生化分离技术讲义.docx
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生化分离技术讲义
《生物分离工程》课程教学大纲(2008年)
一、目的
《生物分离工程》是《生物化学》、《物理化学》、《微生物学》、《食品工程原理》或《化工原理》或《化工单元操作》、《化工热力学》等课程的延续和深化课程,为生物工程专业、生化工程专业本科生开设的一门技术基础课程。
其目的是使学生系统地学习物质分离和提纯过程中的概念、原理、技术及工艺,了解各种分离技术及其应用,提高学生的科研能力及水平。
二、要求
该课程采取课堂讲授与课堂讨论相结合、讲授与自学相结合的教学方式。
要求学生大量阅读参考教材、查阅有关各种分离新技术的文献;在掌握分离技术的共同特征、分类及发展动向的基础上,熟悉并掌握各种分离新技术及其应用。
三、课程主要内容
绪论(2学时)
第一部分萃取分离技术(8学时)
第一章溶剂萃取
1.1萃取过程的理论基础
1.2萃取方式的理论计算
第二章双水相萃取(Two-aqueousphaseextraction)
2.1双水相体系
2.2双水相萃取过程的理论基础
2.3物质分配平衡的因素
2.4双水相萃取技术的应用
2.5水相萃取技术的进展
第三章反胶束萃取
3.1反胶束溶液形成的条件和特征
3.2反胶束萃取蛋白质的基本原理
3.3影响反胶束萃取蛋白质的主要因素
3.4反胶束萃取蛋白质的应用
第四章凝胶萃取
4.1凝胶萃取分离过程
4.2凝胶萃取的理论基础
4.3凝胶萃取的应用
第五章超临界流体萃取
5.1超临界流体的性质
5.2超临界流体萃取的热力学基础
5.3超临界流体萃取过程
5.4超临界流体萃取的应用
第二部分吸附分离、离子交换分离及色层分离技术(8学时)
.吸附分离和离子交换分离
第一章概述
1.1吸附分离过程、解吸方法及应用
1.2吸附剂
1.3吸附剂基础性能的测试
第二章吸附平衡
2.1吸附平衡和吸附平衡关系式
2.2吸附热力学
第三章不等温(变温)吸附分离
3.1气体的净制和回收
3.2吸附干燥剂和吸湿平衡
3.3固定床吸附操作的计算
3.4不等温吸附操作的计算
第四章变压吸附分离
4.1变压吸附分离的应用和发展
4.2变压吸附的操作过程和循环
4.3变压吸附干燥净制和空气分离
4.4变压吸附分离操作的数学模型
第五章离子交换分离技术
5.1离子交换剂
5.2离子交换平衡及交换动力学
色层分离技术
第一章色层分离的一般原理
1.1色层分离技术的分类
1.2分配平衡
1.3色层分离效率
第二章离子交换色层分离技术
2.1离子交换色层分离技术概述
2.2离子交换色层分离
第三章萃取色层分离技术
3.1萃取色层分离技术概述
3.2萃取色层分离与溶剂萃取分离的关系
3.3萃取色层分离过程
第四章凝胶色层分离技术
4.1凝胶色层分离技术概述
4.2凝胶和溶剂
4.3凝胶色层分离技术的应用
第五章吸附色层分离技术
5.1吸附色层分离技术概述
5.2吸附剂和溶剂
5.3吸附色层分离技术的应用
第六章亲合色层分离技术
6.1亲合色层分离技术概述
6.2载体、配基和偶联
6.3吸附和解吸
6.4亲合色层分离技术的应用
第三部分膜分离技术(10学时)
第一章概述
1.1膜分离技术发展的历史
1.2膜的概念(定义)、分类、膜材料及膜组件
1.3膜分离技术的类型及定义
第二章反渗透
2.1基本概念
2.2反渗透过程的基本流程
2.3反渗透膜
第三章超滤膜、微滤及纳米膜过滤
3.1基本原理
3.2超滤膜、微滤膜及纳米过滤膜
第四章电渗析
4.1电渗析的基本原理
4.2离子交换膜
4.3电渗析过程的极化和结垢问题
4.4电渗析的应用
第五章亲和膜分离及亲和膜过滤
5.1亲和膜分离
5.2亲和-膜过滤
第六章渗透蒸发
6.1原理和特点
6.2渗透蒸发膜及膜材料的选择
6.3应用
第七章其他膜分离过程
7.1膜蒸馏
7.2膜萃取
第八章液态膜分离技术
8.1液态膜及其分类
8.2液态膜分离的机理
8.3液态膜材料的选择与液态膜分离的操作过程
8.4应用
第四部分其它现代分离技术(4学时)
第一章包结分离技术
1.1包结分离的基本原理
1.2包结分离技术的应用
第二章结晶分离技术
2.1结晶分离的基本原理
2.2结晶分离过程
2.3结晶分离技术的应用
第三章分子蒸馏分离技术
3.1分子蒸馏的原理和模型
3.2分子蒸馏的应用
四、课程教材
1孙彦.生物分离工程.北京:
化学工业出版社
2严希康.生化分离技术.上海:
华东理工大学出版社,1996
3J.D.Seader,ErnestJ.Henley.SeparationProcessPrinciples(分离过程原理).北京:
化学工业出版社
五、主要参考书:
1E.克雷耳著.陈甘棠译.实验室蒸馏指南——中间工厂蒸馏的导论.北京:
化学工业出版社,1986
2叶振华.化工吸附分离过程.中国百化出版社,1987
3朱长乐等.化学工程手册(18).薄膜过程.北京:
化学工业出版社,1987
4高明恒等.膜分离技术基础.北京:
科学出版社,1989
5叶振华.吸着分离过程基础工业.北京:
化学工业出版社,1989
6[美]C.贾德森.金.分离过程.北京:
化学工业出版社,1990
7史继芬.多级分离过程.北京:
化学工业出版社,1991
8吴俊生等.分离工程.上海:
华东化工学院出版社,1992
9蒋维钧.新型传质分离技术.北京:
化学工业出版社,1992
10刘茉娥等.新型分离技术基础.杭州:
浙江大学出版社,1993
11刘国诠.生物工程下游技术.北京:
化学工业出版社,1993
12王学松.膜分离技术及其应用.北京:
科学出版社,1994
13陆九芳等.分离过程化学.北京:
清华大学出版社,1994
14高孔荣等.食品分离技术.广州:
华南理工大学出版社,1998
15KingCJ.SeparationProcess.2nded.NewYork:
McGraw-Hill,1980
16DMRuthven,PrinciplesofAdsorptionandAdsorptionProcesses,NewYork:
JohnWileyandsons,1986
17KingCJ.Separation&Purification-CriticalNeedsOpportunities.WashingtonDC:
NationalAcademyPress,1987
18BelterPA,CusslerEL,HuW.Bioseparation-DownstreamProcessingforBiotechnology.NewYork:
JohnWiley,1988
19FLSlejko,AdsorptionTechnology,NewYork:
MarcelDekker,1990
20AsenjoJuanA.SeparationProcessesinBiotechnology.NewYork:
MarcelDekker,1990
21WeatherLR.EngineerinProcessesforBioseparation.London:
Butterworth-Heineman,1994
第一章绪论
1.1生物技术和生物分离技术
生物技术:
有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。
生物加工过程(bioprocess),包括选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程。
生物分离过程,包括提取、浓缩、纯化、成品化过程。
1.2生物分离的一般过程
1.一般过程
动、植物组织、体液等胞外产物提取
胞外产物提取
发酵液→预处理→分离→破碎→碎片分离→初步纯化→精制→制成品
培养液加热沉淀匀化离心沉淀分子筛无菌过滤
酶反应调pH离心超声萃取吸附离子交换超滤
絮凝过滤胞溶过滤萃取亲和冻干
错流过滤研磨错流过滤超滤吸附喷干
憎水结晶
电泳
2.几个概念
1)生物分离工程的定义:
为提取生物产品时所需的原理、方法、技术及相关硬件设备的总称,指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液和动植物组织细胞与体液等中提取、分离纯化、富集生物产品的过程(DownstreamProcessing)生物技术下游工程
2)Downstream(下游)与上游相对的概念,一般而言,上游指基因克隆、细胞培养等目的产物表达工序,下游指从表达有目的产物的复杂的混合液中分离纯化得到符合要求的目的产物的一系列步骤。
美、日、欧等发达国家生物技术产品工业化的实践证明:
生物技术产品的产业化高度依赖于基因工程下游工序技术及设备的进步。
3)单元操作:
完成一道工序所需的一种方法和手段。
1.3历史沿革
1、古代:
酿酒、酱油、醋、干酪等(蒸馏或过滤);
2、1860起:
发现微生物导致发酵,工业生产酒精、丙酮、丁醇(压滤、蒸馏、精馏);
3、1940起:
青霉素、链霉素等抗生素、氨基酸、有机酸、酶制剂、单细胞蛋白。
提出单元操作概念,引入下游加工过程。
4、1970起:
基因工程、酶工程、细胞工程等发展,现代生物技术产品的要求。
1.4生化产品的类型
1.按用途分类
食品类
保健品类
医用类产品(1998年,719种)
抗生素112种
农业用产品(1998年,36种)
生物试剂类(1998年,975种)
2.按分子量大小分类
Mass<1000D:
抗生素、有机酸、aa、多肽类等
Mass>1000D:
酶、抗原、抗体、多肽、蛋白质类
3.按发酵时目的产物所在的位置分类
cell内:
胰岛素、白细胞介素、干扰素、重组蛋白质
cell外:
抗生素(青霉素、红霉素)、胞外酶(α-淀粉酶)等
1.5生化产品的特点
1.应用面广。
医药卫生、环保、动植物生长调节、食品和试剂等
2.种类繁多。
分子量X0–X,000,000,结构功能复杂,生物活性各异。
3.目的产物在初始物料中的含量低。
青霉素(4.2%)、庆大霉素(0.2%)、干扰素(<50ug/ml)。
4.产品价格与产物浓度呈反比:
5.初始物料成分复杂。
除少量产物外,还有大量的细胞及碎片、其他代谢物(几百上千种)、培养基成分、无机盐等。
6.生物活性物质的稳定性低。
易变质、易失活、易变性,对温度、pH值、重金属离子、有机溶剂、剪切力、表面张力等非常敏感。
7.产品的质量要求高,尤其是药品等。
成品青霉素对其强致敏原---青霉噻唑蛋白必须控制RIA值(放射免疫测定)小于100(1.5*10-6),蛋白类药物(杂质<2%)、重组胰岛素(Humulin)中杂蛋白小于0.01%。
1.6生物分离工作的重要性
1.生化产品的必经的过程(一夫挡关)。
2.回收率不高。
抗生素(80%左右),蛋白质(60-90%)。
意义?
3.分离纯化昂贵。
下游研究费用占整个R&D费用的50%以上;产品的成本构成中分离纯化的成本站全部成本的40-80%;精细和药用产品的成本比率更高;大多数酶70%。
意义?
4.基因工程的R&D费用,下游占50-80%。
基因工程表达产品成本85-90%;劳动力和物力成本占整个劳动力的70-90%。
意义?
5.中药现代化的重要技术平台。
农学、分离科学、生化分析、药学等
6.提供产品竞争力的关键技术之一。
WTO,降低生产成本、提高产品标准。
7.环境污染的治理(慢性铅中毒)
1.7生物分离工程的分类
原理技术应用
Phasechange1)、蒸馏乙醇
沸点和蒸汽压2)、精馏有机溶剂回收
0h3)、蒸发制盐、抗生素富集
Extraction1)、液-液萃取抗生素
分配系数2)、液-固萃取中药分离
4h3)、双水相萃取酶
4)、反胶束萃取DNA重组蛋白质
5)、超临界萃取中药提取
Densitydifference1)、常规离心细胞分离
比重、密度2)、高速离心细胞、病毒分离
2h3)、超速离心病毒,细胞器,DNA
Membrane1)、常规过滤发酵液
膜分离2)、微滤细菌、细胞碎片
3)、超滤蛋白质、酶
4h4)、纳滤有机物回收,污水治理
5)、反渗透海水淡化、污水处理
Solubility1)、结晶味精
溶解度2)、盐析蛋白质、酶
4h3)、有机试剂蛋白质
4)、等电点法蛋白质、酶
Absorbance1)、非特异性吸附抗生素
(吸附)2)、特异性吸附抗体
2h3)、亲和吸附抗原抗体
4)、离子交换抗生素
Chromatography1)、凝胶抗生素、蛋白质
(色谱或层析)2)、亲和色谱抗体
6h3)、离子交换蛋白质
ElectricField1)、磁性免疫微球抗原抗体
(场致分离)2)、区带电泳蛋白质
6h3)、等速电泳蛋白类
4)、等点聚焦电泳蛋白类
1.8方法选择的基本原则
1)、尽可能简单、低耗、高效、快速。
反面例子----中药现代化、超临界萃取;
正面例子
2)、分离步骤尽可能少。
Why?
A)、
φn为总回收率,λn为各单元回收率。
意义?
分离步骤越多,回收率越低;如φ10=0.9510=0.63,φ5=0.955=0.77
B)、分离步骤多,设备投入大,人员物资消耗大,生产周期长
How?
3)、避免相同原理的分离技术多次重复出现
比喻,分子筛和超滤技术按分子量大小分离,重复应用两次以上,意义就不大了。
4)、尽量减少新化合物进入待分离的溶液。
A)、引起新的化学污染;B)、蛋白质的变性失活
5)、合理的分离步骤次序。
原则是:
先低选择性,后高选择性;先高通量,后低通量;先粗分,后精分;先低成本,后高成本。
1.9设计前应了解的信息
1)、在设计前,首先要掌握的产物物化性质,主要包括:
(1)、溶解度及影响因素,包括温度、pH值、有机溶剂和盐等;
(2)、分子量和分子形状。
对于高分子物质非常有意义;
(3)、沸点和蒸汽压。
对于热稳定的小分子物质非常有意义;
(4)、极性大小;
(5)、分子电荷及影响因素,包括pH值和盐等;
(6)、功能团。
功能团为萃取剂和特异性吸附的选择提供依据;
(7)、免疫原性。
设计亲和色谱;
(8)、稳定性及其影响因素,包括温度、pH值、毒性试剂等(如青霉素低pH不稳定);
(9)、分子的淌度及影响因素,包括pH值、离子强度和盐等;
(10)、等电点pI;
2)、成品规格(或产品质量标准)
表1.3五肽胃泌素的上海市药品标准(1993年版32页)
指标名称指标
含量(C37H49N7O9S)97.0-103.0
比旋光度-25˚~-29˚
吸收值比A(280nm):
A(288nm)=1.12-1.22
氨基酸各氨基酸之比为1
干燥失重,%0.5
3)、进料的组成和物性
(1)、目的产物的浓度。
高?
低?
(2)、物料中的与目的产物相近物质组成的物理化学性质。
(3)、目的产物的定位。
是胞内还是胞外?
(4)、菌种的种类和形态。
(5)、微生物的含量和发酵液的黏度。
4)、生产规模
5)、危害性
(1)、离心产生的气溶胶、发酵产生的废气、干燥产生的粉尘等。
(2)、目的产物本身的危害性;抗肿瘤代谢类药物,类固醇类抗生素,激素类药物等。
(3)、试剂危害。
萃取试剂CCl4、甲苯、苯、二甲苯、CNBr。
(4)、微生物的危害。
重组DNA工程菌不能任意排放。
这一菌种为新的物种,不能排除对生态系统和人的危害。
6)、分批分离还是连续纯化
1.10对环境的考虑
1)、废水
A、除菌过滤和灭菌处理;
B、符合BOD的要求;
2)、废料
A、灭菌处理;
B、综合利用:
动物饲料、饲料添加剂,有机肥料
3)、废气
A、除菌过滤和灭菌处理;
B、废气(有机溶剂)回收
4)、溶剂的回收
A、减少环境排放,减少污染;
B、循环利用,减低成本
1.11分离效率的评价
1)、浓缩率(富积率,concentrationfactor)
原料(Rawmaterial)分离器产品(Product)
FW,VW,cT,W,cX,W
废液(Wastefluid)
意义:
1)、如mT>1,则目标产物得到富积;2)、如mT=mX,则目标产物未得到分离纯化。
2)分离因子(separativefactor),或分离系数(separativecoefficient)
意义:
A、目标产物浓度,杂质浓度,则分离因子大,分离效率;B、=1时,则未分离。
故在分离为主要目的时,
3)回收率(recovery):
4)纯化因子(purificationfactor)
对于具有生物活性的蛋白质或酶,常常用分离前后目标产物的比活2.A[inU/mg]之比表示目标产物的分离纯化程度,
1.12生物分离技术的发展趋势
存在的问题:
研发费用高、成本高、周期长——生物工程发展的瓶颈
如何解决?
1)、加强基础理论研究
A、研究非理想溶液中溶质与添加物料之间的选择性机制、影响因素1.
B、研究界面的结构、动力学和传质机制,以及影响因素2.
C、下游加工过程的数学模型的建立和计算机模拟。
难
2)、完善老技术:
正确对待“新”、“老”分离技术
第二章细胞分离与破碎
2.1固液分离的分类
1、过滤(重力过滤器、压滤器、真空过滤器)
2、离心
3、重力沉降
4、气悬浮
2.2发酵液的组成
悬浮液:
指固体颗粒在0.1m以上的固液分散体系。
生物细胞培养液基本上也是悬浮液。
培养液的组成:
水70-80%+
固体细胞及碎片20-30%(对微生物发酵)+
少量的代谢成物+
细胞破裂后的内容物+
残存的培养基成分
2.3培养液的基本特征
A、细胞成分及碎片大小不一,颗粒大小,分离成本。
B、固液密度相近,黏度高:
沉降和离心分离困难
C、固体成分可压缩可变形+高黏度:
过滤困难,黏附在滤布,错流过滤形成凝胶层
D、动植物细胞抗剪切力差:
错流膜过滤和离心等不适
E、流变性复杂,非牛顿型流体,青霉素发酵液为卡森型流体,120h链霉素发酵液为拟塑性流体,灰色链丝菌发酵液为塑性流体。
2.4悬浮液的预处理
预处理的目的:
改变发酵液的物理性质(黏度、颗粒、颗粒稳定性等),固液分离速度,分离器分离效率;
目标产物转移其中一相(多数为液相);
去杂质
预处理方法
加热:
最简单和最廉价的处理方法。
黏度、促凝聚、固体成分体积、破坏凝胶结构、增加空隙率、去蛋白
调pH值:
方法简单有效、成本低廉;
凝聚:
在凝聚剂(如铝盐、铁盐、石灰和NaCl)作用下,细胞蛋白质等(准)胶体去稳定,并聚集成1mm大小的凝聚块的过程。
凝聚剂种类:
A、无机盐类,如硫酸铝、明矾、硫酸铁、硫酸亚铁、FeCl3、AlCl3、ZnCl、硫酸镁等;B、无机碱,如Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、CaO等;C、聚合无机盐,如聚合铝、聚合铁。
机理:
A、破坏双电层,B、水解后胶体吸附,C、氢键结合等。
絮凝:
在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下,胶体颗粒和聚合电解质交连成网,形成10mm大小的絮凝团过程。
絮凝剂种类:
A、阳离子类,如聚丙烯酰胺(+)、聚苯烯酸二烷基胺乙酯、聚二烯丙基四胺;B、阴离子类,如聚丙烯酸纳、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺(-);C、非离子类,如聚丙烯酰胺(0)、环氧化乙烯。
机理:
絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用
惰性助滤剂:
一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质,用于扩大过滤表面的适应范围,减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。
使用方法:
A、预涂层;B、按一定比率混合。
助滤剂种类:
硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙,及它们的混合物等。
用量标准:
A、单位质量助滤剂所产生的最大滤液产量(最常用);B、或最长周期;C、或最快流速;D、或滤饼的最大空间利用度。
2.5过滤基础理论
Darcy定理、Kozeny’s方程、比阻定义、Ruth’s方程、恒压过滤方程
2.6常用新型过滤器
2.7过滤器的选择
2.8中试设计的路线
2.9细胞的破碎和分离
物理法
化学法
固体剪切法(珠磨法)
酶溶法
液体剪切法
化学降解法(酸碱法)
撞击法
表面活性剂法
超声法
有机溶剂膨胀法
渗透法
萃取法
见生化分离技术第二章第三节内容
3.3细胞破碎技术
1)、固体剪切法(珠磨法,c最有效的物理破碎法)
2)、液体剪切法(最常用的方法之一)
3)撞击破碎法
操作:
细胞喷雾高速冻结
300m/s氮气流
优点:
A、细胞破碎仅发生在撞击的一瞬间,破碎程度均匀,避免反复和过度破碎;
B、破碎的程度可无级调节,避免细胞内部结构的破坏,特别适合于细胞器的回收;
C、实验室和工业规模均可应用,细胞浓度在10-20%,实验室规模的间歇处理能力在50-500mL/h,工业规模的连续处理在10,000mL/h以上。
4)超声破碎法(15—25kHz)
机理:
在超声作用下产生的空穴化作用(cavitation),空穴的形成和闭合产生极大的冲击波和剪切力。
优点:
适合于多种细胞的破碎
缺点:
A、影响因素多,如振幅、黏度、表面张力、液体体积和流速、探头材料和形状;B、超声产生超氧离子毒害作用;C、有效能量的利用率低;D、产热大,需控温;E、不易放大,仅应用于实验室规模的细胞破碎。
5)化学破碎法
酶溶法、酸碱法、有机溶剂胞溶法、表面活性剂法
酶溶法:
利用酶分解细胞壁上特出的化学键,使细胞壁破碎。
优点:
A、产品释放的选择性;
B、提取速度和收效高;
C、产品的破坏小;
D、对外界环境,如pH和温度等要求低;
E、不残留细胞碎片。
物理破碎法缺点:
A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高),易使产品变性失活;
B、非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难;
C、细胞碎片大小不一,难分离。
化学破碎法缺点:
A、费用高;
B、引起新的污染,尤其是其他化学方法;
C、一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用。
3.5破碎方法的选择
选择的一般原则
A、提取产物在细胞质内,用机械法破碎
B、提取产物在细胞膜附近,用化学法
C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法
破碎技术杂交研究应注意的问题
A、杂交技术可产生很大优势。
如
B、破碎技术对下游分离技术的影响。
破碎颗粒清除
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