核酸抽提经验及原理总结.docx
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核酸抽提经验及原理总结
核酸提取原理及经验总结
一、核酸
核苷酸单体聚合而成的生物大分子,是生物细胞最基本和最重要的成分。
一般认为,生物进化即始于核酸,因为在所有生命物质中只有核酸能够自我复制。
今天已知核酸是生物遗传信息的贮藏所和传递者。
一种生物的蓝图就编码在其核酸分子中。
核酸是1869年米歇尔(F.Miescher)在脓液的白细胞中发现的。
他当时称之为核素。
阿尔特曼(R.Altmann)于1889年认识其酸性后,定名为核酸。
二、核酸的分类和功能
核酸分为核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)两大类。
这两类核酸有某些共同的结构特点,但生物功能不同。
DNA贮存遗传信息,在细胞分裂过程中复制,使每个子细胞接受与母细胞结构和信息含量相同的DNA;RNA主要在蛋白质合成中起作用,负责将DNA的遗传信息转变成特定蛋白质的氨基酸序列。
核酸的基本结构单元是核苷酸,核苷酸含有含氮碱基、戊糖和磷酸3种组分。
碱基与戊糖构成核苷,核苷的磷酸酯为核苷酸。
DNA和RNA中的戊糖不同,RNA中的戊糖是D-核糖;DNA不含核糖而含D-2-脱氧核糖(核糖中2位碳原子上的羟基为氢所取代)。
核酸就是根据其中戊糖种类来分类的,DNA和RNA的碱基也有所不同。
下面我们看看DNA和RNA具体的差别:
(一)DNA的分子结构
1.DNA的碱基组成规律:
Chargaff等根据分析各种生物及其不同组织内DNA样品水解液中的碱基含量的结果,得出以下结论:
1)同一生物不同组织的DNA样品,其碱基成分含量相同。
2)不同生物的DNA碱基成分含量不同。
3)对某一生物讲,其碱基成分的含量不受年龄、营养及环境变化等影响。
4)在同一生物的DNA碱基含量是A=T,G=C,A+G=C+T,碱基之间的这种关系称Chargaff法则。
2.DNA分子的基本结构:
核酸分子内单核苷酸之间的连接键为3',5'-磷酸二酯键,是共价键。
DNA分子的基本结构就是许多脱氧核糖核苷酸借磷酸二脂键相互连接而成的多核苷酸链。
DNA链中碱基的组成和排列顺序即为DNA的一级结构。
DNA的遗传信息即储存在DNA分子的碱基排列顺序中。
.DNA分子的空间结构:
DNA的二级结构是双螺旋结构,其特点为:
1)两条链方向相反、相互平行、主链是磷酸戊糖链,处于螺旋外侧。
2)碱基在螺旋内侧并配对存在,A与T配对的G与C配对,A与T之间二个氢键相连(A-T),G与C之间三个氢键相链(G-C)。
3)螺旋直径2nm,二个碱基对平面距0。
34mm,10bp为一螺距,距离为3。
4nm。
4)稳定因素主要是碱基之间的氢键和碱基对平面之间的堆积力。
(二)RNA的分子结构
RNA的基本结构是A、G、C、U四种碱基组成的核糖苷酸通过磷酸二酯键相链而成的多核苷酸链。
有三种主要的RNA:
据其作用可分转运RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和核蛋白体RNA(rRNA),它们的二级结构是单链局部双螺旋,共中tRNA结构较清楚:
1.tRNAtRNA一级结构特点是:
1)核苷酸数目在70-90之间;2)含较多稀有碱基;3)所有tRNA的3'末端均是-CCA的结构。
tRNA二级结构特点:
呈三叶草形,有三环四臂。
其中3'的氨基酸臂是携带氨基酸的位置,II环又称反密码环,此环顶端由3个碱基组成反密码子,起到识别mRNA上对于密码子的作用。
2.MrnamRNA是蛋白质合成的模板,真核生物的mRNA的5'端有m7Gppp的帽子,3'末端有20-200多聚A的尾巴上述两者之间为信息区,其中每三个相邻碱基组成一个三联体,代表一个氨基酸信号,即为密码子。
不同mRNA具有不同的密码顺序,决定蛋白质多肽链的氨基酸排列顺序(一级结构)。
3.rRNA核蛋白体RNA,它是细胞内含量最多的RNA:
rRNA与多种蛋白质结合成核蛋白体,存在于胞浆,是蛋白质合成的部位。
三、核酸的理化性质
RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶,DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。
除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外,核酸和核苷酸大都呈酸味。
DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物,一般都溶于水,不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂,它们的钠盐比游离核酸易溶于水,RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L,DNA钠盐在水中为10g/L,呈黏性胶体溶液。
在酸性溶液中,DNA、RNA易水解,在中性或弱碱性溶液中较稳定。
天然状态的DNA是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。
要从细胞中提取DNA时,先把DNP抽提出来,再把P除去,再除去细胞中的糖,RNA及无机离子等,从中分离DNA。
四、细胞裂解:
(一)裂解原理
在核酸提取过程中,细胞裂解是非常重要的。
经典的裂解液几乎都含有去污剂(如
SDS、TritonX-100、NP-40、Tween20等)和盐(如Tris、EDTA、NaCl等)。
盐的作用,除了提供一个合适的裂解环境(如Tris),还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏(如EDTA)、维持核酸结构的稳定(如NaCl)等。
去污剂则是通过使蛋白质变性,破坏膜结构及解开与核酸相连接的蛋白质,从而实现核酸游离在裂解体系中。
裂解体系中还可能加入蛋白酶,利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段,促进核酸与蛋白质的分开,同时,也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。
也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)裂解的,该方法已经成为了RNA抽提的主流,却不是基因组DNA抽提的主流。
(二)细胞的裂解方法
细菌细胞破碎方法有以下几种:
1)机械方法:
超声波处理法、研磨法、匀浆法,关于超声波处理法,要设定好超声时间和间隙时间,一般超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间。
2)化学试剂法:
用含SDS或CTAB的溶液处理细胞,在一定的pH环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相,pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)提供,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀,缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
;3)反复冻融法:
将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
4)酶解法:
加入溶菌酶或蜗牛酶、蛋白酶K等,都可使细胞壁破碎,核酸释放。
蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质,促进核酸的分离。
其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1,4)键水解。
蛋白酶K能催化水解多种多肽键,其在65℃及有EDTA、尿素(1~4mol/L)和去污剂(0.5%SDS或1%TritonX-100)存在时仍保留酶活性,这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。
在实际工作中,酶作用、机械作用、化学作用经常联合使用。
具体选择哪种或哪几种方法可根据细胞类型、待分离的核酸类型及后续实验目的来确定。
(三)裂解方法的评价
含蛋白酶的裂解方法,可以认为是抽提基因组DNA的首选。
裂解包括膜蛋白的游离和与基因组DNA相连接的蛋白质的游离。
蛋白酶的作用是使蛋白质变小,故而对蛋白质的游离有巨大的促进作用;同时,巨大的基因组DNA是很容易“缠”住大分子的东西的,蛋白质被蛋白酶消化变小后,则不容易被基因组DNA“缠”住,有利于蛋白质在纯化操作中的去除,使最终获得的基因组DNA的纯度更高。
另外一个思路是,如果基因组DNA与
蛋白质“缠”在一起,在纯化的过程中有两种可能:
如果基因组DNA的特性占优势,则纯化时以DNA的形式被保留下来,导致蛋白质的残留;如果蛋白质的特性占优势,则纯化时以蛋白质的形式被去除,导致DNA的损失。
当然去污剂裂解方法,仍然在细胞基因组DNA抽提方面有优势,尤其是当得率和纯度要求不是最高,而经济性及操作简单很重要时。
控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。
该方法结合高盐沉淀,可以实现最简单的操作,但纯度及得率的稳定性可能会比用PC抽提的差一些。
高浓度蛋白质变性剂(如GIT、GuHCl等)的裂解方法,是抽提RNA的首选。
总RNA的抽提,最重要的是快速裂解细胞膜,至于与基因组DNA相连接的蛋白质的裂解以及基因组与蛋白质“缠”住的问题,因为都不会对以后的纯化产生大的影响,可以不考虑。
高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜,进而迅速抑制住细胞内的RNA酶,从而确保了RNA的完整性。
除了极少量不适用该方法的样品–主要是植物,其它绝大部分样品的RNA的抽提,都可以以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。
当然有些样品,如肌肉,即使是RNA抽提,也强烈建议使用含蛋白酶的裂解液(或者在操作中的某个时候使用蛋白酶消化蛋白质),原因在于这些样品中的蛋白质,是非常难以去除的。
该方法是获得最大得率和最高纯度的基础。
含CTAB的裂解液,几乎成为富含多糖的样品,如细菌、植物的基因组DNA抽提的首选裂解方法。
该方法成功与否与两个因素有关:
一是CTAB的质量,二是洗涤的彻底程度。
CTAB的质量对裂解效率有很大的影响,而且,似乎还说不清楚原因,因为即使是同一公司生产的纯度一样的CTAB,批号不同,效果就可能差别很大。
洗涤去除CTAB要比其它的盐难一些,同时,CTAB的少量残留也会对酶活性有巨大影响,所以洗涤是否彻底也是该方法成功与否的关键。
裂解时的温度,多使用65C;但如果发现降解严重或者得率太低,可以试一下37C–45C这个相对低温的区域。
SDS碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法,具有快速、得率高、几乎无基因组DNA污染的特点。
控制好裂解液/菌体的比例和操作的温和是该方法成功的关键。
蛋白质的沉淀效率在4C会更好一些,所以,加入溶液III后在4℃静置一段时间以及采用4℃离心去蛋白质,都可以提高质量。
该方法不一定要使用PC纯化,但结合PC纯化,可以获得纯度很高的质粒。
RNA的去除可以靠在溶液I中加入RNaseA(100ug/ml)或者在最后的溶解液中加入RNaseA(25ug/ml)来实现。
总的感觉是,在溶液I中使用RNaseA,RNA的残留少一些。
不过,经典沉淀几乎没有办法彻底去除RNA残留。
另外,对大质粒(50kb以上),该方法可能会有问题。
PCR模板的简易裂解方法,也是使用面很广的一类方法。
该方法的特点是无须纯化,样品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR,非常快速。
也正因为不纯化,所以,假阴性(即没有扩增出来的阳性)比例也比较高。
该方法最简单的就是反复冻融法,简便快捷,不需任何化学试剂,冻融离心,PCR检测就可以了。
如果使用裂解法,哪么最简单的裂解液就是水,复杂一点的就会含有一些不会抑制后续的PCR反应,而且能提高裂解效率,甚至还可能部分消除样品内抑制PCR反应杂质的东西,如TritonX-100、甲酰胺等。
再复杂一点的就会含有诸如Chelex100之类的能吸附部分杂质的介质。
操作也非常简单,多使用温度的变化来实现样品的裂解,如煮沸、或者高温-低温的多次循环等。
该方法最适合从一大堆样品中找出阳性样品,但却不适合用于判断某一个样品是阳性还是阴性。
降低样品使用量可以提高阳性率,因为样品量的降低,同时意味着PCR的抑制物量的降低。
(四)样品与裂解液的比例
选择了合适的裂解液,下一步就是要控制好样品与裂解液的比例。
这个问题非常重要,但却没有获得足够的重视。
严肃的参考资料,都应该会提供一个简单的比例,如1ml裂解液可以用于Tmg组织或者C个细胞;建议:
样品量绝对要小于资料所提供的。
起始样品用多大,并没有具体的说法。
如果不是样品量有限,则以能抽提出满足数次成功实验所需的核酸量,作为决定样品起始量的基础,会比较合理的。
不要因为1ml裂解液可以抽提100mg样品,就一定使用100mg样品。
裂解液的用量,表面上与抽提的结果(纯度及得率)没有关系,然而,在实际操作中,对结果是有比较大的影响的。
裂解液的用量原则是:
确保能彻底裂解样品,同时使裂解体系中核酸的浓度适中。
浓度过低,将导致沉淀效率低,影响得率;浓度过高,去除杂质的过程复杂且不彻底,导致纯度下降。
另外,裂解液的用量是以样品中蛋白质的含量为基准的,而不是以核酸含量为基准,这一点务必牢记。
五、核酸提取
核酸提取包含样品的提取和纯化两大步骤。
提取是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程,纯化则是使核酸与裂解体系中的其它成分,如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离的过程。
(一)DNA提取的几种方法
1浓盐法:
1)利用RNA和DNA在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1M氯化纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而DNA位于上层水相中,用2倍
体积95%乙醇可将DNA钠盐沉淀出来;2)也可用0.15MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白。
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些;3)以稀盐酸溶液提取DNA时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA的分离。
在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂。
2阴离子去污剂法:
用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA。
由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA。
3苯酚抽提法:
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用。
用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。
蛋白分子溶于酚相,而DNA溶于水相。
离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含DNA的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀DNA。
此时DNA是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出。
此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。
4水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去RNA,然后将沉淀溶于水中,使DNA淀溶于水中充分溶解于水中,离心后收集上清液。
在上清中加入固体氯化钠调节至2.6M,加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出。
然后分别用66%,80%,95%乙醇以及丙酮洗涤,最后在空气中干燥,既得DNA样品。
此法提取的DNA中蛋白质含量较高,故一般不用。
为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入SDS。
(二)RNA提取
所有RNA的提取过程中都有五个关键点,即1):
样品细胞或组织的有效破碎;2)有效地使核蛋白复合体变性;3)对内源RNA酶的有效抑制;4)有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离;5)对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。
但其中最关键的是抑制RNA酶活性。
1)总RNA的试剂盒快速提取一些公司推出的总RNA提取试剂盒,该总RNA纯化系统采用两种著名的RNA酶抑制剂,异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇,加上整个操作都在冰浴下进行,这样就能显著降低RNA的降解速率。
GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用,将促使核蛋白复合体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。
而进一步从复合体中纯化RNA,则根据Chomczynski和Sacchi的一步快速抽提法进行,采用酸性酚-氯仿混合液抽提。
低pH值的酚将使RNA进入水相,这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。
水相中的RNA可用异丙醇沉淀浓缩。
进一步将上述RNA沉淀复溶于GTC溶液中,接着异丙醇进行二次沉淀,随后用乙醇洗涤沉淀,即可去除所有残留的蛋白质和无机盐,而RNA中如含无机盐,则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。
2)氯化锂法提取总RNA:
本方法用高浓度尿素变性蛋白并抑制RNA酶,用氯化锂选择沉淀RNA,其特别适合于从大量样品中提取少量组织RNA,具有快速简洁的长处,但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片断丢失的缺陷。
3)蛋白酶-热酚法:
本方法适合于病毒RNA的提取。
六、核酸纯化
裂解完成后,液体体系中就包括了游离的核酸、蛋白质及其它大分子杂质、盐:
纯化就是将核酸与其它游离成分分离的过程。
就个人所知,目前在科研领域广泛使用的核酸纯化技术主要可以分为两大类:
使用介质的和不使用介质的,使用介质的,一次就将核酸与其它所有杂质分开;不使用介质的,一定是首先将核酸和盐与大分子杂质分开,再通过沉淀核酸使核酸与盐分开(PEG沉淀和LiCl沉淀除外)。
使用介质的可以分为两类:
离子交换介质和吸附介质。
不使用介质的也分为两类:
使用苯酚/氯仿抽提的和不使用苯酚/氯仿抽提的。
(一)纯化方法:
下面比较一下具体的纯化技术:
1)经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术:
细胞裂解后离心分离含核酸的水相,加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25241∶∶体积)混合液。
依据应用目的,两相经漩涡振荡混匀(适用于分离小分子量核酸)或简单颠倒混匀(适用于分离高分子量核酸)后离心分离。
疏水性的蛋白质被分配至有机相,核酸则被留于上层水相。
酚是一种有机溶剂,预先要用STE缓冲液饱和,因未饱和的酚会吸收水相而带走一部分核酸。
酚也易氧化发黄,而氧化的酚可引起核酸链中磷酸二酯键断裂或使核酸链交联;故在制备酚饱和液时要加入82羟基喹咛,,以防止酚氧化。
氯仿可去除脂肪,使更多蛋白质变性,从而提高提取效率。
异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。
核酸盐可被一些有机溶剂沉淀,通过沉淀可浓缩核酸,改变核酸溶解缓冲液的种类以及去除某些杂质分子。
典型的例子是在酚、氯仿抽提后用乙醇沉淀,在含核酸的水相中加入pH5.0~5.5,终浓度为0.3M的NaAc或KAc后,钠离子会中和核酸磷酸骨架上的负电荷,在酸性环境中促进核酸的疏水复性。
然后加入2~2.5倍体积的乙醇,经一定时间的孵育,可使核酸有效地沉淀。
其他的一些有机溶剂[异丙醇、聚乙二醇(PEG)等]和盐类(10.0mol/L醋酸铵、8.0mol/L的氯化锂、氯化镁和低浓度的氯化锌等)也用于核酸的沉淀。
2)使用离子交换介质的纯化技术:
将裂解液过柱,核酸被联结在离子交换介质上;
洗涤去除残留的杂质后,用高盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来。
再经过标准的乙醇/异丙醇沉淀、乙醇洗涤、干燥等操作,获得纯的核酸,溶解于合适的缓冲液中。
3)使用吸附介质的纯化技术:
将裂解液过柱,核酸被吸附介质选择性吸附;洗涤去除残留的杂质后,用水或者合适的低盐缓冲液将核酸从介质上洗脱下来,就可以直接用于后续实验。
4)密度梯度离心法:
密度梯度离心也用于核酸的分离和分析。
双链DNA、单链DNA、RNA和蛋白质具有不同的密度,因而可经密度梯度离心形式形成不同密度的纯样品区带,该法适用于大量核酸样本的制备,其中氯化铯2溴化乙锭梯度平衡离心法被认为是纯化大量质粒DNA的首选方法。
氯化铯是核酸密度梯度离心的标准介质,梯度液中的溴化乙锭与核酸结合,离心后形成的核酸区带经紫外灯照射,产生荧光而被检测,用注射针头穿刺回收后,通过透析或乙醇沉淀除去氯化铯而获得纯化的核酸。
注:
但是在日常实验过程中,通常用的纯化方法有主要有以下两种,一是化学方法,即PC抽提+醇沉淀;二是物理方法,即介质纯化。
第一种方法是利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质,实现核酸与蛋白质的分离;再用醇将核酸沉淀下来,实现核酸与盐的分离。
第二种方法则是利用某些固项介质,在某些特定的条件下,选择性地吸附核酸,而不吸附蛋白质及盐的特点,实现核酸与蛋白质及盐的分离。
高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体,省略了PC操作的麻烦。
当然,也有不纯化的抽提方法,但是用途多局限于简单的PCR。
其它杂质–如多糖、多酚等-的去除,基本上都是在这两种方法的基础上,通过增加一些特别的试剂,或者增加一些额外的步骤来实现的。
(二)纯化方法评价
PC(P是英文酚的缩写,C是英文氯仿的缩写)抽提/醇沉淀方法,是一个永不过时的方法。
稳定、可靠、经济、方便。
PC抽提可以彻底去除蛋白质,醇沉淀可以去除盐,对于一般的干净的样品(杂质为蛋白质),该方法完全可以获得高质量的核酸。
虽然每次PC抽提都会损失一部分核酸(因为不可能将水相全部移取),以及低浓度核酸的醇沉淀效率低,但这些问题都可以靠操作的调整而得以解决或者减少影响。
该方法的最大的问题是不适合大规模抽提。
PC抽提是去除蛋白质的一个非常有效的手段。
苯酚能使蛋白质变性,变性后的蛋白质从水相中被析出,处于苯酚中或者苯酚/水相之间。
PC抽提的关键是,一要混匀彻底,二要用量足够。
彻底混匀,才能确保苯酚与蛋白质的充分接触,使蛋白质完全变性。
许多人总是担心混匀的剧烈程度是否会对核酸,尤其是基因组DNA造成破坏,实际上大可不必如此小心。
剧烈的混匀操作,是会部分打断大分子的基因组DNA,但该破坏作用不会强烈
到DNA变成10kb以内的小片段。
手剧烈晃动混匀后,基因组DNA的片段,大部分会大于20kb,这个大小,除了一些特别的要求外,对PCR和酶切,都是完全适用的。
如果要求的片段非常大,如构建文库用,则不能使用剧烈的混匀方法,而只能来回温和颠倒混匀–此时的关键是:
裂解液的比例要足够大,使体系不要太粘稠。
用量要足够,是因为苯酚去除蛋白质是有一定的饱和度的。
超过了该饱和度,裂解体系中的蛋白质不会被一次去除,必须靠多次抽提,方可彻底去除。
另外,体系太粘稠的坏处是,蛋白质难以彻底去除,以及基因组DNA会断裂得更厉害,所以要注意裂解液与样品的比例。
4C离心操作有利于更彻底去除蛋白质。
PC抽提的另外一个用途是,利用酸性酚可以部分去除DNA的特点,在RNA抽提时获得DNA残留极少的RNA。
不过有一点要提醒的是,有些植物样品,在去除某些杂质之前,是不能使用PC抽提的,否则核酸必定降解。
高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法,同样也是一个非常不错的方法。
与PC抽提方法相比,除了纯度的稳定性可能要低一点外,该方法几乎克服了PC抽提的所有缺点。
更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是,可以用于大规模抽提,不足是纯度(蛋白质残留)不够稳定。
蛋白质的沉淀效率在4C会更好一些。
介质纯化方法,是一个越来越受到重视的方法。
其最大特点是非常适合大规模核酸抽提,并且因为受人为操作因素影响小,纯度的稳定性很高(虽然纯度不一定比PC纯化方法更高)。
其致命弱点是样品过量。
介质可以分为两大类,一类是柱式的,即介质被预先装填在下面是通的柱子里;另外一类则是颗粒状(如Glassmilk、磁性小珠等)。
颗粒状的介质的纯化操作与经典的醇沉淀差别不大,都是通过数次的加液-倒液过程,干燥后,溶解即可获得纯化好的核酸。
柱式纯化的操作虽然也是有加液-倒液过程,但因为加入的液体通过离心后会进入另外一个离心管中,与含有核酸的柱子完全是分开的,所以洗涤更彻底,操作更省力(不用操心将核酸倒掉了,或者液体的残留)。
不过,介质纯化方法的成本是最高的。
(三)醇的沉淀
1)沉淀的原理目的:
目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来,从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分离。
实际操作中,许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来,尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。
醇的沉淀并不是非常特异性的,任何有机大分子及一些盐,当浓度达到一定水平后,都可能同步被沉淀下来。
就核酸而言,标准的醇沉淀要求有一定的盐及某一比例的醇用量,但这决不是说这些盐是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。
实际操作中不难发现,当裂解体系中核酸的浓度达到一定水
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