尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法.docx
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尼克酸维生素PP又称烟酸的测定方法
尼克酸(维生素PP-又称烟酸)的测定方法
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法
(1)
此处介绍微生物法、比色法以及复合维生素制剂中的烟酰胺测定方法(分光光度法)
一、微生物法
1.原理
一种微生物生长必需某一些维生素,Lactobacillusarabinosus的生长需要尼克酸。
尼克酸是指具有尼克酸生物学活性的吡啶3-羧酸及其衍生物的总称。
它是白色晶体,是维生素中最稳定的一种,对酸、碱、热、光及弱氧化剂都很稳定,微溶于冷水,易溶于热水及乙醇。
其检出限为10ng。
2.适用范围
本方法来源自AOAC和国标GB12395-90。
适用于食物及饲料中的尼克酸的检测。
3.仪器
(1)电热恒温培养箱(37±0.5℃)
(2)无菌室(紫外灯消毒)
(3)电热手提式压力蒸汽消毒器(121℃,高压30min)
(4)液体快速混合器
(5)离心机(3000转,10min)
(6)碱式滴定管
(7)硬质玻璃试管
4.试剂
所用试剂皆为分析纯;所用水皆为蒸馏水
4.1标准溶液的配制
(1)尼克酸标准储备液(0.1mg/ml):
准确称取50.0mg已干燥恒重并储于五氧化二磷干燥器中的尼克酸标准,以25%乙醇溶液溶解并定容至500ml,于冰箱中保存。
(2)尼克酸标准中间液(1ug/m):
吸取1.00ml尼克酸标准储备液,置于100ml容量瓶中,用25%乙醇溶液定容,混匀,于冰箱中保存。
(3)尼克酸标准工作液(0.1ug/m):
临用时吸取5.00ml尼克酸标准中间液,置于50ml容量瓶中,用水定容,混匀。
4.2其它试剂的配制
(1)0.5mol/L硫酸:
于2000ml烧杯中加入700ml水,加入28mlH2SO4,用水稀释至1000ml。
(2)10mol/L氢氧化钠:
溶200gNaOH于水中,稀释至500ml。
(3)0.1mol/L氢氧化钠:
,取10ml10mol/LNaOH,用水稀释至1000ml。
(4)0.04%溴甲酚绿溶液,称取0.1g溴甲酚绿于研钵中,加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨,加少许水继续研磨,直至完全溶解,用水稀释到250ml。
(5)酪蛋白(sigma公司):
称取50g不含维生素的酪蛋白,加200ml(3mol/L)盐酸,121℃磅压力下水解6小时,将水解物转移至蒸发皿内,在水浴上蒸发至膏状。
加200ml水使之溶解后再蒸发至膏状,反复3次,以除去盐酸。
注意:
*酸解酪蛋白是为了去除酪蛋白中的维生素,确保培养基中不含代测的尼克酸,但酸解并不一定彻底,因此选用不含维生素的酪蛋白。
*水浴蒸发时不可蒸干或使之焦糊,若溶液被蒸干,水解液所含营养物已被破坏
用10mol/L氢氧化钠调节PH值至3.5,以溴酚蓝作外指示剂。
加20g活性炭,振摇,过滤,反复操作至滤液无色。
滤液加水稀释至500ml,加少许甲苯置冰箱中保存。
*注意:
活性炭不能在溶液中太久,否则容易破坏酪蛋白的营养成分
(待续)
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法
(2)
(6)溴酚蓝:
称取0.1g溴酚蓝,用1+4乙醇溶解后,再加乙醇稀释至100ml。
(7)甲苯
(8)4mol/L盐酸溶液,V+V=1+4
(9)5mol/L生理盐水:
取9gNaCl溶于1000ml水中。
(10)胱氨酸、色氨酸溶液:
称取4gL-胱氨酸和1gL-色氨酸溶于800ml水中,加热至70~80℃,逐滴加入20%盐酸,不断搅拌,直至完全溶解为止。
冷至室温,加水稀释至1000ml。
加少许甲苯于冰箱中保存。
(11)腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液:
称取硫酸腺嘌呤,盐酸鸟嘌呤及尿嘧啶各0.1g,加75ml水和2ml浓盐酸,然后加热使其完全溶解,冷却,若有沉淀产生,加浓盐酸数滴,再加热。
如此反复,直至冷却后无沉淀产生为止。
用水稀释至100ml。
加少许甲苯于冰箱中保存。
(12)D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇溶液:
称取D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇各10mg于烧杯中,以水溶解并稀释至1000ml,将此液置于棕色瓶中,加少许甲苯于冰箱中保存。
*注意:
此溶液见光分解,因此储存于棕色瓶中
(13)0.02mol/L醋酸溶液:
取1.18ml纯的冰醋酸,稀释至1000ml
(14)核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液:
溶解1mg生物素结晶于100ml0.01747mol/L的醋酸中,取此液4ml(相当于40ug生物素),加入20mg核黄素和10mg盐酸硫胺素,以0.01747mol/L醋酸溶解并稀释至1000ml,将此液置于棕色瓶中,加少许甲苯于冰箱中保存。
*注意:
此溶液见光分解,因此储存于棕色瓶中
(15)甲盐溶液:
取25g磷酸氢二钾和25g磷酸二氢钾,加水溶解后稀释至500ml,加少许甲苯于冰箱中保存。
(16)乙盐溶液:
取10g硫酸镁、0.5g氯化钠、0.5g硫酸亚铁和0.5g硫酸锰,加水溶解后稀释至500ml,加5滴浓盐酸,加少许甲苯于冰箱中保存。
(17)乙醇溶液V/V=1/3
(18)溴酚蓝:
称取0.1g溴酚蓝,用1+3乙醇溶液溶解后,再稀释至100ml。
(19)0.04%溴麝香草酚蓝溶液:
称取0.1g溴麝香草酚蓝于研钵中,加1.6ml,0.1mol/LNaOH,研磨,加少许水继续研磨,直至完全溶解,用水稀释至250ml。
(20)0.004%溴麝香草酚蓝溶液:
量取100ml0.04%溴麝香草酚蓝溶液,加水稀释至1000ml,供滴定用。
(21)基本培养基储备液:
酸解酪蛋白50ml
胱氨酸、色氨酸溶液50ml
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液10ml
D-泛酸钙、对氨基苯甲酸、吡哆醇溶液10ml
核黄素、盐酸硫胺素、生物素溶液10ml
甲盐溶液10ml
乙盐溶液10ml
无水葡萄糖10g
无水醋酸钠10g
(或结晶醋酸钠NaAC.3H2O16.6g)
将上列试剂混合,用水稀释至500ml用氢氧化钠调PH至6.8,以溴麝香草酚蓝作外指示剂。
(待续)
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(3)
(22)琼脂培养基:
无水葡萄糖1g 醋酸钠1g 蛋白胨0.8g 酵母提取物干粉0.2g 甲盐溶液0.2ml
乙盐溶液0.2ml 琼脂1.2g
混合,加水至100ml,加热至琼脂完全溶化,以溴麝香草酚蓝为外指示剂,用盐酸趁热调PH至6.8,尽快倒入试管中,每管3~5ml,加塞棉塞,于压力蒸汽消毒器中121℃灭菌10min,取出后竖直试管,冷至室温后保存于冰箱中。
4.3菌种的制备与保存
(1)菌种的制备与保存:
以阿拉伯乳酸杆菌�Lactobacillusarabinosus17-5ATCCNo.8014简称Lact.A?
纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中,在37±0.5℃恒温箱中保温16-24小时,取出于冰箱中保存,至多不超过两周。
保存数周以上的菌种,不能立即用作制备接种液之用,一定要在使用前每天转种一次,连续2-3天,方可使用,否则生长不好。
(2)种子培养液的制备:
加5ml0.1ug/ml的尼克酸标准应用液于尖头试管中,加入5ml基本培养基,塞好棉塞,于压力蒸汽消毒器内(高压锅)121℃下消毒10min,取出,置于冰箱中,此管可保存数周之久。
5.操作步骤
5.1样品制备:
取含尼克酸约5-50ug的均匀样品于100ml三角瓶中,加0.5mol/LH2SO450ml。
放入高压蒸汽锅121℃下水解30min,取出,于水中冷却,用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5,用溴甲酚绿做指示剂。
将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至100ml,滤纸过滤,保存滤液于冰箱内备测(保存期不超过36小时)。
*用0.5mol/L硫酸水解,可以断开尼克酸和其它物质结合的键,使尼克酸游离出来。
*观察溴甲酚绿至草绿色为终点,说明溶液PH值到了4.5.调PH值至4.5可以除去样品中刺激和抑制细菌生长的物质,如:
淀粉、脂肪酸及磷脂。
许多蛋白质的等电点也在PH4.5,所以此PH值也可用来沉淀蛋白质。
5.2接种液的制备:
使用前一天,将阿拉伯乳酸杆菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中,可同时制备两管,在37±0.5℃的恒温箱中培养16-24小时。
取出离心10分钟(3000rpm)倾去上部液体,用已消毒的生理盐水淋洗2次,再加10ml消毒过的生理盐水,将离心管置于液体快速混合器上混合,使菌种成为混悬体,将此液倒入已消毒的注射器内,立即使用。
5.3样品标准曲线的测定:
3组试管各加0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0ml工作液,每管加水稀释至5ml,再加5ml基本培养基,混匀,加棉塞。
(待续)
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(4)
5.4试样的测定:
在试管中分别加入1,2,3,4ml样液,加水稀释至5ml,再加入5ml基本培养基,用棉塞塞住试管,将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅(121℃)高压10min,冷至室温备用。
5.5接种和培养:
每管种一滴接种液,于37±0.5℃恒温箱中培养72小时
*注意:
接种后用振荡器振荡混匀试管中的液体。
5.6滴定:
从恒温箱中取出后,将试管中培养液倒入50ml三角瓶中,用5ml0.004%溴麝香草酚蓝分二次淋洗试管,洗液倒入该三角瓶中,以0.1mol/L氢氧化钠溶液滴定,呈绿色即为终点,此时PH约6.8,绘制尼克酸标准工作曲线,用测定管得到的值,在标准曲线上查到测定管内所含尼克酸的量。
*水解液的PH值调至6.8是为了不同的试剂加入基本培养基时,不致改变基本培养基的PH值。
(此乳酸菌生长的适宜PH值为6.8)
6.计算
以尼克酸标准系列的不同微克数为横坐标,滴定所需0.1mol/L氢氧化钠毫升数为纵坐标,作为标准曲线。
X=(C×V/m)×F×(100/1000)
X--样品中尼克酸的含量,mg/100g;
C--每毫升样品中尼克酸含量的平均值,ug/ml;
V--样品水解液定容总体积,ml;
F--样品试液的稀释倍数;
m--试样质量,g;
100/1000--折算成每100g样品中尼克酸含量,mg。
7.举例
取一螺旋藻样品1.004g(m),处理后定容为100ml(V),从中取1ml稀释至25ml(F),取1,2,3,4ml入试管中,加入水和培养基,高压消毒,培养,滴定,测量根据曲线分别得出四管C值为0.037,0.073,0.110,0.136,所以四管平均值为C=(0.037+0.073/2+0.110/3+0.136/4)/4=0.036。
代入方程式为:
X=(C×V/m)×F×(100/1000)=(0.036×100/1.004)×25×(100/1000)=8.96(mg/100g)
因此得出每100克螺旋藻中含8.96毫克尼克酸。
8.注意事项
(1)当管中尼克酸的量少于0.05或多于0.3ug,即超过标准曲线范围时所得到的数值不能用于计算。
(2)3mol/L盐酸的配制方法:
取250ml浓盐酸,加入750ml蒸馏水,共配成1L3mol/L的盐酸
(3)试管应先用洗衣粉清洗后,用水冲净,再放入酸缸中浸泡1天左右,捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净,凉干,方可再用。
完
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(5)
二、比色法
1.原理
烟酸和烟酰胺于Ph=4.5下用稀NH4OH提取,再与CNBr溶液与10%对氨基苯磺酸反应,测其比色值。
2.适用范围
选自AOAC;适用范围:
适用于药物、食物和饲料
3.仪器设备
(1)容量瓶,100ml
(2)锥形瓶,250ml
(3)电热板
(4)高压釜(121℃,30min)
(5)离心管,5ml
(6)漏斗
(7)通风橱
(8)酸式滴定管
比色计(药物430-450nm,谷物470nm)
4.试剂
所用试剂皆为分析纯;所用水皆为蒸馏水
4.1尼克酸标准溶液
(1)尼克酸标准储备液(100μg/ml):
将50mgUSP烟道参比标准(贮于P2O5干燥器中,放于暗处保存。
)
(2)标准中间液Ι(10μg/ml):
取少量贮备液放置至室温。
用蒸馏水将10.0ml贮备液稀释至100ml。
(3)标准工作液Π(4μg/ml):
将恢复至室温的贮备液2.0ml用蒸馏水稀释至50ml。
4.2其它试剂
(1)稀氢氧化铵溶液:
5mlNH4OH用H2O稀释至250ml
(2)稀盐酸:
V+V=1+5
(3)磷酸缓冲液(pH=8):
将60gNa2HPO4·7H2O和10gKH2PO4溶于蒸馏水中并稀释至200ml。
(4)溴化氢溶液(10%,通风橱中制备):
将370mlH2O温热至40℃,并加入40gCNBr。
振荡至溶解冷却并稀释至400ml。
溶液在冰箱保存。
*CNBr剧毒,切勿与皮肤接触,必须在通风橱中操作。
(5)10%对氨基苯磺酸溶液:
按每次1ml将NH4OH加到20g对氨基苯磺酸和170ml蒸馏水的混合液中,直至酸溶解为止。
用盐酸与蒸馏水溶液(1:
1)调节pH至4.5,采用溴甲酚绿指示剂指示。
稀释至200ml。
*注:
因为溶液有颜色会影响最后结果,所以稀释结束后溶液应几乎无色
(6)55%对氯基苯磺酸溶液:
在55g对氨基苯磺酸中加入27ml蒸馏水和27mlNH4OH,振摇至溶解。
(必要时加温)。
用NH4OH或5NHCl调pH为7,再用蒸馏水稀释至100ml。
(保存在暗处)
(待续)
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(6)
5.操作步骤
5.1样品制备
(1)药物:
将药品研碎,溶于蒸馏水中,稀释定容。
取10mL样品于锥形瓶中,加入10mLHCl,在电热板上加热蒸发至约2mL,冷却,加入25-50mL蒸馏水,用40%NaOH或KOH溶液调节pH值至2.5-4.5。
过滤,弃去10mL处液,转移至容量瓶中定容,使溶液含尼克酸约4μg/mL。
*注:
溶液的尼克酸含量应在50-200μg/mL
(2)非谷类食品及饲料:
称取约28g样品,加入0.5mol/LH2SO4200mL,混匀,在高压釜中121℃加热半个小时。
冷却,用10mol/LNaOH调节pH值至4.5,以溴甲酚绿作外指示剂,用蒸馏水稀释至250mL,过滤。
取17g(NH4)2SO4于50mL容量瓶中,吸取40mL样品液,用H2O稀释定容,强力振摇。
过滤,混匀,取1mL作比色测定用。
如果样品中尼克酸含量为16mg/1b。
最终液浓度3.2μg/mL。
移取40mL标准工作液Π至盛有17g(NH4)2SO4的50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释定容,此液含尼克酸3.2μg/mL。
*注:
加入H2SO4主要是为了去除样品中的蛋白及其它杂质,以防其对测量结果造成影响
(3)谷类产品:
随同样品做1试剂空白和5个浓度的工作标准液。
分别将1.5gCa(OH)2放入7个锥形瓶中,移入0、5、10、15、20、25mL标准中间液Ι和2.5g样品(含100μg烟酸),加入蒸馏水至90mL,振摇混匀。
高压121℃下2小时。
趁热混匀,冷却至40℃,转移至100mL容量瓶中,稀释定容。
从容量瓶移50mL上清液至离心管中,冰浴15min或置于冰箱中≥2小时。
离心15min,吸取20mL上清液至盛有8g(NH4)2SO4和2mL磷酸盐缓冲液的离心管中。
振荡溶解并温热至55-60℃。
离心5min,过滤。
5.2操作程序
(1)药物制剂和非谷类食物和饲料:
假如10%的对氨基苯磺酸溶液,CNBr溶液,在通风橱中用酸式滴定管滴入,用标准工作液Π,如下表制备各管:
试剂标准空白样品空白
标准溶液(mL)1.01.0
H2O(mL)5.05.0
稀NH4OH(mL)0.50.5
10%对氨基苯磺酸2.02.0
稀HCl(mL)0.50.5
样品溶液
标准溶液(mL)1.01.0
稀NH4OH(mL)0.50.5
CNBr(mL)5.05.0
10%对氨基苯磺酸(mL)2.02.0
H2O(mL)0.50.5
*注:
CNBr有毒,注意通风
每只样品都要分别制备样品空白。
待续
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(7)
将标准和样品移入试管中,分别加入5mL蒸馏水作为标准空白和样品空白。
转动试管内的液体,立即加入稀NH4OH,转动,加对氨基苯磺酸,再次旋转混合。
立即加入0.5mL稀HCl,混匀,置于光电比色计上,加入对氨基苯磺酸后约30s内在430和450nm波长之间任意波长调节仪器至0的A值。
从加入稀NH4OH开始按标准空白同样的方法处理标准溶液。
立即转动管子,加CNBr溶液并再次转动混匀,在加入CNBr溶液后30s后转动管子,加入对氨基苯磺酸溶液,再转动。
立即加入0.5mL蒸馏水,混匀,加塞。
,测量。
(加入对氨基苯磺酸溶液后1.5min时颜色最深,保留2min,然后慢慢褪色。
)
将样品空白设在0A,测样品溶液的A值。
若标准和样品液含量大致相等,则尼克酸含量与A值成正比。
(2)谷类制品:
取5只试管,其中两只加入5mL标准液,两只加入5mL样品液,另一只加入5mL蒸馏水做试剂空白。
于一只空白管,一只标准管和一只样品管各加10mL蒸馏水,将所有管置于冰中冰浴30min。
对剩下的管按顺序加入10mL冷的CNBr,30s后加入1.0mL55%对氨基苯磺酸溶液。
用标准空白在470nm处,调比色计为0A,加入对氨基苯磺酸后12-15min读出其它各管的A值。
*放入比色计前,试管必需冷却一致,每管必需拭干。
如管呈雾状,浸于热水中片刻,测定前拭干。
6.计算
将扣除试剂空白的标准A对尼克酸含量μg/ml作图,画出适宜的直线,从此图上求出已扣除样品空白和试剂空白后样品校正的A所对应的浓度C。
Mg尼克酸/g样品=C/10ng样品
7.注意事项
(1)CNBr溶液有毒,要注意安全。
(2)样品不同,处理方法不同,不要混淆。
(3)注意通风橱的通风。
(4)因为采用比色法测量,因此样品含有色素易干扰测定,影响测定结果的正确性。
(5)试管应先用洗衣粉清洗后,用水冲净,再放入酸缸中浸泡1天左右,捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净,凉干,方可再用。
尼克酸(维生素PP,又称烟酸)的测定方法(8)
三、复合维生素制剂中的烟酰胺测定----分光光度法
1.原理
在PH约4.5处将烟酰胺抽提到KH2PO4溶液中,再与CNBr和巴比士酸反应。
用分光光度法测定反应产物。
烟酸含量超过烟酰胺三倍量时干扰烟酰胺测定。
2.适用范围
选自AOAC;适用于复合维生素制剂检测
3.仪器
(1)搅拌器
(2)量筒
(3)锥形瓶
(4)高压釜(121℃,15min)
分光光度计(550nm)
4.试剂
所用试剂皆为分析纯;所用水皆为蒸馏水
4.1.烟酰胺标准溶液:
(1)标准储备液(250μg/mL):
50mgUSP烟酰胺标准加60%乙醇溶解并稀释到200mL。
在10℃贮存。
(2)标准工作液(5μg/mL):
将少量贮备液温热至室温。
取出2mL用0.3%KH2PO4溶液稀释至100mL。
4.2其它试剂
(1)溴化氰溶液:
10%,将370mlH2O温热至40℃,并加入40gCNBr。
振荡至溶解冷却并稀释至400ml。
溶液在冰箱保存。
使用前需恢复到室温。
*注:
CNBr剧毒,切勿与皮肤接触,注意在通风橱中操作。
(2)磷酸二氢钾溶液:
A.13%的磷酸二氢钾溶液:
将30gKH2PO4用蒸馏水溶解并稀释到1L。
B.3%的磷酸二氢钾溶液:
将3%的磷酸二氢钾溶液用蒸馏水稀释(1+9)。
(3)巴比土酸缓冲液:
按每批测定需用量计算,按每100mL3%KH2PO4溶液加2g试剂级巴比土酸制备。
搅拌1小时,用前过滤。
5.操作步骤
5.1样品制备:
取适量样品于锥形瓶中,加入0.3%的KH2PO4(KH2PO4的量至少是估计的烟酰胺量的两倍)。
若样品不易溶解,则振摇使其分散并用高压釜在121℃下加热15min。
用0.3%KH2PO4溶液稀释至5μg/mL。
过滤。
用蒸馏水代替CNBr分别制备各样品的空白。
将1mL工作标准液或测定液置于分光光度计比色管中。
加0.5mLCNBr溶液,混匀,塞住,放置25-30min,加10mL巴比土酸溶液并旋摇
*注:
若30min后不能加巴比土酸溶液。
将管置于碎冰浴中稳定CNBr反应。
5.2用蒸馏水代替CNBr做为适当的空白,(550nm,分光光度计设定在0A)颜色最深时测定反应产物的吸光度
*注:
加入巴比土酸后2-4min时颜色最深,稳定约1min,慢慢褪去
*注:
测定样品时,其放置时间不应超过30min。
加入CNBr时应有规律的间隔1-2min。
6.计算
样品中烟酰胺含量(mg)=(A×5×稀释倍数)/(A'×1000)
式中
A-样品吸光度
A'--标准吸光度
5-μg烟酰胺/mL标准工作液
(结果用烟酰胺mg/片报告)
7.注意事项
(1)CNBr有毒,应在通风橱中操作。
(2)样品中烟酸含量超过烟酰胺含量的三倍量时会干扰烟酰胺的测定,因此样品应有明确的烟酸和烟酰胺的含量。
(3)试管应先用洗衣粉清洗后,用水冲净,再放入酸缸中浸泡1天左右,捞出后再用自来水和蒸馏水清洗干净,凉干,方可再用。
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