌浆期,杂交种子经10d穗发芽诱导处理过程中,D69A/蜀恢527杂交种子α-淀粉酶活性和β-淀粉酶活性均明显高于D23A/蜀恢527;D69A/蜀恢527杂交种子ABA/GA含量比先上升后下降,呈抛物线趋势变化,而D23A/蜀恢527杂交种子ABA/GA含量比的变化与此相反。
由此认为,在杂交水稻制种中,杂交种子内源激素组成中GA含量优势和高水平的淀粉酶活性是穗发芽主要的生理基础。
3.杂交水稻发芽敏感性配合力分析
以穗发芽抗性不同的6个水稻不育系和5个恢复系为亲本,采用不完全双列杂交设计,以发芽指数为指标,对亲本配合力进行分析。
结果表明,蜡熟期水稻发芽敏感性受基因加性效应和非加性效应共同作用,以基因加性效应为主。
亲本发芽敏感性与一般配合力效应关系较为密切,相关系数为0.6189,呈显著正相关关系,因此可以根据亲本发芽敏感性表现选配杂交组合。
杂种F1发芽敏感性受母本的影响大于父本的影响。
水稻发芽敏感性遗传力较高,广义遗传率和狭义遗传率分别是92.75%和54.64%,可以在早代-中世代对其进行选择。
关键词:
水稻;穗发芽;鉴定方法;内源激素;淀粉酶;配合力
Abstract
Thephenomenonofpre-harvestsprouting(PHS)existswidelybeforethehybridriceharvested.Itbringsbadeffectsonseedqualityandcomercialvalueandlimitstheexploitationofhybridrice.Atpresent,themostofmalesterilelinesinseedproductionaresensitivetoPHS.Itisevenworseifmeetingtherainydaysbeforeharvesting.IthasbeenoneofthemostimportantproblemstocontrolthePHSinricebreeding.Inthisstudy,wereportedthescreeningoftheidentificationmethodsofPHStolerance,thestudyofPHSphysiologicalcharacteristicsofhybridseedsandtheanalysisofcombiningabilityofPHS.Thedetailresultsweresummarizedjustasfollows:
1.ThescreeningoftheidentificationmethodsofPHStolerance
Threemethods,theplasticsacksproutingtest,thegrainspetridishsproutingtestandartificiallyinducedsproutingtest,wereselectedtoidentifytheresistanceofPHSofthehybridseedsof10combinations.TheresultindicatedthatallthethreemethodswereabletoidentifytheresistanceofPHSinrice,buttheplasticsacksproutingtestwasthemostsimpleandreliableone.WhileusingtheplasticsacksproutingtesttoidentifyPHSresistance,thebestperiodwasin20days,25daysand30daysafterpollinationandthreetimesweightedgerminationpercentagewastheappropriateidentificationindexs.WhileusingthegrainspetridishsproutingtesttoidentifyPHSresistance,thebestperiodwasin15daysand20daysafterpollinationandtwotimesweightedgerminationpercentagewastheappropriateidentificationindexs.
2.ThestudiesofphysiologicalcharacteristicsofPHS
Twocombinations,D69A(ahigh-sproutingCMS)/R527(arestorerline)andD23A(alow-sproutingCMS)/R527,wereusedtostudythephysiologicalcharacteristicsofPHS.TheresultsindicatedthatthehybridseedsofD69A/Shuhui527thatpre-harvestsproutingpercentagewas44.84%,washigherthanthatofD23A/Shuhui527(5.59%).TheamylaseactivityofthehybridseedsofD69A/Shuhui527werehigherthanthatofD23A/Shuhui527,whileinthetreatmentofhighertemperatureandhigherhumidity.AndalsoindicatedthatABA/GAcontentratioofD69A/Shuhui527wasshownaparabolictrend,butthatofD23A/Shuhui527wasshownanti-parabolictrend.Duringlatestageofmaturity,GAcontentadvantageofendogenousABA/GAandahigherlevelofamylaseactivityingrainsmaybethemajorphysiologicalbasisofPHSintheproductionofhybridrice.
3.Analysisofcombiningabilityofsusceptibilityofpre-harvestgermination
Thecombiningabilityforsusceptibilityofpre-harvestgerminationwasstudiedwith6malesterilelinesand5restorerlinesbythemethodofp×qincompletediallelcrossdesign.Theresultsindicatedthatthesusceptibilityofpre-harvestgerminationwasaffectedbyadditiveandnon-additivegeneeffect,buttheeffectofadditivegeneswaspredominant.Thecorrelationcoefficientsbetweensusceptibilityofpre-harvestgerminationvalueofparentsandGCAeffectswas0.6189.Inotherwords,thehighersusceptibilityofpre-harvestgerminationvalueofparents,thegreatertheGCAeffectinprogenypopulation.Thesusceptibilityofpre-harvestgerminationwasinfluencedmoregreatlybyfemalethanthatofmale.Theestimatesofbroad-senseandnarrow-senesheritabilitywere92.75%and54.64%,respectively,whichindicatedthatselectionfortheresistancecouldbecarriedoutinearly-middlegenerationofthehybrids.
Keywords:
rice;pre-harvestspouting;identificationmethod;endogenoushormones;amylaseactivity;combiningability
第一章作物穗发芽研究综述
穗发芽(Pre-harvestSprouting,PHS)是指作物在收获前遇到连连阴雨或在潮湿环境下,种子在穗上发芽的现象[1]。
在水稻、玉米、小麦等禾谷类作物中均有发生,严重影响作物的产量、品质和种用价值。
据报道,日本、美国、加拿大、澳大利亚、巴西、德国等地区也时常遭受穗发芽危害。
1973年成立了国际谷物穗发芽组织委员会,至今已举办10届国际谷物穗发芽研讨会。
在水稻繁殖制种中,由于不育系的休眠性浅、种子裂颖等生物学特点,加上“九二0”的大量施用加重了穗发芽的发生。
长江流域和西南地区困扰杂交水稻种子生产的“穗芽”问题,几乎每三年一遇,曾因“穗芽”而减产10%~20%,严重时达50%以上。
据调查,平均每年杂交稻种子因穗发芽导致种子活力下降10%以上[2],严重影响杂交水稻种子质量,制约杂交水稻的推广。
如何控制水稻穗发芽早已经成为杂交水稻育种中一个重要的课题。
小麦穗发芽最为严重。
我国长江流域、西南地区、东北春麦区和北部冬麦区经常遭受穗发芽危害。
穗上发芽籽粒由于籽粒内部的α-淀粉酶活性升高,贮存物质开始降解,不仅降低了小麦产量和种用价值,而且面粉的品质也严重恶化[3]。
沈正兴等研究发现小麦穗发芽因α-淀粉酶活性上升,促使籽粒淀粉降解造成籽粒品质劣化,同时蛋白酶的水解活动使蛋白酶降解为麦谷朊和小分子氨基酸,从而导致筋力下降[4]。
同时,穗发芽还造成蛋白质酶活性、脂肪酶活性、酚氧化酶活性和过氧化氢酶活性升高,导致加工品质被破坏[5]。
另外穗发芽率高的小麦品种产量、千粒重和容重更低[6]。
据报道,1998年解放军总后勤部嫩江农场2×104hm2小麦发生严重穗发芽,受灾面积达100%,第二年因断种而必须从外地调种。
国内外研究表明,作物穗发芽抗性是一个极为复杂的生物学性状,既受遗传因子控制,同时与种子的发育程度、生理生化特性、生物学特性和环境因素均有关系。
1研究方法
小麦穗发芽抗性鉴定方法一般有三种,即整穗发芽试验、籽粒发芽试验和延期收获田间自然鉴定。
鉴定指标:
形态指标,包括基于粒色、穗型、角度、芒型等鉴定抗性的间接指标;生化指标,包括a-淀粉酶活性、胚对外源ABA的反应和面粉的沉降值等评价品种的抗性;直接用种子的发芽率或发芽指数作为品种的穗发芽抗性的表型值。
小麦发芽试验一般在开花后25d、30d和35d进行,7d后检查穗上发芽率。
籽粒发芽试验是在穗发芽抗性的敏感时期即蜡熟期取样,手工脱粒,测定种子的发芽率。
整穗发芽试验包括6种方法,即湿润室测定穗发芽、沙中测定穗发芽、发芽纸中测定穗发芽、塑料袋保湿法测定穗发芽、人工模拟降雨诱导穗发芽和纱布保湿测定穗发芽。
其中塑料袋保湿法由于对穗发芽的选择压力小,与田间的自然选择压相近,因而所测定的穗发芽率与田间穗发芽率较为一致,且简便可靠。
延期收获田间自然鉴定法就是在作物成熟后延迟收获,使其在田间自然发芽。
由于气候的不可控性,该方法重复性差。
测定α-淀粉酶活性的方法,常用的包括降落值法(FN)、3,5-二硝基水杨酸法、底物染色法(凝胶扩散法)、酶联免疫吸附测定法、和黏度参数法(RVA)等[7]。
降落值法(FN)是目前国际上测定小麦α-淀粉酶活性的常用方法,能够反映淀粉受到淀粉酶降解后其黏度下降的程度,是多种降解酶的综合反映,能够比较全面反映小麦穗发芽后的损害程度。
3,5-二硝基水杨酸法是利用3,5-二硝基水杨酸与还原糖,如葡萄糖或麦芽糖等反应后其产物的浓度与吸光值之间的线性关系来测定α-淀粉酶活性。
底物染色法,利用α-淀粉酶催化底物降解,根据产生蓝色反应产物的特性,然后直接通过目视或比色计检测颜色的深浅推测α-淀粉酶活性。
酶联免疫吸附测定法是免疫技术的一种,对收获前发生穗发芽的籽粒和含有迟熟α-淀粉酶(LMA)基因的籽粒中所合成的高等电点的α-淀粉酶同工酶的检测具有专一性,是目前批量鉴定LMA最为理想的方法。
黏度参数法,由于受穗发芽损害的小麦籽粒中α-淀粉酶活性的急剧增加,导致RVA(RapidViscoAnalyser)峰值黏度的降低,所以黏度参数变化可以反映小麦穗发芽的损害程度。
不同品种种胚对外源ABA的敏感性差异与穗发芽抗性具有密切的关系,因而可用籽粒胚对外源ABA的反应来鉴定穗发芽抗性。
总之,无论是发芽试验还是生理测定,都存在一定的误差,并且年份间和重复间也有变异,因而穗发芽抗性鉴定应根据实际条件灵活采用多个指标和多年鉴定相结合,最后对品种的穗发芽抗性作出综合评价。
2作物穗发芽生理生化机制
作物穗发芽过程是一个复杂的生理过程,它与种子的后期成熟同步,光合产物的积累与分解交错。
其影响的因素很多,主要包括淀粉酶、内源激素、穗部和籽粒性状、水分、温度等。
2.1淀粉酶
高水平α-淀粉酶活性是造成小麦穗发芽严重的主要原因之一,即种子成熟后期α-淀粉酶活性水平越高,品种越易穗发芽;相反,α-淀粉酶活性水平越低,品种越抗穗发芽[2,4,8,9,10]。
杨俊等研究了水稻穗发芽与籽粒内可溶性糖和α-淀粉酶活性间的关系,发现籽粒内可溶性糖和α-淀粉酶活性与水稻穗发芽之间密切相关,并提出可溶性糖含量可以作为穗发芽抗性的选择指标[11]。
沈正兴等研究发现α-淀粉酶与发芽率呈显著正相关。
浸润后的籽粒α-淀粉酶活性及其增量与发芽率具有极显著正相关关系,相关系数分别为0.8059**和0.8080**,说明α-淀粉酶活性的增强导致种子发芽。
淀粉酶的活化是小麦籽粒品质下降的主要原因,劣化的程度取决于促使淀粉降解的α-淀粉酶活性[4]。
陶龙兴研究水稻穗发芽生理特性发现,β-淀粉酶活性高于α-淀粉酶活性[2],且证实β-淀粉酶也具有降解淀粉的功能[12]。
但廖宇静等研究发现,种子萌动前期β-淀粉酶活性的增长速度快于α-淀粉酶。
抑制穗发芽,应首选抑制β-淀粉酶活性,从而抑制种子萌动[13]。
这也似乎说明了β-淀粉酶在种子萌发的过程中也很重要。
由于前人利用浸润的种子和发芽种子测定其α-淀粉酶活性,所以不能反映穗发芽发生的真实情况。
目前的研究结果表明在小麦籽粒形成过程中伴随着营养物质的积累,α-淀粉酶也随之合成,不过未成熟的籽粒与成熟籽粒中的α-淀粉酶种类和分布位置不同。
Marchylo[14]等用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析5个小麦栽培品种未成熟籽粒和成熟籽粒中α-淀粉酶同工酶,发现至少有22种,并将这些同工酶分成3组,即GI组、GII组和GIII组。
GI组位于PI值较低的区域,GII介与两组之间。
GIII位于PI值较高区域。
同时观察到GI组主要存在于未成熟籽粒的外果皮、种皮和胚乳,糊粉层中有少量存在,这组同工酶对淀粉的分解能力弱。
GIII组主要存在于邻近成熟籽粒的胚乳和发芽的籽粒中,少部分存在于种皮和盾片中,果皮和胚中也有少量存在,这组同工酶对淀粉的分解能力较强,约占籽粒发芽时α-淀粉酶活性的84%。
GII组同工酶强度很弱,主要存在于胚乳和糊粉层中。
2.2内源赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)
植物内源激素对植物生长发育起重要的调控作用,通过研究内源激素动态变化可以反映植株发育状况。
研究表明,种子内源GA和ABA对种子穗发芽具有重要作用。
种子萌发时,胚中产生的GA诱导糊粉层细胞合成水解酶(主要是淀粉酶),以水解胚乳中的贮存物质,为种子萌发提供能量和底物,这一过程称为糊粉细胞内的GA响应事件[15]。
GA能够促进胚乳中储藏物代谢,可以解除种子休眠,从而诱导种子萌发,而ABA的作用正好相反。
GA和ABA在种子萌发过程中相互作用。
ABA可以直接干预GA的合成而抑制萌发,如ABA抑制SbGA-20ox基因的表达[16]。
GA可以促进水解酶的合成,而ABA则起抑制作用。
在小麦籽粒内,具有生物活性的GA主要包括低极性的GA9、GA15
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