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毕业2论文初稿
脂肪酶测定方法的探讨
目录
中文摘要:
对碱性脂肪酶酶活的测定方法进行了研究,通过根霉发酵产脂肪酶和酶的粗分离基本可得到纯度较好的酶的组分,对分离酶过程中的硫酸铵浓度的影响进行研究,得到能不影响酶活的最佳硫酸铵浓度,对脂肪酶的最佳反应pH进行测定,并研究在最佳pH下缓冲液的离子浓度等对酶活测定是否造成影响。
关键词:
脂肪酶;制备;粗分离;酶活力。
0前言
碱性脂肪酶在国际市场上还是一个新酶种。
碱性脂肪酶是在碱性条件下水解的脂肪酶,生产的主要原料为小麦、玉米等农副产物,通过生物发酵技术转化。
它可以水解天然油脂,产生脂肪酸和甘油,是一种专门在异相系统油水接口上水解特殊酯类的酶。
由于三磷酸钠作为助洗剂在洗涤剂中的大量使用,导致了江河湖泊产生“过肥化”,给生态环境带来危害。
于是许多国家在开发具有良好效果的低磷或无磷洗涤剂,酶作为一种助洗剂正是顺着这个潮流而发展起来的[1.2」。
又因为洗涤剂中碱性的居多,尤其是家庭用洗涤用品,所以各种应用于洗涤剂行业的碱性酶制剂大量产生。
国外加酶洗涤剂在洗涤剂总产量中的含量近年来也逐年升高,其中日本加酶洗涤剂高达95%左右;西欧达90%。
国内目前在各种洗涤剂用酶上的研究也己有很大进展。
脂肪酶是一种高活性的生物催化剂,对脂类化合物分解有催化作用,反应是在油水界面上进行的。
它可使甘油脂水解成一甘油二脂、单甘脂和脂肪酸,因而利于衣物中皮脂类污垢的除去。
同时反应不须要辅助酶,[4〕且本身无毒,并能被生物完全降解,.对环境无污染。
我们常用各种含酶洗衣粉,其中的酶制剂主要有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
碱性蛋白酶用于分解蛋白质类污物,如汗渍、血渍等。
碱性脂肪酶则主要作用于脂肪酸及其酯类污物,也就是我们通常所指的油污类。
脂肪酶的水解底物一般为天然油脂,其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键,反应产物为甘油二酯、甘油单酯、甘油和脂肪酸。
该反应的重要特征是异相系统反应,即在油-水的界面上作用[1],再加上酶解反应本身是一个机制十分复杂的催化反应,反应速度较慢,这就决定了反应的不稳定性。
许多因素都会影响酶解反应的速度,如反应底物的种类及形态、稳定时间、反应体系的酸度、温度等。
脂肪酶可将甘油酯(油、脂)水解,在不同阶段可释放出脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯及甘油。
水解生成的脂肪酸,可以用标准的碱溶液滴定,以滴定值表示酶活力。
反应式为:
RCOOH+NaOH=RCOONa+H2O
脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸,通常只有一条多肽链。
它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构。
0.1脂肪酶的来源
脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。
植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子,如蓖麻籽、油菜籽,当油料种子发芽时,脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类,提供种子生根发芽所必需的养料和能量;动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织,在肠液中含有少量的脂肪酶,用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足,在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。
在动物体内,各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程;细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富(Pandey等)。
由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异,具有比动植物更广的作用pH、作用温度范围以及底物专一性,且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶,适合于工业化大生产和获得高纯度样品,因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源,并且在理论研究方面也具有重要的意义。
脂肪酶在微生物中有广泛的分布,其产生菌主要是霉菌和细菌。
已经公布的适用于甘油三酯加工的不同来源的脂肪酶有33种,其中18种来自霉菌,7种来自细菌。
0.2脂肪酶的应用
0.2.1食品工业
利用酶作用后释放出的链较短的脂肪酸,增加和改进食品的风味和香味;利用脂肪酶催化的醇解和酯化反应来生产各种香精酯,作调料剂;用有1,3-专一性的微生物脂肪酶提高食用油营养价值和增加食用油的花色品种,制备代可可酯等高档油脂;另外,脂肪酶还可以用于酒类的去浊除渣、改善面包质量,改善蛋白的发泡等等方面。
利用脂肪酶来生产兼具机能性与保健疗效的新结构油脂及其衍生物,例如油脂改造(例如可可脂替代品、增加一般动植物油脂中PUFA的含量。
),乳化剂(例如glucoseesters),抗氧化剂,香料等,不仅增加油脂的广泛应用性,也提升油脂工业的经济效益与发展潜力。
0.2.2洗涤剂工业
Novo公司首先将含脂肪酶的洗涤剂推向国际市场,作为洗涤剂的增效剂,该酶在15~60℃、pH9.0以上的条件下可去除油污。
用来做为家庭或工业用清洁剂的添加物,是脂肪酶的最大商业应用领域。
根据统计,1995年全球的酵素销售总值约在3千万美元,其中清洁剂酵素就占了百分之三十,平均每年估计有一千公吨的脂肪酶被加到一百三十公吨的清洁剂中。
0.2.3有机相脂肪酶催化合成精细化学产品
八十年代,用脂肪酶在有机溶剂中催化合成低分子量羧酸酯系列香精酯、萜烯醇酯、中长链脂肪酸短链醇酯及长链脂肪酸长链脂肪醇酯等系列产品的研究开发取得了显著进展,且产品可归入GRAS(一般认为是安全的)范畴,视作天然的“绿色”替代品。
目前酶法合成酯产品已从实验室研究迈向工业化生产,成为补充和取代部分化学合成产品的又一新的生产工艺,在生产实际中很多酯化产品如生物柴油、维A棕榈酸酯、棕榈酸异辛酯等产品在经济和环保两方面的优势已经超过了化学合成法。
0.2.4消旋混合物的光学拆分
酶催化反应的高效性、高立体选择性及温和反应条件使得酶催化拆分法可用于某些用一般法难以拆分的手性化合物。
脂肪酶是水解酶,对广泛的底物能催化不对称水解或不对称酯化。
脂肪酶对手性化合物如醇、羧酸、酯、酰胺和胺等均有较好的立体选择性,因此脂肪酶被广泛地用来拆分外消旋醇和羧酸。
拆分的主要途径为立体选择性水解、酯化或转酯反应。
用乙烯基酯为活性酯,在无水二氯甲烷中用假单胞菌脂肪酶催化氰醇的化学拆分,得S型醇,经化学转化合成β-肾上腺素抑制剂。
此外,脂肪酶还用于酯环仲醇的拆分,拟除虫菊酯中间体的拆分,除草剂对甲氧基苯甲酸基奈普生、布罗芬的拆分等
0.2.5纺织工业
一、精炼(scouring)木棉纤维,方法简单且不伤木棉纤维;二、去除蚕丝及羊毛上的油脂(degumming)。
皮革工业用于兽皮的去油脂处理(degreasing),可增加铬在兽皮上的吸收与分散、增加染料的吸收、减少化学药剂的用量及去油脂处理时间、减少铬在废水中的排放量与废水的污染性。
清洁剂工业将嵌在衣物纤维间的脂肪污垢分解去除。
油脂化学工业生产高价值的油脂。
0.2.6环保业
一、废水处理及清理排水管;二、去除造纸用白水及冷却水的黏泥(slime)。
0.2.7脂肪酶在制药工业的应用
利用脂肪酶独特的立体镜像选择性(Enantioselectivity),可以有效率地区别具有光学活性的立体异构物,以合成多种药物如非类固醇之抗发炎药物(如naproxen,ibuprofen,suprofenandketoprofen),nikkomycin-B等抗生素,抗病毒药物(如lamivudine,可用来对抗爱滋毒HIV),抗癌药物、alkaloids、以及维生素等。
0.2.8脂肪酶在生物感应器工业的应用
采用化学方法来定量分析脂质成份,不但花费昂贵而且耗费时间,较不符合经济效益。
以脂肪酶作成的生物感应器,是一种较为新的方法。
脂肪酶生物感应器除了已被应用在临床样本的诊断外,新的应用领域还包括食品工业、饮料工业、环境污染物(如杀虫剂)之分析以及制药工业等。
0.2.9其它应用
一、隐形眼镜片清洁剂的添加物;二、化装品及洗发剂的添加物。
1.材料与方法
1.1材料
碱性脂肪酶(江苏省丹凤集团公司生产);聚乙烯醇(分子量1750,北京旭东化工厂产品);三丁酸甘油酯;橄榄油(cp)及其它无机试剂。
1.2仪器
恒温水浴锅,精密酸度计,磁力搅拌器,高速组织捣碎机等。
1.3试验方法
1.3.1反应底物乳化液的制备
称取30g聚乙烯醇(PVA),加900ml水,加热溶解,冷却后用6mol/L氢氧化钠调至pH为10.0,过滤,定容至100ml.
量取上述PVA溶液150ml,加入橄榄油50ml,用高速组织捣碎机搅拌6min,4000r/min,前后各3min,间隔5min,液备用。
1.3.20.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶液的制备
称取1.88g甘氨酸,加入约480ml水溶解,用6mol/L氢氧化钠调节pH至10.0,
定容至500ml,备用。
需新鲜配置。
1.3.30.05mol/L氢氧化钠溶液的制备
取4.5g固体氢氧化钠溶于1L水,用邻苯二甲酸氢钾标定,使用时再稀释一倍。
1.3.4酶活的定义
在反应条件下,每分钟催化脂肪水解产生1μmol脂肪酸的脂肪酶量,定义为一个脂肪酶国际单位(u).
1.3.5酶活的测定
在三角瓶中,加入一定量缓冲溶液和乳化液,放入一定温度的恒温水浴锅中,再加入酶液反应并计时,一定时间后终止反应,用0.05mol/L氢氧化钠滴定游离出的脂肪酸,同时做空白样(先加终止剂,后加酶液,其余同样品操作)[2]。
1.36酶活的计算
酶活=(V-V0)t×50×n
其中:
V为样品所耗碱的体积(ml)
V0为空白耗碱的体积(ml)
t为反应时间(min)
n为稀释倍数
50为1ml0.05mol/L氢氧化钠的微摩尔数
2结果与分析
2.1脂肪酶的制备
2.1.1 固态发酵生产脂肪酶的特点
固体基质发酵(solidsubstratesfermentation,SSF)广义的定义是指一切使用不溶性固体基质来培养微生物的工艺过程。
固态发酵生产脂肪酶的微生物很多,大多数是真菌,如Penicilliumsimplicissimum,Penicilliumverrucosum,Penicilliumrestrictum,Penicilliumcandidum,Rhizopushomothallicus,Rhizopusrhizopodiformis,Rhizopusoligosporus,Rhizopuschinensis,Rhizomucorpusillus,Aspergillusflavus,Aspergillusniger,Candidarugosa,Yeastlipolytica等,部分细菌如Burkholderiacepacia,Pseudomonasaeruginosa,Bacilluscoagulans等也可以采用固态发酵方式生产脂肪酶。
与液态深层发酵(submergedfermentations,SmF)相比,它具有以下优点[7]:
(1)培养基简单且来源广泛,多为便宜的天然基质或工农业生产的下脚料;
(2)投资少、能耗低、技术较简单;(3)产物的产率较高;(4)基质含水量低,可大大减少生物反应器的体积,不需要废水处理,环境污染较少,后处理加工方便;(5)发酵过程一般不需要严格的无菌操作;(6)通气一般可由气体扩散或间歇通风完成,不需要连续通风,空气一般也不需严格的无菌空气。
固态发酵的缺点是发酵不均匀,菌体生长、营养物的吸收和代谢产物的分泌在各处都是不均匀的,存在严重的浓度梯度及传热、传质困难,使得发酵参数(pH、热、营养条件等)的检测和控制均比较困难,较难实现工业化。
固态发酵中的微生物在接近自然的环境中生长,具有更高的代谢活性。
真菌酶的固态发酵生产与液态发酵相比,生产力较高,底物抑制效应较弱,产酶具有较高的温度和pH稳定性,发酵时间可缩短,且酶被蛋白酶降解的机会降低[9]。
固态发酵产
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