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用HPLCMSMS法多残留分析蜂蜜中的杀虫剂和抗生素
用HPLC-MS-MS法多残留分析蜂蜜中的杀虫剂和抗生素
摘要:
本实验的目的是建立一种检测蜂蜜中两类抗生素和三种杀虫剂残留的分析方法。
分析物为5种四环素、4种磺酰胺、杀虫剂蝇毒磷、多菌灵和阿米曲士(两种代谢物)混合物。
所有的化合物都从蜂蜜中提取,用固相萃取(SPE)预浓缩。
采用高效液相色谱-质谱-质谱(HPLC-MS-MS)方法,用三级四极杆串联质谱仪的多重反应监测(MRM)的模式,达到识别并量化以上化合物(ShethetalJAgricFoodChem38:
1125–1130,1990)。
在分析过程中发现取决于蜂蜜来源的植器官的强矩阵效应。
这就导致乐需要一个标准的方法定量检测到的污染物。
关键词:
蜂蜜抗生素杀虫剂多残留HPLC-MS-MS固相萃取
1.引言
蜂蜜是一种混合物,长期被视为自然健康食物,也就是说,不含任何污染物[1]。
然而养蜂人必须克服两大威胁—传染病和杀虫剂对蜜蜂的毒害。
因此必须要能够发现蜂巢产物(包括蜂蜜、蜡、蜂胶等等)中可能存在的不良的残留物[2]。
蜂蜜中含有的微量的物质有可能是被授权或者禁止的,比如环境中的杀虫剂。
本研究的目的是建立一种可以同时检测出蜂蜜中抗生素和杀虫剂多残留的方法。
检测两类抗生素,四环素和硫酰胺,因为这些抗生素常被养蜂人用于治疗污仔病(一种蜜蜂幼虫疾病)[2]。
我们还需要检测一些杀虫剂、阿米曲士和蝇毒磷[3],它们被用于治疗蜂螨,还有被广泛用作杀真菌剂的多菌灵[5],特别是用在作为最频繁的蜂蜜来源之一的油菜(油菜籽)上。
四环素是人类和动物经常使用的有效抗生素药物。
这类抗生素在各种各样的食物中存在,如牛奶[6、7],蛋[8],牛肉[9、10]。
同样的,磺酰胺是对人类相对来说无毒的抗感染药物,。
目前为止蜂蜜中还有数量最多的磺酰胺尚未被欧盟[11]授权。
最早在养蜂中使用杀虫剂、阿米曲士是在20世纪80年代初期法国用于治疗蜂螨。
现有的文献中几乎没有报道关于蜂蜜中阿米曲士的存在,但Jimenez报道过其分解产物的存在[12]。
他发现了5种,其中只有两中在两周后仍在存在于大多数样品中。
蝇毒磷是一种有机磷酸酯用作杀虫剂或杀螨剂治疗蜂螨和小蜂窝甲虫。
在2002年,美国环境保护署(EPA)建立一个上限,蜂蜜中0.1mg/kg和蜂蜡中100mg/kg。
欧盟的标准为蜂蜜中0.1mg/kg[13]。
这两种产品是用于对抗蜂房寄生虫。
而多菌灵则是用于治疗作物、果树和蔬菜的杀真菌剂。
我们选择这种杀真菌剂是有很多原因的。
很多蜜蜂采集蜂蜜的作物(油菜、向日葵)上使用它。
另外,分析多菌灵也是分析另一种杀真菌剂,苯菌灵的检测形式与多菌灵相同[14]。
很难在一些基质(水、肉、牛奶、蜂蜜等)中检测四环素、磺酰胺或杀虫剂残留,因为低浓度限制了检测和量化。
表1所示,从浓度和检测限来看数据既不一致也不满意。
现在的工作是为了建立多残留方法。
表1已发表的蜂蜜中检测物数据
2.实验部分
.试剂
我们分析九种抗生素和三种杀虫剂(图1)。
四环素类抗生素(四环素(TC),氧四环素(OTC)、强力霉素(DC)、地美环素(DMC)和氯四环素(CMC))和磺酰胺类抗生素(磺胺塞唑(STZ)、磺胺二甲氧基嘧啶(SDM)、磺胺甲恶唑(SMX)、磺胺甲二唑(SMZ)来自Sigma-Aldrich(StQuentinFallavier,法国)。
四环素是盐酸盐。
图1被分析物的化学式a~l
三种杀虫剂为,阿米曲士(AMZ),蝇毒磷(CMP)和多菌灵(CDZ)来自Cil-Cluzeau(法国,巴黎)。
阿米曲士两个主要的分解产物为2、4-二甲基苯(amitrazⅠ)、N-(2、4-二甲基苯)甲酰胺(amitrazII)(图2)。
图2阿米曲士的两种分解产物结构式
蜂蜜样品为法国蜂蜜来自未经处理的蜂巢,并不同的植物器官为蜜源。
他们由不同的养蜂人提供,使用前确认了这个化合物在该研究中无法被HPLC-MS-MS检测到。
溶液是由各化合物溶于甲醇中,浓度为1g/L,并保存在-16℃。
标准溶液是按照90:
10(v/v)水-乙腈稀释溶液,然后保存在黑暗的4℃冰箱中最多一个星期。
甲醇、乙腈和二氯甲烷均为色谱纯,来自FisherScientific(Illirch,France)甲酸,纯度为98-100%来自Riedel-deHaën(StQuentinFallavier,France)。
氨气(20%)、盐酸(37%)和柠檬酸来自Prolabo,RPNormapur(Pessac,法国)。
固相萃取柱来自Water(StQuentinenYvelines,France)。
仪器
使用Alliance2695色谱仪(Waters,StQuentinenYvelines,法国),色谱柱为InertsilODS2(Hichrom,Reading,UK),Quattro-Micro三级四极杆质谱仪(Micromass-Waters)。
色谱仪配有独立的控温箱和进样装置。
方法
固相萃取(SPE)由手动改进为Rapidtrace自动萃取(Zymark,Roissy,法国),获得更好的重现性。
分析蜂蜜中的抗生素和农药需要一个初始的萃取步骤以达到分离出所要求的化合物,然后预浓缩,最大限度地限制其他化合物干扰分析(基质效应)。
这就要求必须找到一个方法适应每中需要检测的残留物的物化性质。
四环素是两性物质,pH值为7时微溶于水。
在酸、碱液中不稳定。
在定量分析时一个重要的问题是四环素在不同pH时形成差向异构体[10、22].以上六种四环素中只有地美环素不会形成差向异构体。
氯四环素、四环素、强力霉素和氧四环素均能形成四种差向异构体(图3)。
欧盟最新立法规定MRLs(最大的残留物级别)[23]规定,计算各四环素中残留物时必须包括该母体化合物及其最容易测量的四种差向异构体的总和。
磺酰胺是磺氨酸的衍生物,它们必须水解,破坏与蜂蜜中的糖的连接键[24-26]才能定量.
除了蝇毒磷以外的杀虫剂在pH作用下会电离。
阿米曲士,由于其在蜂蜜中会快速裂解只需要检测它的两个主要的裂解产物2、4-二甲基苯(amitrazⅠ)和N-(2、4-二甲基苯甲酰胺(amitrazII)[12]。
将6g蜂蜜放置在离心管中,加入2mol/L的盐酸稀释到12g。
手动混合样品3分钟,在室温下进行声波降解10分钟。
然后根据文献[26]放置于黑暗中五min,通过酸水解作用将磺酰胺与糖的键断开,释放出来。
样品在20°C,7000rpm进行离心,除去蛋白质。
取上层清液(10g)加入10ml0.2mol/L的柠檬酸。
柠檬酸可以使pH容易调整到大约4,含有20%氨。
OasisHLB60-mg萃取柱(Water)先后被通入3ml乙腈、3ml水和3ml0.1mol/L的HCl。
然后将10g蜂蜜溶液在pH4下沉淀。
将萃取柱用15毫升去离子水冲洗,在氮气中干燥4min。
用3ml乙腈-甲醇-二氯甲烷(50:
25:
25,v/v/v)洗脱。
洗脱液40°C氮气下蒸干,残留物加入500μL水-乙腈(90:
10v/v),HPLC-MS-MS进样.
图3氯四环素的差向异构体结构式
结果与讨论
液相色谱于质谱联用是目前化合物研究中最广泛使用的技术[9,20,24].最初的分析方法包括优化色谱分离,然后找到一个合适的技术回收蜂蜜中的残留物,最后用质谱量化[21].
高效液相色谱分离的优化
色谱优化的第一步是采用亲水的溶剂分离不能的化合物色谱分离的有关不同的化合物。
表2HPCL色谱柱测试
考虑到抗生素的性质,用洗脱度衡量一些我们经常用来分离基本物质的一些设计好的色谱柱。
3种色谱柱进行测试(表2)。
表3HPLC流动相
Nucleodur色谱柱的分离度很差,峰对称性低。
X-terra色谱柱相对来说出峰较好,但是无法分开多菌灵与amitrazⅠ和amitrazII与磺胺二甲氧基嘧啶。
选择InertsilODS2色谱柱,因为它有更好的分离度(图4)。
以是水-乙腈混合溶液梯度洗脱分离,流动相中含有0.2%甲酸(表3)。
流速为200μL/min,柱温为25°C(置于色谱柱恒温箱)。
质谱参数优化
图4所有被检测的化合物的色谱图1~13化合物
为了检测微量的样品中的残留物,首先必须将他们明确地鉴别并量化。
因此在液相色谱中采用MS-MS工作模式,最常使用三级四极分析仪[9,20]。
采用阳离子模式电喷雾检测。
优化后的参数如下:
毛细管电压3.10kV,透镜电压2V,源温和脱溶剂温度为120℃和350℃。
喷雾流速和脱溶剂气体(N2)为80和600L/h。
碰撞气体(氩)的压力接近0.307Pa。
每个残留物在MRM(多发性反应监控)模式下选择有两个分裂反应特点的准分子离子。
四环素裂解物与文献数据一致,失去水和氨基[27-29],如图5所示。
优化参数列在表4。
物质提取
图5四环素裂解片段
由于蜂蜜样品组成复杂[2],需要首先进行预浓缩和纯化。
测试了很多学术刊物上发表的方法[21]。
表4检测物的MRM
首先我们测试液液萃取的方法,它是Verzegnass用乙腈和二氯甲烷回收了10种磺酰胺[25]。
Jimenez[12]使用己烷和丙酮混合物提取了蜂蜜中阿米曲士分解产物。
然而,这些方法均只适用于某一种化合物,而没有一种方法可以回收所有的化合物。
在我们的实验室工作的基础上[21]我们测试了固相萃取(SPE)方法。
我们先使用OasisMCXcartridges(Waters)萃取柱,处理机制为离子交换结合疏水作用。
除了蝇毒磷含有氨基在PH作用下会电离,其他化合物都可以提取。
将蜂蜜置于酸性溶液中并漂洗,化合物用(乙腈-氨水95:
5和70:
30v/v)洗脱。
因为OasisMCX固定相强烈地保留四环素,四环素类的萃取收率高度分散。
根据抗生素化学结构的不同磺酰胺的收率从60%到80%不等。
对于杀虫剂而言,amitrazⅡ收率为35%,多菌灵大约70%,amitrazⅠ100%,蝇毒磷大约65%。
许多研究者使用HLB萃取柱(Water),机制为亲水和疏水作用,而另一些研究者更喜欢使用C18硅烷键合硅胶柱。
这两种类型的萃取常被用来从各种各样的样品如肉类[9]、牛奶[6],蜂蜜[15,26,29]中提取抗生素和杀虫剂。
若要使所有化合物均有一定的回收率需要进行很多测试,这在实验部分描述过过程。
载如上描述的实验中回收率如表5所示。
四环素回收率64%,,对氧四环素回收87%,氯四环素为90%,强力霉素109%。
最后,对于农药,杀虫剂种类不同回收率不同。
回收率amitrazⅠ为67%,amitrazⅡ59%,多菌灵为95%,蝇多磷为88%。
可以看出含有NH2基团回收率降低,之后可以看到蜂蜜种类不用值会变化。
尽管回收率不都是接近100%,但是他们重复性较好因而可以接受。
作为一例多残留方法,最终的方法通常是一种重现性和结果可靠的妥协。
校准曲线的相同条件下完成。
表5OasisHLB,60mg,蜂蜜萃取收率
量化
我们最初使用外标法,采用亲水的流动相。
但是在蜂蜜中这种技术不可靠。
20-200μg/kgf范围的校准曲线制作时有很强的基体,其效应强弱取决于蜂蜜的来源。
表6列出不同类型的蜂蜜的标准曲线。
四环素类(TC,OTC,DC,CTC)的标准曲线有相当大的差异,这取决于蜂蜜的类型。
在标准的水溶液中的值没有高于蜂蜜中的。
这意味着样品的来源对基质效应会有正面或负面效应。
来自向日葵,希瑟、山区和栗色的蜂蜜四种四环素的最低的反应。
所有的花朵、菜籽油、相思的蜂蜜给最高的反应。
对于磺酰胺(STZ,SMX,SMZ,SDM)溶于水中和标准样品中的结果相差很大。
基体效应大大减少了对这些物质对质谱检测器的
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