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互叶白千层的快繁技术
互叶白千层的快繁技术
摘要:
为研究出一套完整的互叶白千层快繁技术体系,以互叶白千层幼苗茎段为外植体,分别以诱导率、增殖倍数、生根率为指标,采用正交试验对芽诱导培养基、丛生芽增殖培养基、生根培养基进行优化。
结果表明,最佳诱导培养基为MS+0.01%活性炭+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA,诱导率为82.8%;最佳增殖培养基为MS+30g/L蔗糖+0.25mg/L6-BA,增殖倍数为31倍;最佳生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+0.1mg/LNAA,生根率达100%,移栽30d后成活率达80%以上。
研究结果为互叶白千层的工厂化育苗提供了技术参考。
关键词:
互叶白千层;快速繁殖;正交试验;芽诱导;丛生芽增殖;生根
中图分类号:
Q945.51文献标志码:
A
文章编号:
1002-1302(2015)03-0020-04
互叶白千层(Melaleucaalternifolia)为桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(Melateuca)常绿小乔木,原产于澳大利亚的新南威尔士州和新西兰的部分地区[1],是近年我国成功引进的高价值经济植物及绿化树种。
互叶白千层对污染物有很强的净化能力[2-4],可用于构建植物浮床[5]。
互叶白千层的新鲜枝叶和树干提取的精油俗称茶树油,可以高效、无毒、无刺激地杀死人体皮肤表面的真菌和细菌[6-9],并对某些病毒也有抑制作用[10-11],是一种强效的抗菌剂[12-17]、杀虫剂[18-20]、芳香剂[21]、防腐剂[22],是不可多得的天然保健医药材料,广泛应用于制药、日化、食品、香料等行业。
因此,种植互叶白千层具有巨大的生态和经济效益。
目前,国内外对互叶白千层的研究主要集中在其精油的提取、成分分析及作用等方面[23-24],而对利用组织培养技术进行再生植株的研究较少,目前尚没有完整的快繁技术体系。
依据精油化学成分含量的不同,互叶白千层分为6种[25],其中仅松油醇-4型优良品种提取的精油成分满足国际标准[26]。
为获得品种优良的互叶白千层,使用种子繁殖多败育,发芽率很低[27],且后代易产生变异,难以保持亲本优良性状;扦插繁殖生根率虽高[28],但成活率较低[29]。
组织培养既可以保持亲本的优良性状,又可以将获得的优良株系快速推广应用于生产,有望成为互叶白千层产业化育苗的主要繁殖手段。
本试验以互叶白千层茎段为材料,进行表面灭菌处理,对诱导培养基、增殖培养基、生根培养基进行筛选,并对试管苗驯化移栽,拟建立一套完整的互叶白千层快繁技术体系,为互叶白千层的优株选育提供理论依据,为其工厂化育苗提供技术参考。
1材料与方法
1.1材料
互叶白千层为温室栽培植株,株高20cm,由江西抚州市森源生物科技有限公司提供。
1.2仪器
W-CJ-2FD洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司生产),LMQJ型立式灭菌锅(山东新华医疗器械股份有限公司生产),JY2002电子分析天平(精密科学仪器有限公司生产),JA1003N电子天平(精密科学仪器有限公司生产)。
1.3方法
1.3.1外植体的表面灭菌及预处理培养60d的温室种植的互叶白千层幼苗,株高30cm,在20cm处去顶。
30d后,随机剪取5cm的幼苗茎段,剪去部分叶片,用洗衣粉液浸泡30min,流水冲洗2h;70%乙醇处理30s,无菌水洗3次,然后用0.1%HgCl2处理3min,无菌水洗4次,待用;去掉茎段顶部,剪取约1cm、含4~5个节点的茎段,接种到诱导培养基中。
为了降低酚类物质氧化褐变引起的生长抑制,在第3天将茎段转接到新的培养基中。
1.3.2诱导培养基的优化采用3因素4水平L16(43)正交试验。
各因素水平见表1。
共16组固体培养基,每组8瓶,每瓶5个茎段;30d后统计长芽的外植体数、芽数,并计算诱导率。
诱导率的计算公式如下:
诱导率=诱导出芽的外植体数÷接种的外植体数×100%。
1.3.3增殖培养基的优化采用3因素4水平L16(43)正交试验。
各因素水平见表2。
共16组液体培养基,每组16瓶,每瓶5个诱导出单芽的茎段;60d后统计丛生芽数,并计算增殖倍数。
增殖倍数的计算公式如下:
增殖倍数=丛生芽数÷接种的外植体数×100%。
1.3.4生根培养基的优化采用4因素3水平L9(34)正交试验。
各因素水平见表3。
共9组固体培养基,每组10瓶,每瓶5个幼枝茎段;30d后统计生根的外植体数,并计算生根率。
生根率的计算公式如下:
生根率=生根的外植体数÷接种的外植体数×100%。
1.3.5移栽生根培养30d后,将试管苗转移到室外炼苗,散射光光照培养10~20d,当组培苗抽高生长,木质化程度加强时,即可移栽。
取出试管苗,清洗根部,再用0.1%高锰酸钾溶液消毒30s,自来水清洗除去残留的高锰酸钾,然后把试管苗移栽至含基质(泥炭∶[KG-*3]珍珠岩=1∶[KG-*3]1)的花盆里,遮阳网遮阳,将1L的塑料饮料容器底部剪掉,罩在试管苗上,保持幼苗周围湿润。
14d后,遮阳网部分移除,容器一侧抬起以露出植物。
再过7d后,遮阳网移除,移走容器。
移栽30d后统计成活率。
1.4培养条件
温度(25±2)℃,光照12h/d,光照强度2500~3000lx。
诱导培养基、增殖培养基和生根培养基的基础培养基均为MS培养基,通过添加各种不同浓度的激素或蔗糖、MS成分减半进行优化;固体培养基中加7.0g/L琼脂,调pH值为5.8;液体培养基不加琼脂,不调节pH值,实际测得pH值为5.2。
2结果与分析
2.1诱导培养基的优化
互叶白千层茎段在诱导培养基上培养30d,统计结果见表4。
极差分析表明,3个因素对互叶白千层芽诱导的影响大小依次为:
NAA>活性炭6-BA。
随着NAA浓度的增加,诱导率呈下降趋势;当活性炭浓度为0.01%、6-BA浓度为0.1mg/L、NAA浓度为0.05mg/L时,诱导出芽数是2.46个,诱导率是82.8%。
方差分析表明,3个因素对诱导率及芽数无显著影响(表5、表6)。
芽诱导主要是已有芽原基在解除顶端优势之后的萌发。
本试验结果表明,不同培养基对外植体的诱导率及芽数无显著影响,最佳诱导效果的培养基为:
MS+0.01%活性炭+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA。
2.2增殖培养基的优化
互叶白千层芽诱导后在液体培养基中增殖培养60d,增殖倍数的统计结果见表7。
极差分析表明,3个因素对互叶白千层芽增殖的影响大小依次为:
NAA>6-BA>蔗糖。
随着NAA浓度的增加,增殖倍数呈下降趋势,当NAA浓度为0时增殖倍数最高。
随着6-BA浓度的增加,增殖倍数先增大后减小,当6-BA浓度达0.250mg/L时增殖倍数最高,这可能是由于低浓度的6-BA促进细胞分裂,而高浓度的6-BA则抑制细胞分裂。
随着蔗糖浓度的增加,增殖倍数先增大后减小,当蔗糖浓度达30g/L时,增殖倍数最高。
方差分析表明(表8),NAA对增殖倍数影响达显著水平(P<0.05)。
互叶白千层芽增殖的最佳培养基组合为:
MS+30g/L蔗糖+025mg/L6-BA,增殖倍数达31倍。
List等采用单因素试验获得的增殖培养基为MS固体培养基+1.0mg/LBA,培养时间为63d,增殖倍数为5.5倍[30]。
DeOliveira等同样用单因素试验获得的增殖培养基为MS液体培养基+0.25mg/LBA,培养时间为56d,增殖倍数为118倍[31]。
樊吉尤等用不同激素组合进行试验,结果表明较好的激素组合是0.8mg/L6-BA+0.01mg/L2,4-D,增殖倍数为14.88倍[32]。
本研究通过正交试验,获得了最佳的增殖培养基,增殖倍数达31倍,而且丛生芽较粗壮,呈深绿色(图1-C),结果显著好于已往报道。
主要原因有:
(1)互叶白千层通常生长在沼泽中[33],喜酸性或微酸性土壤[34-35],本试验使用的液体培养基,pH值为5.2,适合其生长;
(2)以往研究一般在培养基中仅添加NAA,本试验将其设定为因素之一,结果表明,NAA与增殖倍数呈负相关,不加NAA的第6处理的培养基效果最佳;(3)本试验使用的是液体培养基,养分交换非常充分,营养物质可以更好地被吸收[31]。
由表7可知,第8处理的培养基中外植体的增殖倍数为0,观察发现该组培养基中的外植体无明显生长,逐渐变成褐色,可能原因是激素配比不利于芽的生长,同时液体培养基中氧气含量比较低,外植体易发生缺氧坏死。
2.3生根培养基的优化
生根培养30d后,生根率统计结果见表9。
极差分析表明,对互叶白千层生根率的影响大小依次是:
NAA>基本培养基=IAA>蔗糖。
由表9可知,所有培养基的生根率都在80%以上,第6处理的生根率和根系发达程度最高。
观察可知,该处理试管苗根系发达,有3级根,一级根上生成粗细不同的二级根,并且在粗二级根上形成三级根,各级根上均有少量根毛;在以后炼苗时发现,这样的根系更加有利于移栽成活。
因此,最佳生根培养基是含30g/L蔗糖、0.1mg/LNAA和0mg/LIAA的1/2MS培养基。
2.4移栽
幼苗移栽是试管苗从实验室适宜生长环境到复杂外界环境,并发生从异养到自养的转变过程。
因此,移栽前要进行炼苗,让试管苗更好地适应自然环境。
在本试验中,经过炼苗,幼苗的地上、地下部分均具有较强木质化,移栽成活率达80%以上;其中,茎部粗壮、叶片浓绿、根系发达的幼苗,移栽时更易成活。
3结论
通过正交试验得出互叶白千层外植体的最佳诱导培养基为MS+0.01%AC+0.1mg/L6-BA+0.05mg/LNAA,诱导率达82.8%;最佳增殖培养基为MS+30g/L蔗糖+0.25mg/L6-BA,增殖倍数达31倍;最佳生根培养基为1/2MS+30g/L蔗糖+0.1mg/LNAA,生根率达100%;移栽30d后,成活率达80%以上。
研究结果为互叶白千层的工厂化育苗提供了科学依据。
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