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细菌耐药机制的研究进展及抗菌药物的新研究概要

夜大本科毕业综述

细菌耐药机制的研究进展及抗菌药物的新研究

学生姓名:

刘妮

指导教师:

魏殿军

专业:

医学检验

班级:

09检验本科

学号:

0931051

定稿日期2011年2月20日

天津医科大学夜大学___09____级专升本毕业综述评审表

60分以下。

细菌耐药机制的研究进展及抗菌药物的新研究

刘妮北京京煤集团总医院

【摘要】:

全球性的细菌抗生素耐药是近年来感染性疾病治疗所面临的一大难题,细菌可对某类抗菌药物产生耐药性,也可同时对多种化学结构各异的抗菌药物耐药。

随着各种新型抗生素在临床的应用,细菌的耐药也越来越广。

细菌耐药已成为一个全球性的问题,各国学者对细菌耐药机制进行了深入的研究,并有大量文献报道,但是细菌的耐药机制十分复杂,随着科学技术尤其是分子生物学的快速发展和应用,细菌的耐药机制也得到了进一步的阐明。

为了解决日益严重的微生物耐药问题,众多新的技术方法被应用到抗菌药物研究领域:

在发现药物靶位方面,比较基因组学研究方法和蛋白质组学研究方法得到广泛应用;同时抗菌药物的研究范围进一步扩大到噬菌体领域,能够直接杀伤病原微生物的噬菌体、噬菌体蛋白以及可以携带抗菌药物或致死性基因的噬菌体载体被成功用于治疗细菌性感染。

本文拟对细菌耐药机制、抗菌药物作用机制及等方面及抗菌药物的研究近年来在寻找新的药物靶位、探索新的筛选策略以及拓展新的研究领域方面所应用的一些新方法等内容作简要综述。

【关键词】:

细菌耐药性、耐药机制、抗生素、药物靶位、噬菌体

细菌多重耐药现象日益严重,耐药机制也趋于复杂,主要有以下几种耐药机制:

遗传耐药机制和获得耐药机制,例如:

固有耐药、染色体突变、细菌的灭活酶或钝化酶、细菌膜基因改变而形成的外排泵出系统、细菌生物膜的形成,抗生素的作用机制等。

因此分析研究细菌耐药机制、耐药基因的传播与转移,掌握细菌耐药性的变迁,以减少耐药性的产生已成为一个重要的课题。

随着抗生素的广泛使用,微生物的耐药问题日趋严重,然而近40年来新抗生素的发现速度明显放缓,只有一种新结构的脂肽类抗生素达托霉素（daptomycin成功用

于临床[1]。

科学技术的快速发展为细菌耐药机制新的研究提供了更多新的技术方法,将这些新的研究应用到药物研究领域,将有助于加快抗菌药物研发的进度,研发出全新的针对病原菌的抗菌药物。

1.细菌耐药性的定义:

细菌的耐药性又称抗药性【2】,即有些人长期应用抗菌药物后,由于病原体通过各种方式使药物作用减弱,如产生使药物失去作用的酶,改变膜通透性阻滞药物进入,改变靶结构或改变原有代谢过程等。

这些方法都能使病原体对药物产生抵抗性能,亦即抗药性。

换句话说,耐药性就是细菌在药物高于人类接受的治疗剂量浓度下能生长繁殖的性能【3】。

细菌的耐药可能与整个种的固有特性有关,也可能出现在正常敏感菌种内,通过变异或者基因转移获得【4】。

耐药基因决定了各种各样的机制,使细菌抵抗特定抗菌药物的抑制作用。

2.细菌对抗菌药物的耐药机制:

2.1遗传耐药机制:

【5】①固有耐药;②染色体突变式获得新的DNA分子。

2.1.1固有耐药:

在长期进化过程中,为适应不利环境,经过优胜劣汰,微生物已获得了抵抗多种不利因素的能力。

一些微生物如放线菌、真菌等可合成适量抗生素以杀灭周边的细菌而获得更有利于自己生存的环境。

周边的这些细菌也为了适应环境,在长期抗生素压力下通过诱导突变,对抗生素产生了抵抗力。

这种耐药有种属特异性,来源于该细菌固有的自然特性,耐药基因存在于染色体上。

例如:

非发酵的G-杆菌如绿脓杆菌、醋酸不动杆菌、假单胞菌属及大多数G-杆菌耐万古霉素和甲氧西林;肠球菌耐头饱菌素;厌氧菌耐氨基糖甙类药物;铜绿假单孢菌耐头孢氨苄、头孢克洛、头孢噻肟、头孢呋辛、四环素;嗜麦芽窄食假单孢菌耐泰能、美平等,这些是耐药性产生的原始遗传基础。

这种高度固有耐药性是由于菌体外膜的通透性低与继发的双重耐药机制（诱导产生头孢

菌素酶和抗生素导出泵所致。

2.1.2染色体突变式获得新的DNA分子:

染色体突变是细菌耐药性产生的原始遗传基础,质粒的产生和传播是细菌扩散耐药性、新菌株获得耐药性的一种快捷方式。

突变可发生于DNA分子（如结核杆菌点突变致对利福平耐药,淋球菌点突变致对苯唑西林耐药可发生于质粒和转座子的基因上。

如质粒编码产生的超广谱β-内酰胺酶（ESBL可能由于TEM和SHV酶基因点突变导致,若酶基因连续突变可从本质上增强酶的活力,使新一代头孢菌素灭活。

某些DNA调节区共同的突变可产生头孢菌素酶,致对第三代头孢菌索耐药。

耐药菌株在长期进化过程中可能通过染色体断裂或缺失,使带有耐药基因的DNA片段脱离形成耐药性质粒,通过质粒的转移和插入堆积,使耐药性在不同菌株间传播,使同一菌株抗菌谱扩大。

2.2获得性耐药机制:

【6】①产生灭活酶或钝化酶,使抗菌药物失活或结构改变;②抗菌药物作用靶位改或数目改变,使之不与抗菌药物结合;③改变细菌细胞壁的通透性,使之不能进入菌体内;④通过主动外排作用,将药物排出菌体之外;⑤细菌分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包绕形成而细菌生物被膜。

这些耐药机制不是相互孤立存在的,两个或更多种不同的机制相互作用决定一种细菌对一种抗菌药物的耐药水平。

2.2.1细菌产生灭活酶或钝化酶细菌可产生灭活酶或钝化酶,并以此来破坏各种抗菌药物。

目前,细菌产生的灭活酶或钝化酶主要是β-内酰胺酶、氨基糖甙类抗菌药物钝化酶、氯霉素乙酰转移酶和大环内酯类-林克霉素类-链阳菌素类（MLS类抗菌药物钝化酶,其中人们对β一内酰胺酶研究最为深入。

多数临床常见致病菌可产生β-内酰胺酶,由革兰阳性菌产生的β-内酰胺酶以葡萄球菌属产生的青霉素酶最重要,而在革兰阴性菌中,超广谱β-内酰胺酶（ESBLs【7】愈

来愈受到重视。

主要由肠杆菌科细菌如肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌等细菌产生的ESBLs对甲氧亚氨基β-内酰胺类抗菌药物如头孢他啶、头孢噻肟以及单氨类抗菌药物如氨曲南等药物一种或多种耐药,Es-BLs大部分由质粒介导,包括TEM型及SHV型衍生的β-内酰胺酶、PER型酶、CTX型酶及K1、TOHO-1、MEN-1、VEB-1等型酶【8-10】。

β-内酰胺酶大多数由质粒、转座子、整合子等可移动性遗传元件介导,因此易于在同种或不同种细菌间传播。

质粒是染色体的遗传物质,耐药质粒广泛存在于G-、G+菌中,耐药性质粒可通过转导、转化、接合及转座4种方式进行传递或转移;转座现象是细菌耐药性播散的重要方式,可使耐药因子增多造成多重耐药性,带有多重耐药基因的质粒,从一种微生物进入另一种微生物,不断传给后代还可转移至无此质粒的细菌,使敏感菌变为耐药菌。

2.2.2细菌药物作用靶位改变β-内酰胺类是临床最常用的抗菌药物,其作用靶点是青霉素结合蛋白（penicillinbindingproteins,PBPs【11】。

目前研究发现的由PBPs改变而引起的耐药细菌主要有葡萄球菌、肺炎链球菌以及铜绿假单胞菌、不动杆菌属、流感嗜血杆菌、淋病奈瑟球菌等革兰阴性（G-细菌。

当β-内酰胺类药物以共价结合的方式使正常的4种主要PBPs失活,PBP2a可替代完成细胞壁合成的功能,从而产生耐药。

2.2.3细菌细胞膜渗透性改变细菌细胞膜与细胞的细胞膜相似,是一种具有高度选择性的渗透性屏障。

细胞外膜上的某些特殊蛋白,即膜孔蛋白（porin[12]是一种非特异性的、跨越细胞膜的水溶性扩散通道。

抗菌药物也可通过这些膜孔蛋白进入菌体内部,发挥效用。

药物的长期作用,细菌改变了外膜蛋白,使菌体外膜通透性下降,阻碍抗生素进入细胞内膜靶位。

外膜通透性降低是由于膜孔蛋白的缺陷、多向性突变、特异性通道的改变及膜脂质双层的改变所致。

常见于假单孢菌、醋酸不动杆菌、肠球菌等对B一内酰胺类、氨基糖甙类、氯酶

素、喹诺酮类抗生素的耐药。

2.2.4细菌主动药物外排机制药物外排系统的耐药机制的研究源于20世纪80年代关于大肠埃希菌对四环素耐药机制的研究,随后是金黄色葡萄球菌对镉耐受性机制的研究。

细菌主动药物转运系统根据其超分子结构、机理和顺序的同源性等可以将其分为四类【13】:

主要易化（Mr家族,耐药小节分裂（RND家族,链霉素耐药或葡萄球菌多重耐药家族及ABC（ATP—bindingcassette,ATP结合盒转运器。

细菌依靠主动外排泵出机制来减少细菌内药物浓度,人们相继发现了依赖能量的外排喹诺酮、大环内酯类和氯霉素等系统,这些外排系统都是“单”基因编码的抗一种或一类抗生素的“单”药系统近年来,发现了由一个操纵子调控的多重耐药外排系统,具有耐不同抗生素的能力。

现已表明,铜绿假单胞菌有3套外排泵出系统,即MexAB-oprM、MexCD-oprJ、MexEF-oprN,目前研究最多的是MexAB-oprM【14】,MexAB-oprM在生理条件下的阻遏蛋白为MexR基因所编码的产物,MexR的突变株导致MexAB-oprM脱抑制而表达增强,从而形成耐药。

其中oprM是外膜运出蛋白,Zhao等认为在MexAB-oprM外排泵出系统中更为重要的是oprM。

Kohler等用环丙沙星和氯霉素作为选择试剂培养铜绿假单胞菌,得到了多重耐药菌株,它过度表达一个相对分子质量为5O×1O3的外膜蛋白,证实其完整结构为MexEF-oprN【15】。

2.2.5细菌生物被膜的形成细菌生物膜（binfilm,BF是指附着于有生命或无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织的细菌群体。

BF中含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物等。

因此,BF中存在各种主要的生物大分子如蛋白质、多糖、DNA、肽聚糖和磷脂等物质。

与浮游菌相比。

BF细菌对抗生素的抗药性可提高l0~1000倍。

BF细菌抗药性主要取决于其多细胞结构:

（1BF中的胞外多糖起屏障作用,限制抗生索分子向细

菌运输。

（2BF中微环境的不同可影响抗生素的活性。

（3BF细菌表面生长可诱导细菌表达出与浮游细菌不同的基因,诱导产生BF特异性表型。

（4多菌种BF中各菌种的协同作用。

具有生物膜的细菌多见于铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变异链球菌。

3.抗菌药物的作用机制:

3.1β-内酰胺类抗生素作用机制:

β-内酰胺类抗生素包括青霉素类、头饱菌素类、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类、β-内酰胺酶抑制剂等,该类药物主要是阻碍细菌细胞壁的合成,致细胞壁缺损,水份内渗、细菌肿胀、坏死,青霉素结合蛋白（peni—cillinbindingproteins,PBP是细菌细胞壁合成酶,当β-内酰胺类抗生素与PBP结合后PBP失去活性,细胞壁合成受阻,细胞死亡。

而人类细胞无细胞壁,故不受其影响。

3.2氨基糖甙类抗生素的作用机制:

抑制细菌细胞膜蛋白质的合成并改变膜结构的完整性而发挥杀菌作用。

通过细菌细胞外膜扩散后与其内（细胞质膜上具有跨膜摄取功能的一种能量依赖转运系统“I相转运”蛋白结合,敏感细菌与其胞膜相连的核蛋白体30S亚基的高亲和力位置上不断集聚药物,由此触发第二种能量依赖性转运系统“Ⅱ相转运”明显加速药物在细胞内集聚,抑制细菌蛋白质合成,破坏细胞质膜结构,致细菌内容物外漏致细菌死亡。

尚有研究表明该类药物作用靶位是核糖体RNA。

3.3喹诺酮类药物抗菌机制:

DNA拓扑异构酶有I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ,拓扑异构酶I、Ⅲ,参与DNA的松解,对喹诺酮类不敏感,Ⅱ又称促旋酶,参与DNA超螺旋形成。

DNA促旋酶催化DNA超螺旋和连锁的分离、复制姐妹染色体,在复制循环的末尾拓扑异构酶Ⅳ通过解开姐妹复制子连环体,分离染色体而引起超螺旋DNA的松弛[16]。

DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ是细菌生长所必需的酶,其中任一种酶受到抑制

都将抑制细胞生长、最终导致细胞死亡。

喹诺酮类药物作用靶位是细菌DNA拓扑异构酶,对G-菌主要作用于拓扑异构酶Ⅱ,而对G+菌拓扑异构酶Ⅳ是第一靶位,妨碍细胞DNA复制、转录,以达杀菌目的。

3.4大环内酯类抗菌机制:

大环内酯抗菌素属于抑菌剂,高浓度对敏感菌有杀菌作用。

作用机制:

透过细菌细胞膜与细菌核糖体的23SRRNA亚基可逆性结合,阻断转移核糖核酸,同时阻断多肽链的转移,抑制细菌依赖于RNA的蛋白质合成。

4.抗菌药物的新研究

4.1寻找全新药物靶点抗菌药物研究的瓶颈之一是已知药物靶位有限。

据统计,目前所有临床应用的药物,得到证实的靶位只有300~500个,抗菌类药物的靶位更是寥寥无几,一旦这传统抗菌药物的作用靶位发生结构改变或者微生物产生了弥补靶位功能的替代途径,作用于该靶位的药物将全部失效。

因此,发现全新的药物靶位,在靶位上实现突破,是加速新药研发的关键。

4.1.1比较基因组学方法寻找全新药物靶位比较基因组学（comparativegenomics是基于基因组图谱和测序技术基础上,对已知的基因和基因组结构进行比较以了解基因的功能、表达机制和物种进化的学科。

1995年,第一个致病菌的全细胞基因组———流感嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae基因组破译完成,随后,众多致病微生物的全基因组陆续完成测序工作。

4.1.1.1寻找病原菌的致病性相关基因靶位在全基因组水平上寻找病原体毒力差异的原因,是比较基因组学方法在药物靶位研究领域的重要应用。

Schoen等【17】则通过对致病脑膜炎奈瑟菌（Neisseriameningitidis及非致病性脑膜炎双球菌全基因组进行比对,发现了一系列与毒力相关的基因序列。

毒力相关基因的发现,为采取有针对性的治疗措施,开发特异性阻断毒力形成的全新作用机制药物提供了新的靶位。

4.1.1.2寻找微生物特有基因靶位以某种致病微生物特有的基因为靶位设计的药物,靶向性高、毒副作用小。

Sakharkar【18】等从NCBI网站上下载了铜绿假单胞菌（Paeruginosa与人类基因的开放读码框序列,比对获得了大量非同源序列,随后,他们将获得的非同源序列与铜绿假单胞菌必需基因数据库信息进行比对,结果共发现了306个潜在的必需基因靶位。

4.1.1.3寻找广谱抗生素作用靶点除了寻找差异序列外,寻找种内或种间的同源序列,同样可以获得大量的潜在药物靶位信息。

人们已经利用比较基因组学的方法,找到了大肠埃希菌与支原体同源的26个基因开放读码框,他们利用基因敲除的办法验证这些基因的必需性,结果在这些序列中共发现了6个大肠埃希菌必需基因,进一步研究发现在芽孢杆菌中也存在与这6个基因同源的必需基因。

由于这些基因在微生物界广泛存在且同源,它们有可能成为广谱抗菌药物的新靶位。

4.1.2基因芯片技术在寻找新基因靶位中的应用将致病微生物的全部基因集成在一张基因芯片上所建立的病原体基因表达模型,可以检测药物作用前后基因表达水平上的差异,发现潜在的药物作用靶位。

药物毒性相关基因的发现,为设计特异性更强、不良反应更小的药物提供了良好的靶位。

4.1.3蛋白质组学研究方法在发现新靶点中的应用与基因组学方法类似,蛋白质组学研究方法通过比较不同条件下（不同生长阶段、药物作用前后等细胞产生蛋白的种类、数量的不同来研究各蛋白在生命周期中发挥的作用以及药物的作用机制,二维电泳技术（22DPAGE是蛋白组学研究方法的关键技术。

微生物在不同的生长条件下,为了更好地生存,必须随着环境的改变进行适当的自身调整,部分基因开启或上调,部分基因关闭或下调,在蛋白水平上表现为蛋白的种类和数量的改变。

提取不同生长条件下细胞中的蛋白进行二维电泳,可以得到不

同条件下的蛋白表达变化数据,研究这些发生改变的蛋白在细胞生命周期中发挥的作用,有可能找到合适的药物作用靶点。

4.2改变筛选策略—寻找非传统意义抗菌药物4.2.1寻找自然界中存在的超低浓度抗生素自然界中存在很多低浓度的抗菌物质,但是传统的分子、细胞模型都由于其灵敏度低而漏筛了这部分化合物,其中很可能存在全新作用机制的抗生素。

经过对从世界各地采集来的83000株菌在3种不同培养条件下发酵获得的250000个发酵液进行筛选,Wang等【19】发现了全新结构的抗生素—platensimycin。

4.2.2寻找克服广谱耐药机制、抑制毒力形成、提高宿主免疫力等辅助性药物微生物产生多重耐药性,主要的原因有微生物的外膜通透性发生改变,产生了可以对药物进行修饰灭活的酶或过量表达可以将药物排出体外的外排泵蛋白等。

因此,通过改变外膜的通透性,抑制修饰酶或者外排泵蛋白活性,可以逆转微生物耐药性,使其重新对抗生素变得敏感。

4.3拓展全新研究领域—噬菌体技术在抗菌药物研究领域中的应用抗生素类药物本身存在很多不足之处,如靶位特异性差而存在较大的毒副作用,某一类抗生素的广泛使用引起微生物的耐药等。

与抗生素类药物不同，噬菌体是特异性感染细菌的一类原核生物病毒，具有抗菌活性高和宿主特异性强等优点。

但是噬菌体不能直接作为药物使用，其主要原因包括:

噬菌体是一种病毒，对人类自身构成潜在威胁;人体免疫系统可以识别并清除噬菌体,使其很快失去效力;单独使用时,致病菌很快形成对噬菌体的耐受等。

解决这些问题可以通过：

4.3.1完整噬菌体作为抗菌药物作为抗菌药物的噬菌体必须符合以下两点要求:

第一,为了减少对人体自身构成的潜在威胁,必须保证其具有高度的宿主

特异性;第二,为了有效杀死体内的致病菌,必须保证其在人体内的停留时间足够长。

因此,寻找宿主特异性强、体内停留时间长的噬菌体,成为科学家们首先考虑的问题。

相关实验已分离得到可以在小鼠体内长期停留的噬菌体突变株E.coliphageA和Sa.typhimuriumphageP22,这些突变株在宿主体内的免疫清除速度明显减缓,足以满足治疗所需时间。

实验证明,这些突变噬菌体与野生型相比,毒性更小、特异性更强、体内停留时间更长、治疗效果更好,具有成为潜在抗菌药物的可能。

4.3.2噬菌体中的有效杀菌成分为了克服噬菌体的免疫原性以及细菌对完整噬菌体快速形成的抗性,人们设想只利用噬菌体中真正发挥作用的某种成分作为抗菌药物,这样既保持了噬菌体杀菌活性,又不足以激起免疫反应。

随着对噬菌体侵染细菌过程认识的加深,人们发现了这种成分,噬菌体在侵染细菌过程中合成了一种可以使细胞壁裂解的酶Phagelysins,这种酶的唯一靶点是肽聚糖上的糖链表位,而这又是决定肽聚糖活性的关键结构,所以理论上讲细菌无法产生耐药突变株,更令人鼓舞的是该酶不是人体的免疫原,解决了长期使用产生抗体的问题。

这些活性成分非噬菌体本身,不具有自我复制或与人体基因组整合的能力,所以排除了对人类自身构成的潜在威胁,又由于其克服了噬菌体的免疫原性及微生物的耐药性,极有可能成为全新作用机制的抗菌药物。

4.3.3噬菌体作为抗菌药物携带载体除了利用噬菌体本身的杀菌活性外,科学家又尝试把噬菌体作为药物的载体。

一种方法是直接将抗菌药物连接在噬菌体上,利用噬菌体与宿主细菌之间的特异性,提高了抗生素的局部浓度,实现杀死耐受常规剂量药物细菌的目的。

另一种方法是利用噬菌体将外源致死性基因注入细菌内并表达成杀菌蛋白,在细胞内部杀死细菌[20]。

5.结语

细菌耐药机制复杂．多种耐药机制可协同作用。

因此仍需对许多问题，如质粒介导的ESBLs的特性、生物膜在细菌耐药机制中的作用、药物作用靶位及突变方式的差异、主动外排泵出系统的地位等进行深入的研究．为临床合理用药及探讨防止细菌耐药的途径提供依据。

同时，微生物快速形成的耐药性也迫使人类不断研发新的抗菌药物,而新的技术方法在抗菌药物研究领域的成功应用成为人类战胜致病微生物的关键。

目前,比较基因组学方法、蛋白质组学方法已经成为发现全新药物靶位的重要手段。

而随着抗菌药物研究领域的进一步扩展,微量抗生素,克服微生物耐药机制、抑制微生物毒力形成、提高宿主免疫功能等的辅助性药物也已经成为抗菌药物研究的新热点。

噬菌体及其相关产品在治疗细菌感染性疾病中取得的成功,更是使抗菌药物研究向前迈进了一大步。

有理由相信,随着科技的进步,更多对细菌耐药机制的新研究会被应用到抗菌药物研发领域,抗菌药物研究将取得更大的突破,人类也将在与致病微生物的斗争中重新掌握主动权。

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