国家自然基金申请硅藻土负载纳米材料及深度处理氨氮废水研究.docx
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国家自然基金申请硅藻土负载纳米材料及深度处理氨氮废水研究
采油废水的的多基因工程菌降解研究
Studyontheeliminationofoilfieldwastewaterbyusingpolygeneticengineeringbacteria
摘要:
随着石油需求量的不断增长,石油的开采量大幅上升。
在石油开采过程中产生的采油废水也在不断增加,由其引发的污染问题也日益严重。
油田采油废水具有温度高、含盐量高、排放量大、成分复杂等特点,一般的处理方法很难使其达标排放。
因此,如何有效的处理采油废水是摆在我国甚至世界面前的一个亟待解决的环境地质问题。
本研究将有机地球化学、环境微生物学以及分子生物学等方法进行有机的结合,分离筛选出能够降解采油废水组分及能适应高温或高盐环境的优势菌株,再通过基因工程技术,克隆出多个能降解采油废水及耐高温或耐高盐的基因,并将这些降解性基因构建在一个载体中,导入大肠杆菌得到1株具有生物降解谱较广、适应性强的能够降解采油废水的多基因工程菌并对其降解采油废水的可行性进行研究。
为有效地控制采油废水的污染提供了理论依据,也为将来的深入研究打下了基础。
关键词:
采油废水;多基因工程菌;生物降解
一、立项依据与研究内容(4000-8000字)
1. 项目的立项依据
随着世界各国对石油的需求量日益增长,石油的开采量也越来越大,石油开采产生的采油废水量也随之增加。
采油废水是在原油开采的过程中,采出的原油经过油气分离和脱水处理后产生的油田采出水,以及洗井废水、钻井废水和井下作业废水[1]。
通常的处置方法是将采油废水经处理后回注到地层,或用于注水驱油,基本不外排[2]。
20世纪90年代,随着热采油、注聚合物采油[3]等采油技术的使用,使产生的污水量越来越大,大部分油田面临采油废水外排的问题。
而由于采油废水的高热、高盐、组成复杂的特点,将其外排或回注则会造成严重的环境地质污染[4],如何有效的处理采油废水是摆在环境地质工作者面前的一个亟待解决的科学难题。
同时这也对探明采油废水毒害组分在实际的生物地球化学循环中的迁移、转化具有非常重要的意义。
采油废水的温度一般在45℃以上[5],而且含有大量的无机盐和氯离子,一般在3000-30000mg/L的范围[2]。
同时,采油废水中含有酚、醛、酮、醇、酯、酸、含氮化合物、烷烃、卤代烃等,其有机物的碳原子数分布较广,有机物的碳数变化更为复杂,而有机物的分子量分布主要集中在100-140之间,并占其总组成的70%-90%[6]。
另外,在注聚合物采油过程中或油气的处理、运输过程中投加的有机化学药剂,也是采油废水中有机物的重要组成部分,这种人工合成的化学添加剂对废水的CODCr可以占到65%[7]。
以上特点决定了采油废水难以在自然环境中降解,必须采取各种水处理技术使其达标排放。
目前处理采油废水的传统方法主要有吸附法、气浮法、电解法、化学混凝法、化学氧化法等。
这些方法存在着投入产出比低、操作复杂、易造成二次污染等问题[8]。
而新兴的生物技术处理采油废水具有运行能耗低,运行过程中不需添加化学试剂,不会对水体和周围环境造成二次污染,降解有机物彻底,最终降解产物为水和二氧化碳,出水水质稳定等优点[9],成为国内外的研究热点[10-17]。
例如杨怀杰等[15]提出了利用生物转轴技术处理采油废水。
他们的研究结果表明:
生物转轴方法技术先进、处理效率高、成本低、可操作性强,可使采油废水达标排放。
王吉丛等[16]分别采用直接投加菌液方法和生物接触氧化方法对孤岛采油废水进行了现场中试对比研究,试验结果表明两种方法都能有效地去除采油废水中的超标污染物。
CamposJ.C.等[17]将粗砂滤过的高盐度采油废水经纤维酯膜(MCE)进行微滤,去除一些大分子有机物,然后再进入用聚苯乙烯颗粒作填料的生物滤池内进行处理,COD、TOC和苯酚类的去除率分别为65%、80%和65%。
生物技术处理采油废水,关键在于其使用的菌种降解能力的高低。
而分离筛选具有采油废水降解能力的优势菌株,是提高生物处理设备对采油废水降解能力的基础,也是研究微生物降解采油废水的机理及对污染水域或土壤进行生物修复的基础[19]。
对于分离筛选高效石油降解菌,国内外学者都进行了大量的研究[20-25]。
但大部分降解菌是从石化工厂污染土壤或污水处理厂中筛选的,如卢显妍等[20]在广州石油化工总厂污水处理厂污泥中筛选出两株高效石油降解菌,王春艳等[21]从大连石化公司污水处理厂污水中筛选出一株高效降解菌种,郑金秀等[22]从武汉青山石油化工厂的污染土壤中分离出三株菌种。
但是从石化工厂或者其污水处理厂分离得到的菌种,不一定能适应采油废水高热、高盐、成分复杂的特点,也就不能达到实际的处理效果。
同时,对于耐高温、高盐的高效降解菌也有报道,有的是将污水处理厂的活性污泥直接驯化,再加入反应器中模拟高温高盐环境。
如李艳红等[9]。
有些研究者将得到的高效降解菌种应用于实际的修复试验或降解试验,如曹明伟[5]从被采油废水长期污染的土壤、底泥和深井油泥中分离出四株假单胞菌,用于高温条件下生物膜法处理采油废水,使河南油田双联站采油废水达标排放。
李秀珍等[26]采用SBR活性污泥法,选用从海水、采油废水及长期受原油污染的土壤中筛选的耐盐有机物优势降解菌来处理高含氯采油废水。
现场中试试验证明:
在氯离子浓度小于10000mg/L时,用该法可使处理后的高含氯采油废水达标排放。
但是这些试验仅限于高温条件或高盐条件,没有综合考虑高效降解菌将来要面对的诸多实际情况。
所以,采油废水的高效降解菌应具备在高温、高盐的条件下去除复杂组分的能力。
利用生物基因工程技术可使用连接酶将多种污染物降解性基因及复杂环境耐受性基因串联构建在同一载体上,然后转化成高效的多基因工程降解菌,使其具备多种降解能力及复杂环境的适应能力,可能会解决这个难题。
微生物的降解性能及环境适应能力是由降解质粒所携带的基因决定的,而生物基因工程技术通过筛选出高效的降解菌并克隆出相应的降解性及环境适应性基因,利用连接酶把多种污染物降解性基因及复杂环境耐受性基因串联构建在同一载体上,由于此方法消除了微生物各种群之间的相互影响,集多种功能于一身,所以表现出更强的对多种污染物同时降解的性能及环境适应性能。
多基因策略在水污染治理方面已有少量的应用,最早采用基因工程手段是Chakrabaty[27],他利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因连接后转移到某一菌体,得到的工程菌具有超常的降解能力,可同时降解以上4种有机物。
近年我国学者也报道了利用工程菌处理废水方面的研究成果,李尔炀[28]发现利用工程菌处理印染废水的效果好于活性污泥和高效混合菌。
但是利用基因工程菌处理采油废水方面的研究在国内外还未见有相关的报道。
因此,针对采油废水温度高、含盐量高、组成成分复杂,处理成本高等问题,有必要开展高效生物降解菌功能基因的克隆以及新型多基因工程菌的构建,开发环境适应能力强,且降解谱较宽,降解速度较快的,能同时降解多种污染物的多基因工程菌。
本课题拟分离筛选出的能够降解采油废水组分且能适应高温或高盐环境的优势菌株,再通过基因工程技术,克隆出多个能降解采油废水及耐高温或耐高盐的基因,并将这些降解性基因构建在一个载体中,导入大肠杆菌得到1个多基因工程菌,以用于采油废水的降解。
得到的基因工程菌可通过实验室的采油废水模拟降解实验进行初步降解试验,也可应用于后续的实际的采油废水的生物技术处理装置中,如果效果良好,还可进行工业化的生产。
同时,可以将菌种固定化,使其具有更好降解效果。
这种基因工程菌是原来自然界中没有的,所以将来对其毒理学以及对其进入自然环境后的生态学影响的研究也是十分必要的。
可见,本研究无论对于将来的实际应用或是进一步深入的科学研究都是最基础的一环,具有十分重要的意义。
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2. 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题
研究内容:
针对采油废水生物治理过程中,单一降解菌的环境适应性不强,降解谱较窄而不能满足降解采油废水中多种组分的要求,本项目拟分离筛选出能够降解采油废水组分及能适应高温或高盐环境的优势菌株,再通过基因工程技术,克隆出多个能降解采油废水及耐高温或耐高盐的基因,并将这些降解性基因构建在一个载体中,导入大肠杆菌得到1株具有生物降解谱较广、适应性强的能够降解采油废水的多基因工程菌并对其降解采油废水的可行性进行研究。
主要研究内容包括以下四个方面:
A.采油废水降解菌的环境特征研究。
选择有代表性的富含采油废水降解菌的钻井污泥或石油污染土壤等以及采油废水进行采样分析。
调查过程中需要现场测定一系列参数,如采油废水的温度、pH值、含盐量等。
室内测试采油废水样品的化学组分、CODCr等,并依据此数据配置无菌的采油废水模拟液。
B.高效降解菌的分离筛选鉴定研究。
将采集的样品经充分分散后作梯度稀释,分别设置高温或高盐条件,通过和采油废水组分类似的细菌培养基富集、分离,初筛出其中的优势菌种。
分两种条件筛选菌种可以最大程度的维持菌种对多种污染物的降解能力及菌种的多样性。
再以浓度逐渐升高的采油废水模拟液为唯一碳源对得到的菌种进行复筛,得到的菌种经鉴定后用于下一步基因工程菌的构建。
C.多基因工程菌的构建研究。
采用碱裂解法提取筛选出的能适应高温或高盐条件的高效降解菌的质粒DNA,并以提取的质粒DNA为模板,以外源基因5’端序列及3’末端的互补序列为引物进行PCR扩增,然后用琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物,利用扩增片段的特异性和分子量大小来筛选目的基因并进行纯化;将所分离的多个目的基因利用连接酶进行连接,导入感受态的大肠杆菌细胞并在选择性培养基中培养以筛选出重组子,对挑出的重组子进行大小鉴定,对目的大小的重组质粒进行酶切电泳鉴定和Southern杂交法鉴定。
D.多基因工程菌对采油废水的初步降解实验研究。
在实验室条件下,对多基因工程菌降解采油废水的降解动力学、具体降解模式、影响降解的主要因素等进行研究,检验多基因工程菌的降解效果。
研究目标:
A.从富含优势降解菌种的样品中分离筛选出几株能适应高温或高盐条件的高效降解菌,并克隆、分离出其中的多种污染物降解性基因及复杂环境耐受性基因,进而构建出能适应采油废水特点的多基因工程菌。
B.在外文期刊上发表学术论文1-2篇,国内期刊上发表论文2-4篇。
C.培养具有较高科研水平的青年研究人员3-4名及硕士研究生1名。
申请专利2-4项。
拟解决的关键问题:
A.富集、分离、筛选出耐高温或耐高盐的高效采油废水降解菌是本研究的基础及关键。
B.成功克隆出多种污染物降解性基因及复杂环境耐受性基因是本课题需要解决的技术关键问题之一。
利用限制性内切酶、连接酶等将已克隆出的基因构建在同一载体上,并导入大肠杆菌,获得能够高效降解采油废水的多基因工程菌是本课题需要解决的最关键的一个问题。
C.探讨多基因工程菌降解采油废水的可行性研究也是本课题的一个关键。
3. 拟采取的研究方案及可行性分析
研究方案:
A.在前期收集资料的基础上,选择代表性的地区,系统采集石油钻井污泥或石油污染土壤等以及采油废水样品,在现场按不同测试要求进行封装,带回室内进行物理、化学性质分析,同时现场测定样品温度、pH值、含盐量等参数,在实验室条件下测试分析样品的饱和烃和芳香烃的含量(即用石油醚将采油废水中的有机物质提取出来,浓缩一定体积后采用气质联用仪进行分析),结果用于采油废水模拟液的配置。
即在无菌水中加入经过2.2μm滤膜过滤杀菌的石油烃类,稍微加热使之溶解,再加入灭菌的含有KCl、NaCl、Na2HPO4、KH2PO4的高盐溶液和聚丙烯酰胺等聚合物,配置成采油废水模拟液。
B.高效降解菌株的初筛是将采得样品采用稀释平板法进行分离,将培养液适度稀释后,取0.1ml稀释液涂布于含有采油废水组分的分离固体培养基,在高温下(45℃)培养48h,获得在高温条件下可降解采油废水的优势菌种。
同时在常温条件下用含采油废水组分的高盐固体培养基分离在高盐条件下的高效降解菌种。
分两种条件筛选菌种是为了尽量维持菌种对多种污染物的降解能力及菌种的多样性。
两种初步分离筛选完成后,各选择不同颜色及形态的单菌落,接种于斜面培养基中,置冰箱保存。
再进行高效降解菌株的复筛,将上述分离菌株重新接种于采油废水模拟液作为唯一碳源的发酵液体培养基中,分别在高温或高盐条件下,摇床培养72~96h;培养液变浑浊后,再用分离固体培养基分离出单菌落,将纯化菌株接种于斜面培养后,冰箱保存。
对分离筛选得到的高效降解菌,送权威菌种鉴定机构进行鉴定。
C.质粒DNA的提取和基因的克隆,具体的方案参照Sambrook等的《分子克隆指南》和有关的资料进行。
首先从LB平板上挑出筛选出的两种高效降解菌种的单菌落,接种于5ml附加相应抗生素的LB液体培养基中,30℃条件下250rpm振荡培养过夜,之后采用碱裂解法来提取降解性质粒DNA,并用适当的限制性内切酶对质粒DNA进行酶切,利用琼脂糖凝胶电泳法对DNA片段进行分离回收,根据降解酶两端氨基酸序列设计相应的引物,以基因组文库为模板,利用PCR扩增技术分别对高温降解基因及高盐降解基因进行扩增,利用琼脂糖凝胶电泳法筛选出目的基因片段并进行序列分析。
D.多基因载体构建、转化及鉴定。
①载体构建:
在DNA连接酶的催化作用下通过二次连接法进行载体构建,具体方法如下,20μl反应体系中,加入载体(经去磷酸化处理)DNA1μg、外源DNA适量(保持外源DNA与载体DNA的摩尔比为2:
1到1:
1之间),16℃连接过夜,然后置于65℃水浴10min,取5μl连接产物,加蒸馏水及连接酶缓冲液至总体积20μl,重新加入连接酶连接过夜,65℃水浴10min,取5μl连接产物直接用于转化大肠杆菌。
②转化大肠杆菌:
首先制备感受态的大肠杆菌细胞,取0.03ml感受态细胞和4ng连接好的DNA混匀于离心管,置冰浴30min;将离心管置于42℃水浴中热冲击2min,立即置于冰上1分钟;在Ep管中加70μ1LB培养基混匀,37℃培养30min;涂在含适当浓度抗生素的LB平板上;37℃培养过夜,长出的菌斑既为阳性克隆。
③转化体的鉴定:
对目的重组质粒DNA进行酶切电泳鉴定和通过可信度高的Southern杂交法进行进一步鉴定。
Southern杂交质粒电泳采用0.6%琼脂糖凝胶,杂交膜使用尼龙膜,采用碱转移法将DNA单链转移到尼龙膜上,用随机引物法标记探针,杂交及显色均按《分子克隆指南》进行。
E.多基因工程菌降解采油废水的模拟实验。
取适量采油废水模拟液加入比色皿中,利用紫外分光光度计,进行光谱扫描。
测出模拟液的最大吸收峰。
然后,挑取多基因工程菌单菌落加入采油废水模拟液中,在45℃振荡箱中振荡培养。
以未接种多基因工程菌的为阴性对照,分别测量0、1、2、3、4、5、6、8、12、16、24h等时间段的模拟液的最大吸收峰峰值。
同时抽取几组模拟液,经石油醚吸收后上气相色谱质谱仪进行平行对比测试。
后期改变模拟液中的石油烃、高盐及聚合物配比,以及pH值、温度、盐度等参数,测试菌种对不同环境的适应能力。
技术路线:
可行性分析:
本项目利用成熟的菌种分离筛选技术以及分子生物学技术,筛选出采油废水的高效降解菌并使用连接酶将高效降解菌的多种污染物降解性基因及复杂环境耐受性基因串联构建在同一载体上,然后转化成高效的多基因工程菌,对采油废水进行降解实验。
因此,本项目从理论和技术的角度是可行的。
项目申请人硕士阶段(2005年-2008年)主要从事基因工程菌的构建以及生物工程菌处理有机废气、废水的实验研究,对本项目的研究领域有较深的了解和掌握。
本项目参加人员基本由青年研究工作者组成,其中既包括了微生物环境工程室的主要科研力量,又加入了本单位的国土资源部地下水矿泉水及环境监测中心的实验工作人员。
在之前的工作中,研究组成员已经熟练了高效降解菌种分离筛选的技术。
依托正在进行地调项目专题“污灌区水土污染自然衰减调查评价”的研究,也正在开展细菌DNA的提取及PCR等分子生物学技术的实验,并积极与中国科学院生态环境研究中心合作,实验技术和大型分子生物学设备的使用都可得到极大的支持。
所以,本项目从人员和技术的角度是可行的。
实验所需的生物学仪器设备如PCR扩增仪、电泳仪及成像系统、高速冷冻离心机、生化纯水机、超低温冰箱、无菌实验室、生化培养箱和全温振荡器本实验室已具备。
而且借助本单位的国土资源部地下水矿泉水及环境监测中心的测试平台,可以对采油废水的各种成分进行准确的分析,完全满足本项目的研究目标。
因此,本项目从实验设备角度来讲是可行的。
4. 本项目的特色与创新之处
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