豌豆无菌植株的建立.docx
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豌豆无菌植株的建立
实验一MS培养基母液的配制
一、实验原理
在植物组织培养中,不同的植物物种,每一种植物个体的不同组织部位所需的培养基不同,且每一种培养基的物质种类至少也要16种之多,如果每次配制培养都一种物质一种物质去称,需要花大量的时间,给研究带来极大的不便,而把这十多种物质分成不同的组,每一组有不同的物质,配成高浓度的母液,在每次配制培养基时只需从母液瓶中取一定数量的母液即可,因而进行母液的配制对于制备培养也就显得十分需要。
二、仪器设备
电炉、电子天平、烧杯、容量瓶、玻璃棒等
三、母液的分类
MS大量,MS微量,MS有机,MS钙盐,MS镁盐,MS铁盐,MS肌醇。
可以将它们适当分类。
四、实验步骤
成分
分子量
含量mg\L
大量元素
硝酸钾
101.11
1900
硝酸铵
80.04
1650
磷酸二氢钾
136.09
170
硫酸镁
246.47
370
氯化钙
147.02
440
微量元素
碘化钾
166.01
0.83
硼酸
61.83
6.2
硫酸锰
223.01
22.3
硫酸锌
287.54
8.6
钼酸钠
241.95
0.25
硫酸铜
249.68
0.025
氯化钴
237.93
0.025
铁盐
乙二胺四乙酸二钠
372.25
37.3
硫酸亚铁
278.03
27.8
有机成分
肌醇
100
甘氨酸
2
盐酸硫胺素 VB1
0.4
盐酸吡哆醇 VB6
0.5
烟酸VB5或VPP
0.5
蔗糖
342.31
30000
琼脂
8000
1.大量元素母液的配制
先用量筒称量适当蒸馏水放入500ml烧杯中,按照配方表中用量依次分别称取:
NH4NO3,KNO3,KH2PO4,MgSO4·7H2O,CaCl2·2H2O,待第一种化合物完全溶解后再加入第二种化合物,当最后一种化合物完全溶解后,将溶液转移至500ml容量瓶中,用蒸馏水定容至500ml,然后转移至细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称,放大倍数,配制日期,配制人,并置于冰箱中保存备用。
2.微量元素母液的配制
按照配方表中用量用电子天平依次称取MnSO4·4H2O,ZnSO4·7H2O,H3BO3,KI,Na2MoO4·2H2O,CuSO4·5H2O,CoCl2·6H2O,按制备母液I的方法逐个溶解,转移至容量瓶中,然后定容至500ml,转入细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称,放大倍数,配制日期,配制人,并置于冰箱中保存备用。
3.铁盐母液的制备
把FeSO4·7H2O和Na2-EDTA分别置于适量蒸馏水中,加热搅拌使之完全溶解,保持加热,把FeSO4倒入Na2-EDTA溶液中并搅拌,接近沸腾时停止加热,冷却后调PH到5.5,将溶液转移至500ml容量瓶中,用蒸馏水定容至500ml,转入细口试剂瓶中,用力振荡1~2min,贴上标签,注明母液名称,放大倍数,配制日期,配制人,后置于冰箱中保存备用。
4.有机化合物母液的制备
按配方表中用量依次称取:
维生素B,烟酸,甘氨酸,用蒸馏水溶解后定容后,转入细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称,放大倍数,配制日期,配制人,并置于冰箱中保存备用。
5.植物生长物质母液制备
NAA母液:
准确称取10mg,用少量1mol/LNaOH溶解后加蒸馏水定容至100ml,即配制成0.1mg/ml的NAA母液,转入细口试剂瓶中,贴上标签,注明母液名称,放大倍数,配制日期,配制人,并置于冰箱中保存备用。
五、注意事项
1、计算中仔细核对称取量与规定量和扩大倍数以及配置1升培养基所吸取的量。
2、称量时要对每种药品认真核对,计算准确。
3、对于硫酸铜和氯化钴要再次扩大,然后从更浓溶液中吸取一定量以达到所需的量。
4、对于铁盐的溶解与定容要首先将二者先分别溶解之后再定容。
5、每一种母液瓶标签制作要符合要求,上面要标明母液种类、物质名称、物质称取量以及制备1升培养基吸取的毫升数,制备日期和制备人姓名。
4、最后母液要贮存于冰箱,在4摄氏度左右保存,一个月之内要用完。
实验二培养基的制备与灭菌
一、实验目的
培养基是植物组织培养的物质基础,也是组织培养能否成功的
关键因素之一。
学习母液法配制培养基以及掌握培养基灭菌的方法。
二、实验用具
1.用具:
天平、电炉、搪瓷盆、玻璃棒、pH试纸、三角瓶、量筒、烧杯、药匙。
2.药品:
糖、琼脂、氢氧化钠溶液、氯化氢溶液、各种母液。
三、实验内容
1.各种母液的配制
2.各种激素的配制
3.培养基的配制
4.培养基的灭菌
四、实验步骤
1.将所需的各种母液按顺序放好,将烧杯,量筒,移液管,玻璃棒用蒸馏水润洗4-5次,以待备用。
2.取250ml烧杯一个,将大量、有机、肌醇、镁盐,钙盐、按配方表中的用量依次称取并倒入烧杯中。
3.取50ml烧杯一个,将微量和铁盐按配方表中的用量称取并倒入烧杯中。
4.取瓷盆一个,加入300ml蒸馏水,置于电磁炉上加热,称量琼脂6克,白砂糖40克,依次倒入瓷盆中,待琼脂和白砂糖完全溶解后,将称量好的所有母液倒入瓷盆中,用玻璃棒不断搅拌,并定容至1L。
5.用1mol/LNaOH调PH至5.8。
6.把培养基分装到广口瓶中,用牛皮纸包扎好,待灭菌。
7.培养基灭菌(0.105~0.12MPa,不得超过0.14MPa,15~20min)
五、主要注意事项
①在使用提前配制的母液时,应在量取各种母液之前,轻轻摇动盛放母液的瓶子,如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染,应立即淘汰这种母液,重新进行配制;
②用量筒或移液管量取培养基母液之前,必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次;
③量取母液时,最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上,量取1种,划掉1种,以免出错。
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9g、蔗糖30g,放入1000mL的搪瓷量杯中,再加入蒸馏水750mL,用电炉加热,边加热边用玻璃棒搅拌,直到液体呈半透明状。
然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中,最后加蒸馏水定容至1000mL,搅拌均匀。
吸取量×稀释倍数=1000.
需要注意的是,在加热琼脂、制备培养基的过程中,操作者千万不能离开,否则沸腾的琼脂外溢,就需要重新称量、制备。
此外,如果没有搪瓷量杯,可用大烧杯代替。
但要注意大烧杯底的外表面不能沾水,否则加热时烧杯容易炸裂,使溶液外溢,造成烫伤。
调pH用滴管吸取物质的量浓度为1mol/L的NaOH溶液,逐滴滴入溶化的培养基中,边滴边搅拌,并随时用精密的pH试纸(5.4~7.0)测培养基的pH,一直到培养基的pH为5.8为止(培养基的pH必须严格控制在5.8)。
培养基的分装溶化的培养基应该趁热分装。
分装时,先将培养基倒入烧杯中,然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶(50mL或100mL)中。
注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。
锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5~1/4。
每1000mL培养基,可分装25~30瓶。
培养基分装完毕后,应及时封盖瓶口。
用2块硫酸纸(每块大小约为9cm×9cm)中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口,并用线绳捆扎。
最后在锥形瓶外壁贴上标签。
实验三豌豆无菌植株的建立
一、实验目的
学习并掌握在超净工作台上接种的方法及注意事项。
二、实验原理
植物细胞具有全能型,其外植体接种在无菌的人工培养基上,能长成完整的无菌植株。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1.仪器设备:
超净工作台、培养基3个,大号镊子,剪刀,酒精灯,喷雾器,烧杯
2.试剂:
75%酒精,升汞,无菌水,灯酒
3.实验材料:
豌豆种子
四、实验步骤
1.接种前,用75%酒精擦拭超净工作台,将接种工具放入超净工作台,房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯,照射约20min,然后关闭紫外灯打开换气扇,通风20min后即可进行接种工作。
2.外植体消毒,将选好的豌豆种子放入广口瓶中,先加入适量84消毒液,一直摇动,消毒2~3次,然后再用HgCl消毒2~3次,不停地摇动,最后用无菌水润洗3次,备用。
3.接种,先用酒精喷雾器清洗双手及待接种的培养基,左手拿培养基,在酒精灯上方取掉棉塞,然后右手拿镊子,从消毒好的广口瓶中取豌豆种子,一个培养集中接5~6个,然后再酒精灯上方慢慢塞上棉塞,至三瓶接种完后,将实验器具放入75%酒精中浸泡,然后取出接好的培养基,包扎标号。
六、实验结果及分析
实验四豌豆根、茎、叶愈伤组织的建立
一、实验目的
学习并掌握诱导愈伤组织的方法及根、茎、叶不同植物器官的接种方法。
二、实验原理
植物体上切割分离的用于离体培养的细胞、组织或器官,接种到培养基上,在离体培养条件下,能形成一团无极性、能旺盛分裂的薄壁细胞团。
三、实验材料、试剂和仪器设备
1.仪器设备:
超净工作台、培养基3个,大号镊子,剪刀,酒精灯,喷雾器,烧杯。
2.试剂:
75%酒精。
3.实验材料:
无菌豌豆植株的根、茎、叶。
四、实验步骤
1.培养基制备,具体方法同实验一培养基制备相同,但是这次的培养集中必须加入生长激素—6–BA和4,培养瓶比实验一的小,制好后,备用。
2.接种前,用75%酒精擦拭超净工作台,将接种工具放入超净工作台,房间用酒精喷雾降尘后打开超净工作台紫外灯,照射约30min,然后关闭紫外灯打开换气扇,通风20min后即可进行接种工作。
3.接种,先用酒精喷雾器清洗双手、待接种的培养基及含有无菌植物的培养基,先用剪刀将豌豆植株的根、茎、叶剪下来,①叶片大小适中,一个培养基上接3~4片,接上后,要用镊子将叶片的边缘刮出少许伤口,有利于产生愈伤,②茎长0.5cm左右,一个培养基上接3~4个,③根的长度0.5cm左右,一个培养基上接3~4个,然后用镊子轻轻刮掉表面的愈伤。
4.接种完毕后,将实验器具放入75%酒精中消毒,取出接种好的培养基,包扎、编号,然后放在培养架上培养。
五、实验结果及分析
根
根的愈伤组织
茎
茎的愈伤组织
叶
叶的愈伤组织
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- 豌豆 无菌 植株 建立