成体半月板细胞体外分区培育研究.docx
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成体半月板细胞体外分区培育研究
成体半月板细胞体外分区培育研究
【摘要】目的分区培育成体半月板细胞,观看不同区域的半月板细胞生长特性和生长因子对其的阻碍。
方式无菌切取1月龄雄性山羊双后肢半月板,剪碎后DHanks液漂洗,Ⅱ型胶原酶振荡消化,滤网过滤后离心搜集细胞。
接种6孔细胞培育板,每孔1×105个,37℃、体积分数为的CO二、饱和湿度培育。
绘制生长曲线,台盼蓝染色测细胞活力。
细胞爬片行苏木精伊红及Ⅱ型胶原免疫组化染色。
RTPCR检测aggrecan的表达。
用流式细胞仪检测细胞周期的散布。
结果山羊成体半月板细胞自36h后开始贴壁,外侧区细胞以长梭形为主,内侧区以多角形为主,混合区细胞形态为混合型。
台盼蓝拒染实验测细胞活力约为92%。
群体倍增时刻约为h。
加入人胰岛素样生长因子Ⅰ和碱性成纤维细胞生长因子后细胞增殖加速,多角形细胞增多;细胞爬片行Ⅱ型胶原免疫组化染色证明在转染细胞胞浆中有棕黄色颗粒。
RTPCR检测结果显示目的条带与aggrecan的预期大小相符。
流式细胞仪检测加入生长因子后的半月板细胞S期比例增加,而G1期细胞减少。
结论不同区域的半月板细胞有形态不同。
加入生长因子后可增进其生长、增殖。
【关键词】半月板胫骨胰岛素样生长因子成纤维细胞生长因子2
[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatethemorphologyofculturedmeniscalfibrochondrocytesindifferentareasandtheinfluenceofgrowthfactoronthecells.MethodsThemenisciweretakenfrombothhindlimbsofonemontholdmalegoatundersterilecondition,cutintopieces,rinsedwithDHanks,thendigestedwithtypeⅡcollagenase.Fibrochondrocyteswerecollectedandculturedat37℃with5%CO2undersaturatedhumidity.TrypanbluestainandimmunohistochemistrystainoftypeⅡcollagenwereappliedtodeterminethevitalityofthecells.Reversetranscriptionpolymerasechainreaction(RTPCR)wasusedtostudytheexpressionofaggrecanandflowcytometrytoanalyzethedistributionofthecellcycle.ResultsMeniscalfibrochondrocytesadheredtothedisk36hoursafterinoculation.Theperipheralcellsweremostlyfusiformed,thecentralcellspolygonalandthecellsinbetweenmixed.Trypanbluefailedtostainthecells.AfteraddinghIGFⅠandbFGFtothemedium,morepolygonalcellswerefoundintheperipheralregion.Aflowcytometrystudyshowedthatthecellproliferationwasaccelerated:
percentageofmeniscalchondrocytesintheSstageincreased,whileinG1stagedecreased.ImmunoreactiveproductoftypeⅡcollagenwasdetectedintheculturedcellsbyimmunohistochemistryandtheexistenceofaggrecanbandprovedbyRTPCR.ConclusionThemorphologyofculturedmeniscalfibrochondrocyteswasdifferentindifferentregions.ThecellproliferationcanbeacceleratedbyhIGFⅠandbFGF.
[KEYWORDS]meniscus,tibial;insulinlikegrowthfactorⅠ;fibroblastgrowthfactor2
半月板在临床上依照血运供给、经受机械应力和解剖部位不同分为红区、白区和红白区,尽管半月板以纤维软骨细胞为主,但考虑到其不同区域经受应力刺激和血循环、营养来源不同,各区的细胞群体形态应该也有不同。
因此,本实验对不同区域的细胞别离分离培育,观看不同区域细胞在体外单层培育条件下的形态不同,并同时观看人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGFⅠ)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对其生长特性的阻碍。
1材料与方式
半月板不同区域细胞的体外单层培育
无菌条件下切取成年山羊半月板,无菌PBS液漂洗2次,将内1/3、中1/3、外1/3三个区域别离剪碎成1mm3大小碎块,加入g/L胰蛋白酶和2g/L的Ⅱ型胶原酶,37℃振荡消化,离心搜集细胞,加入含体积分数的FBS、105U/L的青霉素钠、105g/L链霉素的DMEM培育液重悬细胞。
血细胞计数板法行细胞计数后,按1×105个/孔接种于6孔板。
37℃、体积分数为的CO二、饱和湿度培育。
隔日换液1次,用倒置相差显微镜观看细胞生长情形,当长至70%~80%融合时消化传代培育。
在条件培育液中别离加入终浓度为60μg/L的bFGF和终浓度为100μg/L的hIGFⅠ。
细胞生长特性检测
台盼蓝拒染实验检测细胞活性将细胞稀释至1×109/L,取9滴细胞悬液移入小试管中,加入1滴4g/L台盼蓝溶液混匀。
在3min内计数活细胞和死细胞,死细胞被染成蓝色。
计算活细胞率:
活细胞率=(活细胞总数/计数细胞总数)×100%。
测定细胞群体倍增时刻(PDT)在接种时和接种后不同时刻进行细胞计数,按下述公式计算PDT:
PDT={log2/(logNtlogN0)}×t,其中N0、Nt别离代表接种时和培育th后的细胞数。
生长曲线的描记接种24孔培育板,分8组,每组3孔,每日计数1组,共8d。
以培育时刻为横轴,细胞数量为纵轴(对数),刻画在半对数坐标纸上,连成曲线。
在曲线上细胞数量增加1倍的时刻为细胞倍增时刻。
细胞爬片苏木精伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色
半月板细胞传代时接种于预先放入无菌盖玻片的6孔板内,长至60%~70%融合后行苏木精伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。
RTPCR检测aggrecan的表达
TRIZOL法提取加入生长因子培育的半月板细胞的总RNA,行RNA电泳观看28S和18SrRNA的位置及形状,确信有无RNA的降解。
依照GenBank发布的序列分析设计aggrecan的特异性引物。
上游引物:
5′CGAAACAGCCACCTCCCCAACAG3′;下游引物:
5′CCCTCTGTAGCTGGGAAGGCATAAGCAT3′。
RTPCR反映产物行10g/L琼脂糖凝胶电泳检测有无目的条带显现。
流式细胞仪检测细胞周期散布
搜集加入或不加入生长因子的细胞行流式细胞仪检测细胞周期的散布情形。
2结果
半月板不同区域细胞的分离及体外单层培育
半月板细胞在接种后约36h开始贴壁,并慢慢伸展。
培育至10d左右可长至70%~80%融合,台盼蓝拒染实验测得细胞活力在92%以上。
无血运区半月板细胞以多角形软骨细胞为主,有血运区那么大部份为长梭形成纤维样细胞,混合培育那么两种细胞形态混合存在。
3组不同区域细胞的生长速度大致相似,外侧稍快于内侧。
传代后细胞贴壁速度及生长速度均高于原代细胞,细胞表型无明显改变。
计算半月板细胞的PDT约为h。
生长曲线描记显示,半月板细胞在通过2d的滞留期后,开始进入对数增加期,在76d的对数增加期内持续割裂增殖,然后转为平台期,现在细胞生长割裂渐趋稳固。
加入生长因子后,外侧区半月板细胞多角形细胞所占比例增多;内侧区那么多表现为细胞增殖旺盛,割裂象增多,细胞表型的改变不明显。
混合区细胞表现也多为细胞割裂增殖加速。
细胞爬片苏木精伊红染色结果
细胞爬片苏木精伊红染色见胞核深染,细胞轮廓清楚,胞浆内可见颗粒,部份细胞可见明显核割裂象。
Ⅱ型胶原免疫组化染色说明,在细胞浆中有大量棕黄色深染的颗粒显现。
RTPCR检测aggrecan的表达
细胞加入生长因子培育后,提取其总RNA行RTPCR,结果有约200bp条带显现,说明有软骨细胞特异表型标记蛋白aggrecan的表达。
流式细胞仪检测细胞周期散布
传代后的半月板细胞以G1期为主,在加入生长因子培育以后,S期细胞比例增加,说明细胞生长割裂增殖活力较旺盛。
3讨论
半月板的要紧成份是纤维软骨细胞,其基质成份以Ⅰ型胶原为主。
它在膝关节内的重要性已愈来愈明确并受到重视,它能够传导负荷,吸收震荡减少应力,提高关节稳固性,限制膝关节的过度伸屈,并可对关节的润滑与营养起增进作用。
因此,最近几年来对半月板的医治观念已经发生专门大转变,修复,包括缝合、钉合和各类生物学修复成为主流方式,并显示了良好的初期疗效。
本实验观看到半月板不同区域培育细胞的形态、增殖特性和对外源生长因子的反映各不相同。
内侧区的半月板细胞以多角形为主,属纤维软骨细胞样表型,贴壁相对缓慢,细胞群体倍增时刻也较长,割裂增殖较外侧为慢;而外侧区那么以长梭形的成纤维细胞样细胞为主,贴壁迅速,细胞群体倍增时刻短,割裂增殖相对旺盛。
而红白交壤区(中1/3段)那么是两种细胞类型的混合群体,其生长特性也介于二者之间,两种细胞也遵循各自的生长特性。
外侧半月板细胞对生长因子相对灵敏,在增快割裂增殖的基础上,也伴有部份细胞的形态改变,如胞体增大、回缩,透亮度增加,向多角形、短梭形或椭圆形转变等。
而内侧半月板细胞那么仅以割裂增殖加速为主,其形态改变不明显,细胞表型大体得以维持。
不同区域半月板细胞的表型不同,可能与其不同部份的营养来源及经受应力不同有关。
半月板内侧为无血运区,其产生能量的要紧方式是无氧糖酵解,其营养要紧来自滑液供给,经受的应力也是以压应力和剪切应力为主,这种环境类似于关节软骨,因此其细胞表型可能更大程度上类似于关节软骨。
而外侧的营养供给除部份来自滑液外,大部份营养物质还取自血液供给,经受的应力也是以张应力为主,这种特点可能使其细胞表型更类似于与其毗邻的关节滑膜细胞或纤维组织细胞。
WEBBER等[2]在体外培育半月板细胞时发觉其对培育液的种类较灵敏,以DMEM培育时为多角形,以HAMsF12培育液培育那么为线形。
年龄与性别并非阻碍细胞单层培育的性质。
本实验应用DMEM培育液培育仍观看到半月板外侧区细胞呈成纤维细胞样表型,并未检测到不同培育液对细胞表型有何阻碍。
hIGFⅠ是胰岛素样生长因子家族中的重要成员,也是其中生物学活性最强和研究最充分的成员。
hIGFⅠ具有超级普遍的生物学活性,关于骨细胞和成骨细胞具有中等增进有丝割裂的作用,能够增进成骨细胞的分化、增殖与召募,增进成骨细胞的胶原、骨钙素的合成和对磷的吸收和氨基酸的运输[3]。
hIGFⅠ也可刺激DNA和蛋白聚糖的合成,加速细胞分化增殖,并可提高细胞成熟度,对软骨基质合成和稳固也起着关键作用[4]。
bFGF是重要的有丝割裂增进分子,也是形态发生和分化的诱导因子,在正常生理及病理进程中参与生长发育和组织损伤的修复进程。
在研究的所有生长因子中,bFGF被以为是对软骨细胞作用最强的有丝割裂原,可刺激蛋白聚糖及胶原的合成[5]。
BOLANDER等[6]发觉,bFGF可直接刺激体外培育的成软骨细胞的增殖并分化为软骨细胞或使其本身数量增加。
同时,KATO等[7]也证明,bFGF可促使软骨细胞合成及释放硫酸软骨素糖蛋白和Ⅱ型胶原,使细胞外基质增多。
软骨细胞本身可分泌bFGF,不仅具有增进细胞增殖的作用,同时还能够使增殖的细胞稳固地向成熟软骨细胞分化。
本实验结果显示,加入两种生长因子后,可对不同区域半月板细胞产生较明显的阻碍,细胞割裂增殖加速,表现为细胞群体倍增时刻缩短,细胞割裂象比例增多,在高倍镜下可见许多细胞明显的有丝割裂象。
转染后S期细胞比例也相应升高,说明细胞的DNA及蛋白质等的合成功能也较旺盛,外侧区半月板细胞生长加速,部份细胞形态发生转变,胞体增大,多角形细胞所占比例增多。
内侧区那么多表现为细胞增殖旺盛,割裂象增多,细胞表型的改变不甚明显。
混合区细胞表现也多为细胞割裂增殖加速。
【参考文献】
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[2]WEBBERRJ.Invitrocultureofmeniscaltissue[J].ClinOrthop,1990,252:
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[3]TRIPPELSB,CORVOLMT,DUMONTIERMF,etal.EffectofsomatomedinC/insulinlikegrowthfactorⅠandgrowthhormoneonculturedgrowthplateandarticularchondrocytes[J].PediatrRes,1989,25:
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