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关于银纳米颗粒增强脑胶质瘤细胞放射灵敏性的研究
关于银纳米颗粒增强脑胶质瘤细胞放射灵敏性的研究
马珺,孙新臣,徐睿智,赵迪,童金龙,葛小林
【摘要】目的:
通过制备3组尺寸的银纳米颗粒来研究其增强脑胶质瘤放射医治的成效。
方式:
采纳柠檬酸钠还原体系制备20、50和100nm尺寸的银颗粒,通过扫描电镜来表征;检测3种尺寸的银纳米颗粒的细胞毒性和确信保证细胞活性的平安剂量;通过MTT比色法和集落形成实验检测3组尺寸的银纳米颗粒对脑胶质瘤细胞放射医治的成效;通过流式细胞术检测银纳米颗粒对细胞周期和细胞放疗后凋亡率的阻碍。
结果:
20nm的银颗粒能够显著增强脑胶质瘤细胞的放射灵敏性,50nm的银颗粒次之,而100nm的银颗粒无明显效应。
结论:
小粒径的银纳米颗粒能够增强脑胶质瘤细胞的放射灵敏性,为临床放射医治提供新的前景。
【关键词】银纳米颗粒;放射增敏;存活分数;细胞凋亡
[Abstract]Objective:
Tostudytheeffectofthreetypesofsilvernanoparticlesonenhancingradiosensitivityofgliomacells.Methods:
20,50and100nmsilvernanoparticleswereallpreparedinsodiumcitratesystemandwerecharacterizedbySEMandTEM.Thecytotoxicitywastestedandtheproperdosewasdeterminedtoguaranteethelittleeffectoncellviability.TheeffectofsilvernanoparticlesonradiosensitivityofgliomacellswasdetectedbyMTTassayandcolonyformingassay.ThecellcyclesandapoptosisafterirradiationweretestedbyFCM.Results:
20nmsilvernanoparticlessignificantlysensitizedtheeffectofirradiationtreatmentuponcancercells.50nmsilvernanoparticleshadlesseffectand100nmsilvernanoparticleshadlittle.Conclusion:
Smallsizeofsilvernanoparticlecanefficientlyenhancecytotoxicityofirradiationofglioma,whichprovidenewprospectforclinicalradiotherapy.
[Keywords]silvernanoparticles;enhancingradiosensitivity;survivalfraction;apoptosis
银纳米颗粒在生物医学领域有很多应用价值,它能够作为高性能的抗菌材料[1-4]、光学传感器和生物标记物[5-7]。
除此之外,银纳米颗粒还能够抑制病毒的复制,具有抗病毒的功效[8-10]。
最近一项研究[11]显示,银纳米颗粒能够进入癌细胞线粒体和胞核中,并能够直接对癌细胞的线粒体产生毒性,损伤癌细胞的DNA。
该研究以为银纳米颗粒破坏了癌细胞线粒体的呼吸作用,增加了活性氧的产物,中止了ATP的合成,反过来致使了DNA的受损。
DNA的损伤通过银纳米颗粒和DNA彼此作用进一步增大,致使了细胞割裂在G2/M期停滞。
因此,银纳米颗粒被以为在癌症医治中具有开发的潜力和价值。
作者在上述前人研究的基础上,提出了利用银纳米颗粒作为肿瘤放疗的增敏剂,旨在提高肿瘤细胞放射灵敏性,增强X射线对肿瘤细胞的杀伤作用。
1材料和方式
银纳米颗粒的制备
3种尺寸的银纳米颗粒均从柠檬酸钠体系、经不同的操纵还原方式取得[12-13]。
在扫描电镜下对颗粒粒径进行统计分析,确认3种样品尺寸集中散布于20、50和100nm。
取得后银纳米颗粒经离心处置弃掉原溶液中上清,将颗粒溶于少量新生牛血清中,依照血清∶DMEM=1∶9的比例加入DMEM培育基,最后样品采纳μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌。
细胞培育
U251细胞购自中国科学院上海细胞研究所,置于含10%新生牛血清的DMEM培育基中,在37℃、5%的CO2孵育箱中培育。
RNaseA、DMSO、MTT和PI购自Sigma公司。
MTT比色实验分组
将U251细胞分为银纳米颗粒结合放疗组和单纯放疗组,分为0、、、、、、Gy7个剂量照射组。
细胞和银纳米颗粒孵育24h后同意X射线照射,然后接种至96孔板培育,于48h后终止培育弃去原细胞培育液,每孔加入100μl新鲜配制的含MTT的无血清培育液,37℃继续培育4h,终止培育。
每孔加入二甲基亚砜(DMSO),振荡10min。
选择570nm波长,在全自动酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A),记录结果。
克隆形成实验分组
将U251细胞分为银纳米颗粒结合放疗组和单纯放疗组,分为0、、、、、、Gy7个剂量照射组。
细胞和银纳米颗粒孵育24h后同意X射线照射,然后稀释至200(0~4Gy)或2000(6Gy)细胞·孔-1接种至6孔板培育14d后终止培育,固定、染色。
细胞凋亡检测
将对数生长期的U251细胞加入AgNPs,37℃、5%CO2培育箱中培育24h后照射,再过48h后搜集约105细胞。
用PBS洗涤细胞2次。
加入BindingBuffer悬浮细胞。
加入AnnexinVEGFP混匀后,加入PropidiumIodioe,混匀。
室温、避光、反映15min。
1h内用流式细胞仪检测荧光强度,并分析数据。
细胞周期检测
将对数生长期的U251细胞加入AgNPs,37℃、5%CO2培育箱中培育24h后照射,再过48h后搜集约105细胞。
用PBS洗涤细胞1次后搜集。
用70%乙醇固定24h,4℃保留。
染色前用PBS洗去固定液。
加入RNaseA37℃水浴30min。
再加入PI(50μg·ml-1)染色混匀,4℃避光30min。
上机检测,记录激发波长488nm处红色荧光。
统计学处置
数据以均数±标准差表示,采纳SPSS软件进行单因素方差分析,组间不同比较采纳t查验,P<为不同有统计学意义。
2结果
3个尺寸的银纳米颗粒的细胞毒性
由于银纳米颗粒能够在溶液体系中缓释出银离子,体系中银离子的含量取决于银纳米颗粒自身的性质(尺寸和表面包覆等)和颗粒的浓度。
游离的银离子对细胞存在着毒性,银纳米颗粒那么存在对细胞剂量依托的毒性关系。
通过MTT检测发觉,随着银纳米颗粒尺寸的增加,IC50值在增大。
其中,20nm的银颗粒(图1)在100μg·ml-1以上显示出明显的细胞毒性(图2)。
由于银纳米颗粒对细胞存在剂量依托的毒性关系,本研究在做放疗增敏实验时均采纳IC50值的1/5。
在如此低剂量下,银纳米颗粒对细胞活性阻碍就很微弱。
本研究中采纳的银纳米颗粒的剂量是20(20nm)、45(50nm)和150μg·ml-1(100nm)。
图120nm的银纳米颗粒SEM图片
Fig1SEMimageof20nmsilvernanoparticles图2和20nm的银纳米颗粒共孵育的U251细胞照片
Fig2ThephotoofU251cellstreatedwith20nmsilverMTT和集落实验显示银纳米颗粒降低细胞照射后的存活率脑胶质瘤细胞和银纳米颗粒共孵育24h后经射线照射处置,然后去除原培育液中的银纳米颗粒,继续培育48h。
48h后,通过MTT别离检测各组细胞的活性。
结果显示,20nm和50nm的银纳米颗粒结合放疗组的细胞活性相对单纯放疗组有明显的下降,而100nm的银颗粒那么无明显转变。
其中,20nm的银纳米颗粒结合X射线对U251细胞活性的阻碍如图3所示。
图3MTT结果显示和20nm银纳米颗粒共孵育后,经照射U251细胞生存率相对单纯放疗组明显下降
Fig3MTTresultsshowedthatthesurvivalratedecreasedafterU251cellstreatedwith20nmsilvernanoparticlesandirradiation本研究着重对20nm的银颗粒进行进一步的实验。
集落形成实验是对细胞在放疗后增殖能力更精准的验证明验。
集落实验显示,和银纳米颗粒共孵育的细胞在照射射线后生存分数(集落数量)相对单纯放疗组有明显下降的趋势(图4),这意味着肿瘤细胞经银纳米颗粒和X射线一起作用后增殖能力显著降低。
图4集落实验显示,20nm银纳米颗粒能够显著降低细胞照射后的生存率
Fig4Thecolonyformingassayshowedthat20nmsilvernanoparticlescouldsignificantlydecreasecellsurvivalrateafter流式细胞术显示银纳米颗粒能够提高细胞照射后的凋亡率AnnexinVPI检测进一步说明,银纳米颗粒结合放疗组的细胞凋亡率相对单纯放疗组有显著提高(图5)。
文献[14]报导银纳米颗粒能够引发更多的细胞停止在G2/M期,本研究的结果和其一致。
银纳米颗粒诱导了肿瘤细胞进行周期关卡的自检和修复,而随后经X射线照射作用,更多的细胞进入了凋亡环节。
图5AnnexinVPI检测结果显示20nm银纳米颗粒结合放疗能够显著提高细胞凋亡率
Fig5TheAnnexinVPItestshowedthat20nmsilvernanoparticlescouldsignificantlyenhancecellapoptosisrateafterirradiation3讨论
当前纳米科学与技术正飞速地向前进展,并非断地与各个学科交叉融合,产生出新的研究领域和新的学科生长点,专门是近几年已愈来愈多地渗透到医学领域,形成了一个快速进展的新学科。
因此,纳米科学的进展为放射增敏剂的研究提供了新的平台。
纳米材料与放射增敏关系的研究国内外已有一些文献报导。
如利用PLGA纳米材料包裹SR2508(依他硝唑)、多西紫杉醇等对MCF7和HeLa细胞进行放射增敏[15-16]。
金纳米材料在老鼠结肠癌细胞株和乳腺癌细胞株上均发觉增敏现象[14,17]。
本研究在前人研究的基础上提出利用银纳米颗粒增强肿瘤放疗的作用。
银纳米颗粒在体外对细胞的毒性相对一样剂量的银离子要小很多,在低浓度下对细胞活性的阻碍微弱。
银纳米颗粒对细胞的毒性存在剂量依托的关系,而且和自身尺寸相关。
选取低剂量的银纳米颗粒和肿瘤细胞共孵育,银纳米颗粒能够进入肿瘤细胞内缓释出银离子,从而干扰细胞DNA的复制与修复[11]。
受干扰的肿瘤细胞经X射线照射后,更多的细胞再也不停留于自检和修复时期,而直接进入凋亡。
本研究通过实验验证,20nm的银纳米颗粒能够显著降低肿瘤细胞放疗后的存活分数,50nm的银颗粒次之,而100nm的银颗粒那么无明显现象。
作者以为这可能是20nm的银颗粒更易被细胞吞噬,而且相对其它两种颗粒在细胞内能够缓释出更多的银离子。
集落形成实验是衡量细胞在同意射线照射后增殖能力的一个金标准。
本研究通过集落实验验证U251细胞通过和20nm银颗粒共孵育后,经X射线照射后的存活率相对单纯放疗组呈明显下降趋势。
通过流式细胞术的检测显示,和20nm银颗粒共孵育的细胞照射射线后凋亡率取得进一步提高。
通过对本研究结果的分析能够推测,在不远的以后,能够进一步开发出以银纳米颗粒为核心的药物,从而达到增强放疗成效的目的。
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