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肽核酸的研究进展及展望
肽核酸的研究进展及展望
2004-11-04
肽核酸的研究进展及展望
刘娜何蕴韶
中山大学达安基因诊断中心,广东广州510080
[摘要]肽核酸(PeptideNucleicAcids,PNAs),是20世纪90年代初发现的新型DNA/RNA同类物,是一类人工合成的用蛋白质骨架代替核酸中的磷酸核糖骨架而形成的新型分子,由于它拥有诸多DNA/RNA不具备的优点,因此具有非常广泛的分子生物学效应,尤其在疾病的诊断和基因治疗方面有着广泛的应用前景。
本文就PNA寡聚体的结构、与核酸杂交的特点及杂交模式,分子生物学效应,合成以及应用等方面予以综述。
[关键词]肽核酸;反义;基因诊断
自从1991年丹麦Nielsen设计并合成了肽核酸(PNA)以来,因为其对核酸结合的高度特异性和高度亲和力而备受关注。
成为继寡核苷酸(oligodeolynucleotides,ODNs)以来更为有效而稳定的反义,抗基因靶向性制剂。
在基因诊断、基因治疗、端粒酶活性的抑制等各个分子生物学领域都得到了广泛的应用,在基因调节药物研究方面也显示了强大的潜力。
1PNA寡聚物的结构和分子生物学特性
PNA是以电中性的肽链酰胺2-氨乙基甘氨酸组成的多聚酰胺键取代了DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架而形成的类似核苷酸的物质,每个碱基通过亚甲羰基接头(linker)与甘氨酸碳原子相连形成与靶核酸杂交所需的序列[1]。
PNA的书写方式是从5′端至3′端,像传统的DNA序列那样,PNA寡聚体的氨基末端(NH2)相当于DNA的5′端,PNA寡聚体的羧基末端(COOH)相当于DNA的3′末端。
尽管PNA单体也具有一个游离的氮末端和一个游离的碳末端,但严格说来它既非肽又非酸,仅仅具有一个拟肽骨架,因而化学上和蛋白质(肽)更为接近。
它与DNA的相同之处在于PNA也携带ATCG四种碱基单体,这就保证了PNA能够按照碱基互补的原则识别相应的碱基序列。
与DNA不同的是它没有磷酸戊糖骨架,因在结构上与传统的寡核苷酸有所不同,故其与寡核苷酸相比,PNA寡聚体具有独特的特性:
PNA寡聚体具有较好的热稳定性、较高的结合亲合力及不依赖于盐浓度的特殊性。
它们不被目前已知的任何核酸酶或蛋白酶所降解[2,3]。
PNA寡聚体的优越的特性还在于它们形成三链体的能力及诱导双链核酸分子产生链置换的能力[4]。
而且,PNA与相应的DNA、mRNA的转录及翻译的启动位点结合后,可以抑制相应的转录及翻译过程。
这些特性使PNA在反义药物的研究设计上有潜在的应用价值。
2PNA与核酸杂交的特点及杂交模式
2.1PNA与核酸杂交特点
由于PNA的电中性骨架,其分子中不含磷酸基团,因此PNA链更容易和带有负电荷的互补序列的DNA或RNA链结合[2]。
而且形成的复合物分子较之DNA/DNA双链或DNA/RNA杂交链更为稳定[1,3,4]。
有报道证实[4],在同样的杂交条件下,同样序列的15mer的DNA/DNA双链的Tm值是53.3℃,DNA/RNA为50.6℃,而相应的PNA/DNA的Tm值为69.5℃,PNA/RNA更高,为72.3℃。
即PNA/DNA,PNA/RNA与同样序列的DNA/DNA,DNA/RAN双链相比,每增加一个碱基数,Tm值增加1℃。
PNA与核酸杂交不仅具有很高的亲和性,还有很高的特异性。
PNA对互补DNA的错配容忍程度比相应的DNA/DNA更低,一个15mer的PNA/DNA分子在其中间段出现一个错配碱基,其Tm值下降8℃~20℃,两个碱基错配则完全不能杂交[4,5]。
PNA的一个独特性质是以平行或反平行的方式与核酸结合[4]。
所谓平行,就是PNA的氨基末端对着寡核苷酸5′端,反平行,就是PNA的氨基末端对着寡核苷酸3′端。
PNA与DNA(或RNA)形成的双螺旋倾向于反平行结合[4],而形成的三螺旋倾向于平行结合[6]。
且两种结合方式都得到非常稳定的复合物[4]。
当一个PNA分子侵入靶DNA序列时,一条DNA链被置换[1.2],通过Watson-Crick碱基配对原则迅速而高度特异的与其互补DNA结合[4]。
此后,第二个PNA分子又与PNA/DNA双螺旋以Hoogsteen键形成非常稳定的(PNA)2/DNA三链结构,留下未结合的链呈单链状态。
PNA的这些特性引起了反义和杂交技术领域众多研究者的兴趣。
2.2PNA与DNA、RNA杂交模式
如前所述,PNA单链可以通过碱基互补配对原则与相应的DNA、RNA单链形成稳定的双链结构[4.7]。
同时,PNA多聚同源嘧啶单链在dsDNA双螺旋的外侧以Hoogsteen键的方式与互补碱基配对,形成PNA-dsDNA三链体。
2.2.1常规的PNA-dsDNA三链体模式PNA多聚同源嘧啶单链在dsDNA的双链外侧,以Hoogteen键的方式与互补的碱基配对,形成PNA-dsDNA三链体。
当PNA富含胞嘧啶时,这种结合较为稳定。
2.2.2三链侵袭(Triplexinvasion)模式这种方式形成的复合物相当稳定,而且可以有效的抑制转录活性,从而在反义核苷酸的研究上具有非常重要的意义。
这种模式通常发生在多聚同源嘧啶PNA和相应的多聚嘌呤dsDNA靶序列之间。
Nielsen等[1]在合成PNA之初就观察到他所合成的连续10个胸腺嘧啶PNA(PNA-T10)可以在DNA双螺旋内部,以Watson-Crick方式替换原靶序列dsDNA中的dT10,与靶序列的dA10相结合,形成PNA-DAN-PNA复合物的结构;另一条dT10PNA单链则在复合物外侧以Hoogsteen键的方式与复合物结合,从而形成稳定的四链体结构。
预计该反应机理是当“DNA呼吸”发生时,DNA双螺旋结构在瞬间变为单链结构,PNA利用它和DNA链的超强结合作用侵入到DNA双螺旋的内部,以类似“拉链的方式”完成侵袭反应[1]。
这一利用DNA呼吸的原理在随后的实验中被证实,当dsDNA存在负超螺旋结构而使双链打开时,PNA结合效率明显提高[8]。
而在转录过程中由于转录泡的形成而导致双链暂时打开时,PNA也更容易侵入dsDNA双螺旋内部[9]。
2.2.3双链侵袭(DuplexInvasion)模式这种结合方式常发生在多聚同源嘌呤PNA和dsDNA的同源嘧啶靶序列之间,PNA侵入到dsDNA双螺旋内部,以Watson-Crick氢键的方式和靶序列结合,形成DNA-PNA-DNA三体复合物。
当PNA中的腺嘌呤被二氨基嘌呤代替时,复合物的稳定性进一步提高。
每替换一个腺嘌呤,Tm值提高2℃~4℃[10]。
这种结合方式至少在某些负超螺旋DNA靶序列上是有效的。
2.2.4双螺旋侵袭(Doublehelixinvasion)的模式这种模式是在上种模式的基础发展而来的。
在这种模式中,dsDNA两条链上的某段序列同时作为靶片段,分别设计两条PNA探针,也称“假互补PNA”(PseudocomplementaryPNA,pcPNA)。
探针中的腺嘌呤(A)全部用二氨基嘌呤(D)取代,胸腺嘧啶(T)全部用巯基尿嘧啶(sU)取代。
这样一来,当两条含有D、sU的pcPNA与相应的dsDNA发生反应的时候,pcPNA可同时与dsDNA两条链中相应的靶序列结合,形成稳定的PNA-dsDNA-PNA复合物。
而pcPNA本身两条链间由于D和sU立体结构的位阻作用却无法结合,这就保证了pcPNA在识别靶序列的同时不会自己互补。
Lohse等[11]的实验结果证实这种结合特异而高效,估计80%以上的靶序列是考Watson-Crick键的方式与PNA结合的。
Demidov等[12]更是对这种模式的动力学过程和可能的机制进行了详尽的探讨。
与以上几种链侵袭的模式比较,这种模式显然更具有广泛的应用前景。
因为PNA不需要非得是多嘧啶不可,它可以设计成任何与靶序列互补的碱基序列。
3PNA的合成
PNA的合成目前采用固相肽核酸合成法合成PNA[5]。
此法是使用9-氟烯基甲氧碳酰(Fmoc)肽合成技术。
其中单体中的氨基主链被Fmoc保护起来,这种方法使PNA结合于肽以及象生物素或荧光染料这样的标记物上,每一合成周期大约需要30分钟,主要分为以下几个步骤:
①装柱。
与常规的将被合成的C末端氨基酸连接于固相支持物的肽合成柱有所不同,PNA合成柱仅含有聚苯乙烯固相支持物。
②洗涤。
合成开始前,用二甲苯甲酰胺(DMF)洗涤PNA合成柱。
③去封闭。
以六氢吡啶/DMF去除Fmoc保护基团。
④洗涤,通过DMF洗涤去除过量试剂。
⑤活化和偶联。
在存在二异丙基乙胺和六氟代磷酸酯混合物的情况下,将新合成的PNA单体活化偶联到固相树脂(或者偶联到延伸的PNA链上)。
⑥洗涤。
用DMF洗涤去除过剩试剂。
⑦加帽。
通过溶于二甲基吡啶/DMF中的乙酸酐将未反应基因加帽。
⑧洗涤。
以DNF洗涤去除多余试剂。
⑨将PNA产物与比例为4:
1的三氟三酸及m-甲酚混合物共同温育以进行切割和最终脱保护。
这种切割和去保护的PNA寡聚体在260nm波长下定量,通过反向液相色谱和质谱进行纯度分析及PNA产物定量。
260nm下OD值为1时,PNA产物含量相当于26μg。
4PNA应用
4.1PNA在分子生物学技术上的应用
PNA不带电荷,不会被核酸酶或蛋白酶降解,也不会与血清蛋白结合,并且PNA与DNA或RNA连结能力强、特异性很高。
PNA具有普通寡核苷酸所没有的众多特性,在分子生物学技术方面应用广泛。
①分析DNA中的点突变:
PNA与DNA或RNA链结合形成的PNA/DNA和PNA/RNA热稳定性高且对碱基错配敏感,一个碱基的错配可使Tm值大幅度下降,利用PNA此特点可以不用测序就能分析DNA序列中的点突变。
Czerny等[13]发明了一种PNA定向PCR钳技术,它不需要测序,仅用简单的一步就能发现点突变的存在。
这种技术主要用来探测DNA片段中某种已知的点突变,在Czerny设计的PCR反应体系中含有待扩增的模板DNA以及一个PNA片段和两条DNA引物。
其中,PNA与野生型DNA的5′端互补,DNA引物中一条与DNA突变型的5′端互补而另一条则是两者共有的3′端引物。
如果待扩增的DNA模板中没有发生点突变,则PNA片段与DNA模板相连,PCR反应被终止;反之,则DNA引物与DNA模板相连,PCR反应得以进行。
通过改变相应DNA引物和PNA片段,不同的点突变可以用这种方法检测出来。
②扩增较长序列的DNA:
PCR技术由于可以特异性扩增极微量的DNA片段,而在法医学、亲子鉴定和分子生物学研究中得到广泛的应用。
但是,被扩增的DNA片段中可能含有多个不规则重复序列。
这些含重复序列的基因可以在退火时发生模板链内或链间杂交从而妨碍较长序列DNA的扩增。
PNA的出现解决了这个问题。
在PCR反应体系中,加入与DNA模板中间重复序列互补的PNA片段,该PNA片段与DNA模板退火杂交,从而封闭已变性的DNA模板中的重复序列。
PNA与DNA模板退火杂交温度一般较高(78℃),在此温度下,模板中间的重复序列彼此不会杂交,当PNA封闭已变性的DNA模板中的重复序列后,降低温度使PCR引物与变性的DNA模板两端杂交(温度一般为60℃),然后升高温度(72℃)以完成PCR反应的延伸过程,与此同时将PNA与模板分离。
用此方法可以扩增出较长序列的DNA片段[14]。
③特异性切割DNA:
同源嘧啶组成的PNA可以与含有一段同源嘌呤的模板牢固结合,PNA这个特性可以使限制性内切酶只对个别位点进行特异性切割。
Veselkov等[15]合成了一段由同源嘧啶组成的PNA,然后用它去封闭DNA上一段同源嘌呤组成的序列。
在未被封闭的DNA的其它部分甲基化后,再去掉PNA片段。
因为DNA模板中的同源嘌呤部分受到了PNA的保护,所以只有此段避免了被甲基化,因此也只有此段能被限制性内切酶有效的切割。
另外,PNA可以用来从复杂的混合物中捕获特异性DNA和RNA片段,并且在捕获的效率和特异性方面比使用DNA更好。
Boffa等[16]用生物素标记的PNA先与染色体中互补DNA片段结合,再与磁性亲和素微球连接后将含CAG重复序列的转录基因从染色体中分离出来。
DNA杂交实验亦证实用该法提取的基因特异性高,信息量完整。
4.2PNA在疾病诊断领域的应用
4.2.1PNA用于荧光原位杂交(FISH)分析这是目前为止发展较为成熟的一种技术,这项技术可以针对病原微生物的分子化石-rRNA的序列来设计PNA探针,利用该探针结合FISH的方法来分离,鉴定,计数病原微生物。
这项技术也可以利用卫星重复序列来设计针对人类染色体的特异性PNA探针,用于染色体异常性疾病的诊断。
还可以设计出端粒酶PNA探针用于检测癌症及衰老问题。
4.2.2PNA用于“PCR夹”的研究这是利用PNA与DNA的高亲和力及高特异性,结合PCR技术检测目的核酸序列中的单碱基突变。
由于PNA无法被Tag酶所识别,因此尚无法作为PCR引物。
利用这一特性,可以针对目的碱基设计出一对单个碱基差异的寡聚PNA和DNA加入反应体系中,其中PNA仅能和野生型目的碱基配对,DNA引物则与突变型目的碱基配对。
当模板是野生型时,PNA利用它与DNA的高度亲和力竞争性彻底抑制了PCR反应的进行,使反应无任何产物生成。
而当模板是突变型时,DNA引物即可以结合到模板上,经过足够多的循环数,扩增出目的条带。
该技术已经被广泛应用于各种基因点突变的检测[17]。
4.3基因组切割和图谱分析
嘧啶同聚体PNA与dsDNA结合形成的D-环结构为单股DNA,它对S1酶和绿豆核酸酶敏感[1],因此可以用S1酶对基因组DNA进行定点切割和基因克隆。
但这样切割的DNA有片段缺失。
采用PNA对,即一分子PNA与基因的模板链结合,另一分子PNA与非模板链结合,如此形成的P-环能限制S1酶的切割范围[1.18]。
S1酶定点切割dsDNA虽然简单、有效,且不需要甲基化的步骤,但它不能产生粘性末端,也不能进行基因组DNA酶切图谱的分析。
PNA与dsDNA结合后,可以保护重叠区内或距结合区2~3个核苷酸以远的核酸限制性内切酶位点不被甲基化酶所甲基化,也不被限制酶所切割[19]。
PNA与染色体或大片段DNA结合后,用甲基化酶处理,PNA结合区以外的甲基化酶识别位点被甲基化,不会被匹配限制酶所切割。
当PNA从dsDNA链上洗脱下来后,PNA结合区内的限制酶位点因未被甲基化而可被特异的限制酶切开,从而达到对染色体和大基因组片段进行定点切割的目的。
4.4基因表达调控
从基因到蛋白质要经过转录形成mRNA,再以mRNA为模板译成蛋白质的过程。
PNA通过与dsDNA或RNA结合而影响转录和翻译的过程。
用T3、T7及哺乳动物细胞polⅡ所做的实验表明[20.21],PNA与dsDNA中的模板链结合能抑制转录的延伸。
这种抑制效率与PNA组成有关,一般10~15聚体PNA即可有效抑制。
T10同聚PNA导致的转录在PNA的第一位碱基,T5C1T4PNA在第2或第3位碱基上。
T2C1T2C1T4PNA则在最后的3位碱基上。
PNA抑制转录延伸的作用比寡核苷酸强,且不需要进行修饰。
实验证明同聚嘧啶PNA与dsDNA进行结合形成的P-环可以作为转录的启动子,与DNA自身启动子竞争转录系统[22]。
启动反义RNA链的合成,这是很有意思的结果。
如果PNA将来能作为基因打靶的药物,它可从反基因(antigene)和反义mRNA(antisense)两个环节阻断基因表达。
PNA与RNA结合能阻断逆转录合成cDNA,与寡核苷酸不同,这种阻断是直接的。
在转染了SV40大T抗原的细胞内注射PNA,发现大T抗原的表达从PNA靶序列处剪短,而对β-半乳糖苷酶蛋白则能完整表达,说明这种阻断作用是特异的,与用细胞浆提取物所做的实验结果一致,说明PNA在细胞内至少能从RNA水平上发挥基因靶向药物的作用[20],一般15聚体PNA即可。
4.5PNA在基因治疗上的应用
基因治疗是指制备正常基因代替遗传缺陷基因或关闭、抑制异常基因。
基因原位修复是最理想途径,但目前在技术上很难做到。
由于肽核酸具有广泛生物学效应,作为基因治疗药物有很大潜能。
4.5.1PNA作为反义药物PNA的反义性质是指PNA与mRNA结合,从而阻断翻译,使蛋白质的合成不能进行。
理论上,PNA是最有前途的反义药物。
①PNA不受血清及体液中的核酸酶及蛋白酶降解,是作为反义药物的重要前提。
②PNA与RNA的结合力强,特异性高,因而抑制特定基因表达所需的剂量很小。
③PNA与单链RNA结合,同时也与其相应单链DNA结合,而且PNA/RNA复合物的稳定性远较PNA/DNA的稳定性为高。
④PNA可特异地阻遏翻译过程,形成双螺旋的PNA如果与起始密码子区域互补,可阻遏翻译,并表现出剂量依赖型;如果与编码区互补则无阻遏作用;而形成三螺旋的PNA在两种区域均可阻遏翻译[23]。
4.5.2PNA反基因药物反基因策略的作用靶是DNA,通过在每个基因组中形成PNA/DNA复合物,理论上就可抑制转录。
当作用靶是mRNA时,PNA必须与细胞中大量mRNA结合才可抑制翻译,所以反基因策略更有吸引力。
PNA能与双链DNA结合形成很稳定的链取代复合物,因此它们是很好的反基因试剂。
已有实验证实这种PNA2/dsDNA复合物在体外能阻断原核及真核RNA聚合酶的延伸[24]。
其中的一个实验研究了PNA对噬菌体RNA聚合酶T3及T7参与的转录的影响,靶序列位于bluescriptKS+质粒上T3或T7启动子的下游。
实验发现,结合于模板链针对高嘌呤位点的10聚PNA可阻止转录,而非结合于模板链的PNA则不能阻止转录。
Nielsen等[25]进行引物延伸实验发现在PNA结合的位点,TagDNA聚合酶和EcoliDNA聚合酶大片段受到抑制。
同样PNA可抑制RNA聚合酶,终止基因的转录。
另外,PNA除了阻止RNA、RNA聚合酶外,针对DNA结合蛋白识别基因控制区的PNA也可能下调基因复制和转录。
5PNA展望
根据PNA的代谢稳定性,主要将其用于抑制基因表达的反义药物研究领域,国外几家制药及生物技术公司,ISIS、PE等公司均投入大量精力从事开发研究;根据其与DNA优良的杂交稳定性,PNA又被广泛用于DNA分子识别和操纵。
PNA可以广泛用于病原体、遗传病检测的分子杂交、原位杂交、突变分析、抗癌、抗病毒反义核酸研究和应用。
尤其是PNA可以取代寡核苷酸用于基因芯片的制备,将比普通基因芯片更稳定,特异性也更好,被认为是基因芯片的升级产品,相信在临床诊断芯片的开发方面。
PNA也可用于定量PCR,可以用于实时检测PCR的扩增反应;也可将其做成PNABeacon,用于实时监测细胞内的RNA表达。
随着PNA基础研究的不断深入和新技术的不断出现,PNA将显示出无比优越的性能和更为广阔的应用前景。
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