荔枝草有效成分治疗慢性咽炎作用机制研究科技计划项目申报书.docx
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荔枝草有效成分治疗慢性咽炎作用机制研究科技计划项目申报书
项目法人信用承诺书
本项目法人承诺严格遵守《市科技计划信用管理暂行办法》等有关规定,为项目实施提供承诺的条件,严格执行经费管理等相关规定。
承诺所提供申报资料真实可靠,项目组成员身份真实有效,无编报虚假预算、篡改单位财务数据、侵犯他人知识产权等失信行为。
本项目法人承诺如有失实或失信行为,愿意根据相关规定,承担以下责任:
1、取消项目评审资格;
2、撤销项目立项,并收回市拨经费;
3、记入不良信用记录,并接受相应处理;
4、其它相关法律责任等。
项目负责人(签字):
单位法人(签字):
(公章)
年月日
项目主管部门信用承诺书
按照市科技计划项目申报的要求,我们对该项目进行了认真审查,该项目单位提交的项目申报资料完整齐全、真实有效,该单位无不良信用记录,项目负责人和申报单位符合本计划申报资格要求。
本主管部门承诺在审查推荐项目过程中,无违规推荐、审查不严等失信行为。
承诺按照相关管理规定,切实履行项目主管部门管理职责。
如有失实或失信行为,本部门承诺按照《市科技计划信用管理暂行办法》等相关规定,承担相关责任。
(公章)
年月日
一、立项依据
1、本项目国内外科技创新发展概况和最新发展趋势
咽作为人体重要的功能器官之一,具有吞咽、呼吸、保护、防御及辅助发音等众多功能。
咽作为与外界接触的主要器官,由于自身病理因素及外界环境的影响,如细菌感染、病毒感染、工作压力大、长期多语、冷热、粉尘、烟酒等,易引起咽部黏膜、黏膜下及淋巴组织出现弥漫性炎性病变。
并且极易由于病人忽视导致病势加重,进一步发展为慢性咽炎,出现咽部持续干、痒、胀、痛、恶心、分泌物多,有异物感等不适症状。
此病缠绵反复,顽固难愈,不仅给患者造成生理损伤,更使得部分病人出现心理障碍,部分慢性咽炎患者易出现性格内向、焦虑低落、情绪波动大、过分关注生理症状等心理问题。
目前,慢性咽炎的治疗主要分为西医西药和中医中药两个方面。
西医主要采用抗菌抗病毒、抗过敏、免疫调节等治疗手段。
口服、注射、雾化/吸入抗生素、抗病毒药物可杀灭和抑制病灶部位敏感细菌和病毒。
抗组胺药和糖皮质激素可与病灶上皮细胞糖皮质激素受体结合,干扰花生四烯酸和白三烯合成,抑制炎性反应,减少黏膜充血和腺体分泌。
卡介苗素可激活T细胞,促进白细胞介素(IL)等的生成,产生多种具有免疫调节作用的淋巴因子,增强巨噬细胞的功能,提高机体免疫细胞杀灭细菌、病毒等病原体的能力并能减轻迟发型变态反应所致的水肿,诱导抑制性T细胞生成,活化辅助T细胞产生干扰素γ(INF-γ)。
INF-γ为免疫球蛋白E(IgE)生成因子IL-5的拮抗剂,可降低体内IgE的合成。
中医则根据慢性咽炎病因病机的多样性,通过辨证施治创造了养阴清肺、活血祛瘀、补脾益胃、疏肝理气、燥湿化痰等诸多疗法,采用中药调节机体状态,改善气血平衡,促进慢性炎症康复,改善临床症状及体征,提高患者生活质量。
同时中药具有疗效确切、副作用小、性价比高、患者依从性强等优点。
因此,中医药在治疗慢性咽炎方面发挥着独特的作用。
荔枝草是唇形科鼠尾草属植物荔枝草的全草,别名雪见草、皱皮草、癞团草、猪婆草等,含有高车前苷(homoplantaginin)、粗毛豚草素(hispidulin)、咖啡酸(caffeicacid)等主要的有效成分,除新疆、甘肃、青海、西藏外,广泛分布于全国各地,主产于江苏、浙江、安徽等地。
《全国中草药汇编》记载荔枝草味苦、辛、性凉,归肺、胃、肾经,具有清热解毒,利尿消肿,凉血止血之功效。
近年来,随着对荔枝草研究的深入,发现其具止咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗菌抗病毒等多方面的药理作用,具有很高的药用价值和经济价值。
尽管中药在治疗慢性咽炎方面有着诸多优势,但是仍存在着药效物质基础不明确、作用靶点和作用机制不明晰等问题,这在很大程度上限制了中药的开发和应用。
因此,运用实验方法来探讨中医药治疗慢性咽炎的作用机制受到了人们的广泛关注。
针对抗慢性咽炎作用机制的研究目前主要从体外和体内两个方面展开,在体外抗炎途径中常采用刺激小鼠巨噬细胞,如RAW264.7细胞、J774A.1细胞等的炎性反应来探讨抗炎机制,考察受试药物对炎性反应中关键性炎性因子(如NO、COX、INF-α、PGE、NF-κB家族、IL家族等)的影响。
体内研究则根据慢性咽炎的发病特点,一般采用建立慢性咽炎动物模型的方式加以中药治疗,通过对动物模型病理形态、超微结构、单核细胞吞噬力、免疫器官重量、淋巴细胞转化率、溶血素含量、炎症细胞因子(如IL-β、IL-6β的炎症介质家族成员)、表皮生长因子(EGF)、血液流变学(全血黏度值、全血还原黏度值、血浆粘度、红细胞压积指数、刚性指数、聚集指数以及纤维蛋白原指数)、免疫球蛋白免疫因子(ICAM-1)以及C-反应蛋白(CRP)等多方面指标进行研究,为合理阐述中药治疗慢性咽炎作用机制提供可靠的依据。
2、本项目研究的目的、意义
(1)研究目的
通过体外、体内两条途径深入开展荔枝草有效成分治疗慢性咽炎作用机制的研究,从基因和蛋白水平阐明其在体外、体内治疗慢性咽炎的作用靶点和机制途径,为荔枝草产业化开发和利用提供有力的理论支撑,实现荔枝草在医药、食品和化工工业的重要应用价值。
(2)研究意义
江苏是荔枝草最主要产区之一,地区荔枝草资源极其丰富。
目前荔枝草多水煎内服用于治疗扁桃体炎、肺结核咳血、慢性支气管炎、血小板减少性紫癜等疾病,外用则治疗跌打青肿、疮毒、乳腺炎等,但在临床应用中存在着药效物质基础不明确、作用靶点和作用机制不明晰等问题,这在很大程度上限制了荔枝草的开发和应用。
若以本课题为切入点,深入研究荔枝草治疗慢性咽炎的体内外作用机制,则可明确其作用靶点和机制途径,对荔枝草在治疗慢性咽炎中的应用提供了有力支持,充分发挥其社会效益和经济效益。
对开发“道地”药材、中成药、功能性食品、抗氧化剂,促进相关产业发展、带动农民增收致富等也具有重要意义。
3、本项目研究现有起点科技水平及已存在的知识产权情况
RAW264.7是由Abelson鼠白血病病毒诱导BALB/c小鼠产生肿瘤后收集小鼠腹水单核样巨噬细胞得到的细胞株。
该细胞具有很强的黏附和吞噬抗原的能力,是微生物学、免疫学研究中的常用细胞株。
由于脂多糖(LPS)为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,可在革兰氏阴性菌崩裂时释出,具抗原性。
因此在体外抗炎机制研究中,LPS被广泛用于诱导RAW264.7细胞发生炎症。
酶免疫测定(EIA)是将酶催化作用的高效性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种微量分析技术。
酶标记抗原抗体后形成的酶标记物,既保留抗原或抗体的免疫活性,又保留酶的催化活性。
当酶标记物与待测样品中相应的抗原或抗体相互作用时,可形成酶标记抗原抗体复合物。
利用复合物上标记的酶催化底物显色,其颜色深浅与待测样品中抗原或抗体的量相关。
该方法灵敏度可达到ng~pg/ml水平。
常用的标记物有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP等。
逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)是将RNA的逆转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增反应(PCR)相结合的技术。
RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞组织中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。
电泳迁移率变动分析法(EMSA)是体外利用电泳迁移率的变化来分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术,用放射性同位素标记待检测的片段,然后与细胞提取物共温育,形成DNA-蛋白复合物,将该复合物加到非变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。
用于研究DNA-footprinting、特定的转录因子以及转录因子所结合的顺势作用元件、与蛋白质相结合的DNA的序列的特异性。
评估突变对探针DNA与结合蛋白相互作用的影响。
蛋白质印迹法(WesternBlot)是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
苏木精-伊红染色法(HE)是石蜡切片技术里常用的染色法之一。
苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色;伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。
酶联免疫吸附试验(ELISA)是酶免疫测定技术中应用最广的技术。
其基本方法是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面,使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除。
常用的ELISA法有双抗体夹心法和间接法,前者用于检测大分子抗原,后者用于测定特异抗体。
放射免疫检测法(RIA)利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应的放射性同位素体外微量分析方法。
在临床免疫学上测定免疫球蛋白 G、免疫球蛋白E及抗脱氧核糖核酸抗体;进一步的应用包括甲状腺球蛋白抗体、类风湿因子、补体及抗食物抗原抗体的测定。
免疫比浊法是抗原抗体结合动态测定方法。
当抗原与抗体在特殊稀释系统中反应而且比例合适时,形成的可溶性免疫复合物在稀释系统中的促聚剂的作用下,自液相析出,形成微粒,使反应液出现浊度。
当抗体浓度固定时,形成的免疫复合物的量随着检样中抗原量的增加而增加,反应液的浊度也随之增加。
通过测定反应液的浊度与一系列标准品对照,即可计算出检样中抗原的含量。
4、本项目研究国内外竞争情况及产业化前景
本项目通过大量文献书籍、广泛调查和前期研究发现荔枝草具有止咳、祛痰、平喘、抗氧化、抗菌抗病毒等多方面的药理作用,具有很高的药用价值和经济价值,但目前国内外对于荔枝草的利用和研究并不充分,其在临床使用中多以全草形式入药,对其药理学研究也多限于部分药效学考察,而荔枝草有效成分对慢性咽炎作用机制的研究还没有详细报道。
本项目以期通过明确其治疗慢性咽炎的作用途径和靶点,可以为荔枝草产业化开发和利用提供有力的理论支撑。
可与制药企业进行合作,研发以荔枝草为主要成分治疗慢性咽炎的中成药,与食品企业合作开发功能性食品,如荔枝草咀嚼片、荔枝草茶、荔枝草抗氧剂等。
以荔枝草茶为例,可开发为地区特色产品,若实现产业化开发,可使荔枝草附加值增加50%以上,以每年在及周边地区销售100吨计算,可新增效益200万元。
二、研究内容
1、具体研究开发内容和要重点解决的关键技术问题
(1)荔枝草有效成分体外抗炎作用机制研究
巨噬细胞在外界刺激下具有较强的分泌致炎因子的能力,因此本课题选取小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7作为荔枝草有效成分发挥抗炎机制作用的靶细胞,深入研究其在体外发挥抗炎作用的机制。
①细胞生长曲线法检测对RAW264.7细胞增殖的影响
②酶免疫测定法(EIA)检测对RAW264.7细胞前列腺素E2(PGE2)生成影响
③逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定RAW264.7细胞中COX-2mRNA的水平
④电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测对RAW264.7细胞NF-κB的DNA结合活性
⑤Westernblot法测定RAW264.7细胞COX-2和NF-κB蛋白表达
(2)荔枝草有效成分体内抗炎作用机制研究
细胞因子在急、慢性炎症反应中起到重要作用。
能促进上皮细胞和血管内皮粘附白细胞,随即由血液运转至炎症部位,能使人体内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞,嗜中性白细胞活化,另外可刺激纤维组织的增生,淋巴细胞的分化和再生,并能使血管通透性增加。
本课题对慢性咽炎SD大鼠模型血淸样本进行采集,检测相关因子ICAM-1、IL-1β、IL-6β、TNF-α、CRP等,探究荔枝草有效成分治疗慢性咽炎可能的作用机制和靶点。
①HE染色观察咽部组织病理形态学变化
②酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)
③放射免疫检测法(RIA)检测白细胞介素(IL-1β、IL-6β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)
④免疫比浊法测定C反应蛋白(CRP)
2、项目的特色和创新之处
(1)本课题在课题前期研究基础之上首次研究了荔枝草有效成分治疗慢性咽炎机制,为其发挥治疗慢性咽炎功效奠定了坚实的基础,并为开发治疗慢性咽炎的荔枝草系列产品开发奠定了理论基础。
(2)本课题从体内和体外途径深入探讨了荔枝草有效成分治疗慢性咽炎的作用机制,从基因和蛋白水平阐明了荔枝草有效成分的作用靶点和机制途径,为后续深入研究和开发荔枝草及功能相近的中药提供了有价值的参考。
3、要达到的主要技术、经济指标及社会、经济效益
(1)主要技术、经济指标
通过体外(小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7)和体内(慢性咽炎SD大鼠模型)实验明确荔枝草有效成分治疗慢性咽炎的作用靶点和机制途径。
在核心期刊发表文章2-3篇,申请国家发明专利2-3项,其中发明专利1项。
(2)社会效益及经济效益
本课题首次从体内和体外途径深入探讨了荔枝草有效成分治疗慢性咽炎的作用机制,从基因和蛋白水平阐明了荔枝草有效成分的作用靶点和机制途径,为后续深入研究和开发荔枝草奠定了坚实的理论基础。
课题所采用的技术和设计体系也为研究功效相近的中药提供了可靠的参考和依据。
三、研究试验方法、技术路线以及工艺流程
1.试验方法
(1)荔枝草有效成分体外抗炎作用机制研究
巨噬细胞在外界刺激下具有较强的分泌致炎因子的能力,因此本课题选取小鼠腹腔巨噬细胞系RAW264.7作为荔枝草有效成分发挥抗炎机制作用的靶细胞,深入研究其在体外发挥抗炎作用的机制。
①细胞生长曲线法检测对RAW264.7细胞增殖的影响
首先通过细胞生长曲线法明确荔枝草有效成分是否能够抑制RAW264.7细胞增殖,如能显著抑制其增殖则表明荔枝草有效成分具有较强的体外抗炎作用。
RAW264.7细胞在37℃、体积分数为5%CO2条件下,用含体积分数为10%小牛血清、青霉素(1×105U/L)及链霉素(100mg/L)的RPMI-1640培养液传代培养。
取对数期细胞,按密度为1×l05个/ml接种于96孔细胞培养板,每孔定容20μl。
37℃、5%CO2条件下培养箱培养24h后,按照高、中、低加入荔枝草有效成分,每个剂量组设3个复孔,每孔加入200μl培养基。
模型对照组加2000含10%胎牛血清的DMEM培养基。
药物作用4h后,各组加入终浓度为l00ng/ml的LPS刺激。
在37℃、5%CO2条件下培养箱培养20h后,各孔加20μlMTT溶液(5mg/ml),继续培养4h。
1000r/min离心5min,弃去各孔上清,分别加如100μlDMSO溶液,振荡,于室温暗处放置15min,以酶标仪于波长490nm处测定OD值,并计算细胞相对抑制率。
②酶免疫测定法(EIA)检测对RAW264.7细胞前列腺素E2(PGE2)生成影响
PGE2是重要的细胞生长和调节因子,花生四烯酸环氧合酶代谢产物,为二十碳不饱和脂肪酸,它可降低热敏神经元的点燃率,使其放电频率降低,抑制散热,而升高冷敏神经元的点燃率,使其放电频率增加,增加产热,从而使调定点上移,体温升高。
因此,通过EIA法检测PGE2的生成可以确定荔枝草有效成分是否能够抑制炎症引起的发热和疼痛。
将对数生长期的RAW264.7细胞接种于6孔培养板中,设空白对照组,脂多糖(LPS)处理组(模型组),荔枝草有效成分低、中、高剂量组;药物加入30min后再加入终浓度为1μg/mL的LPS,继续培养12h;收集细胞培养液,以PGE2EIAKit测定其中的PGE2浓度。
③逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定RAW264.7细胞中COX-2mRNA的水平
环氧酶COX-2,是前列腺素(PGs)合成所必须的酶,也是PGs合成初始步骤中的关键性限速酶,广泛参与炎症早期过程。
本课题采用RT-PCR测定荔枝草有效成分对COX-2mRNA的水平的影响评价抗炎减轻作用。
收集各受试组细胞,Trizol试剂提取细胞的总RNA,按一步法试剂盒步骤进行RT-PCR。
分别设计COX-2的引物和β-actin的引物。
COX-2的反应条件为:
50℃逆转录30min;94℃预变性2min;94℃变性45s56℃复性1min,72℃延伸1min,扩增30个循环;72℃延伸10min。
PCR产物以15g/L琼脂糖凝胶电泳,DocGel1000成像系统观察结果并拍照。
同时进行光密度积分值分析,以COX-2PCR产物与内参照β-actinPCR产物的光密度积分值之比作为COX-2mRNA的相对含量值。
④电泳迁移率变动分析法(EMSA)检测对RAW264.7细胞NF-κB的DNA结合活性
NF-κB是Rel转录因子家族中关键的转录因子,在调节细胞的炎症反应、免疫应答等相关的基因转录和表达起到枢纽的作用。
研究表明,COX-2启动子上存在NF-κB位点序列。
因此,NF-κB是启动COX-2转录激活的重要转录因子。
课题通过检测NF-κB的DNA结合活性可以明确荔枝草有效成分发挥治疗急慢性咽炎的关键作用靶点。
细胞核蛋白的提取:
细胞以PBS溶液洗涤2次后加入100μL缓冲液A[10mmol/LN-2-羟基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)-KOH、1.5mmol/LMgCl2、10mmol/LKCl、1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、10mg/LLeupeptin、3.5mg/L抑酞酶(Aprotinin)、1mmol/L二硫苏糖醇(DTT)],冰上放置15min,再加体积分数为10%壬基酚聚氧乙烯醚(NP-40)10μl,振荡混匀;然后10000g、4℃、离心10min;于沉淀中加100μl缓冲液B[20mmol/LHEPES-KOH、2.7mol/L甘油(Glycerol)、420mmol/LNaCl、1.5mmol/LMgCl2、1mmol/LPMSF、1mg/LLeupeptin、10mg/LAprotinin、1mmol/LDTT],冰浴30min,离心取上清液,考马斯亮蓝法测定核蛋白浓度后,-70℃保存。
双链寡核苷酸探针的标记:
含有NF-κB特异性识别位点的双链脱氧寡核苷酸序列如下:
5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’;3’-TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG-5’。
依次加入寡核苷酸探针(10pmol/μl)1.0μL、10倍T4多核苷酸激酶缓冲液2μl、T4多核苷酸激酶(10U/μl)1.0μl、[γ-32P]-ATP(10μCi/μL)2.5μl、无核酸酶水13.5μl,共20μl。
反应混合液于37℃孵育10min,加入0.5mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)1μl终止反应。
乙醇沉淀法去除未结合标记物。
取10μg核蛋白与放射性核素标记的DNA探针在室温进行结合反应30min,总体积为10μl。
DNA-蛋白复合物经40g/L的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电压110V,电泳60min。
真空负压加热干燥凝胶后,-70℃放射自显影,显影后扫描至计算机,利用图像分析软件进行光密度积分值分析。
⑤Westernblot法测定RAW264.7细胞中COX-2和NF-κB蛋白的表达
在研究上述COX-2mRNA的水平和NF-κB的DNA结合活性的基础上,为进一步明确COX-2和NF-κB蛋白表达是否发生显著变化,本课题考察了RAW264.7细胞中COX-2和NF-κB蛋白的表达。
细胞裂解液裂解各受试组细胞后提取总蛋白,考马斯亮蓝法测定样品总蛋白含量。
每组各取50μg蛋白质样品加上样缓冲液煮沸变性后,进行100g/L十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE);电转移至PVDF膜;用含50g/L脱脂奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBS,pH8.0)封闭2h;分别加入适量COX-2、NF-κB和β-actin多克隆抗体,摇床上室温反应2h;洗膜3次,加辣根过氧化物酶标记的二抗,室温反应2h;洗膜后作ECL化学发光,X片曝光显影。
图像经扫描仪扫描后,用图像分析软件BandScan进行光密度积分值分析,以目的蛋白与内参照β-actin蛋白表达量的光密度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量值。
(2)荔枝草有效成分体内抗炎作用机制研究
细胞因子在急、慢性炎症反应中起到重要作用。
能促进上皮细胞和血管内皮粘附白细胞,随即由血液运转至炎症部位,能使人体内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞,嗜中性白细胞活化,另外可刺激纤维组织的增生,淋巴细胞的分化和再生,并能使血管通透性增加。
本课题对慢性咽炎SD大鼠模型血淸样本进行采集,检测相关因子ICAM-1、IL-1β、IL-6β、TNF-α、CRP等,探究荔枝草有效成分治疗慢性咽炎可能的作用机制和靶点。
①HE染色观察咽部组织病理形态学变化
通过HE染色观察咽部组织切片病理形态学变化可以判断荔枝草有效成分能否使咽部炎性组织增生、炎性侵润、小血管扩张充血、细胞坏死等情况减轻,如有减轻则表明其有效。
动物造模:
将浓度为2.5%的氨水装入喷雾器内喷入模型大鼠咽部,上午、下午各1次,每次喷3揿,连续16天。
每天观察动物的一般状态、咽部的粘膜形态、色泽及分泌物情况等。
造模结束后处死模型组动物,并根据彭顺林等慢性咽炎动物模型研究所采用的方法,从动物造模后出现的症状、体征,病理形态学改变考察评价造模是否成功。
大鼠造模成功后分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、荔枝草有效成分高、中、低剂量组。
每天2次(上、下午各1次),连续给药5天后称重。
常规石蜡包埋、切片(每个样本作3张切片),梯度酒精脱蜡至水,苏木染色20min,蒸馈水冲洗15min,70%盐酸酒精分化5s,蒸馏水冲洗5min,伊红复染1min,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,光镜下观察(10×10、10×40)倍镜。
②酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞间黏附分子-1(ICAM-1)
ICAM-l为粘附分子免疫球蛋白超家族成员,主要分布于内皮细胞(EC)、细胞、肿瘤细胞及上皮细胞等。
其表达受到IL-1β、TNF-α等多种细胞因子的调节,可使ICAM-1的表达上调。
ICAM-1的表达增高,是内皮细胞和白细胞损害或激活的重要标志。
分别将预先注入EP管中的各组取样的大鼠股动脉血2rnl,4℃、1000r/min离心,l0min,取血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ICAM-1的浓度含量,操作依据试剂盒说明进行。
③放射免疫检测法(RIA)检测白细胞介素(IL-1β、IL-6β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)
IL-1β是一种主要由单核巨噬细胞产生的,一种重要的细胞因子和多肽调节因子。
其主要在细胞免疫激活中发挥重要的调节作用。
IL-6β主要是由T细胞、B细胞巨噬细胞等多种细胞产生的一种糖蛋白。
在免疫应答方面起到调节作用,主要参与机体内炎症反应。
TNF-α是由巨噬细胞以及单细胞分泌的一种重要的细胞因子,具有多种生物特性,主要是介导抗肿瘤及调节机体的免疫功能,并且也参与炎症病变的多方面病理变化。
分别将预先注入EP管中的各组取样的大鼠股动脉血2rnl,4℃、3000r/min离心10min,分离血清。
各组血清置于-70℃冰箱中保存。
测定前使样本置于室温中复融,再次4℃、3000r/min离心,5min,取血清,采用放射免疫检测法(RIA)测定血清IL-1β、IL-6β以及TNF-α的浓度含量,操作依据试剂盒说明进行。
④免疫比浊法测定C反应蛋白(CRP)
CRP是肝脏在IL-6β调控下产生的一种急性时相蛋白,具有抗炎特性,能减轻组织的损失,其在炎症早期对机体内坏境的稳定发挥强大的作用,在正常血清中含量极其微少,当有炎症侵入时明显浓度上升。
分别将预先注入EP管中的各组取样的大鼠股动脉血2ml,4℃、1000r/min离心,10min,取血清,采用免疫比浊法检测CRP的浓度,操作依据试剂盒说明进行。
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