有机农药防治烟草青枯病.docx
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有机农药防治烟草青枯病
分类号:
密级:
UDC:
编号:
硕士学位论文
蜂胶对烟草青枯病防治效果的初步研究
EffectofpropolisonthepreventionandcontrolofTobaccobacterialwilt
硕士研究生:
孔聪聪
指导教师:
兰建强副教授
申请学位类别:
农学硕士
专 业:
农药学
培 养 学 院:
植物保护学院
二O一三年四月
EffectofpropolisonthepreventionandcontrolofTobaccobacterialwilt
KongCongcong
AThesissubmittedto
YunnanAgriculturalUniversity
InspecialFulfillmentoftheRequirementsfor
MasterDegreeofPesticide
DirectedbyAssociateProfessorLanJian-qiang
DepartmentofPesticideScienceofPlantProtectionCollege
YunnanAgriculturalUniversity,Yunnan,
Kunming650201,China
April2013
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得云南农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。
研究生签名:
时间:
年月日
关于学位论文使用授权的声明
本人完全了解云南农业大学有关保存、使用学位论文的管理办法及规定,即:
云南农业大学有权保留送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。
同意云南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。
(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)
研究生签名:
时间:
年月日
导师签名:
时间:
年月日
目录
摘要1
ABSTRACT2
1.引言3
1.1我国烟草病害的研究进展3
1.2烟草青枯病3
1.2.1病原4
1.2.2症状4
1.2.3致病性变异4
1.2.4生化型研究5
1.2.5发病机制6
1.2.6田间发病动态7
1.2.7病害流行规律7
1.3烟草青枯病的防治研究8
1.3.1抗病品种的利用8
1.3.2农业防治8
1.3.3生物防治9
1.3.4化学防治10
1.3.5施用抗性诱导剂10
1.3.6转基因植物的利用10
1.4蜂胶11
1.4.1蜂胶特性11
1.4.2蜂胶的主要化学成分及差异性12
1.4.3蜂胶中的主要活性物质12
1.4.4蜂胶中主要活性物质的功能12
1.4.5蜂胶的应用13
1.5绿色有机烟草15
1.5.1国内外有机烟叶发展现状15
1.5.2有机烟叶种植技术体系研究17
1.5.3我国有机烟叶的发展优势与对策18
1.6本实验的目的及意义19
2.材料与方法20
2.1材料20
2.1.1菌种20
2.1.2培养基20
2.1.3供试烟苗21
2.1.4供试药剂21
2.1.5实验仪器21
2.2试验方法21
2.2.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验21
2.2.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验22
2.2.3室内盆栽试验23
2.2.4田间药效试验24
3.结果分析24
3.1五种烤烟品种对烟草青枯病的抗病性试验24
3.2青枯假单胞杆菌的药剂筛选试验27
3.2.1农用链霉素的抑菌活性28
3.2.2多菌灵的抑菌活性28
3.2.3蜂胶的抑菌活性28
3.2.4复配I(农用链霉素+蜂胶)的抑菌活性28
3.2.5复配II(多菌灵+蜂胶)的抑菌活性29
3.2.6几种药剂处理对烟草青枯病防治的综合评价29
3.3室内盆栽药效试验29
3.4田间药效试验30
4.讨论30
4.1烟草青枯病的接种方法30
4.2五种烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗性30
4.3蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果31
4.4蜂胶对烟草青枯病的防治效果31
4.5盆栽试验与田间药效试验中防效的比较32
4.6烟草青枯病的防治32
5.结论32
参考文献34
致谢39
摘要
在有机烟叶生产过程中,不能使用任何化学合成的农药,所以对蜂胶的防治效果进行了测试。
分别通过药剂筛选实验、抗病性实验、盆栽实验及田间药效实验,为蜂胶防治烟草青枯病提供了初步依据:
1.抗病性实验中,通过针刺接种方法与注射接种方法的比较,表明注射接种能使植株更易更快发病,易于本实验研究;通过红花大金元、NC297、MSK326、云87、云97五个烤烟品种对青枯假单胞杆菌的抗病性试验,结果表明红花大金元与云87为高感品种,MSK326与云97为中感品种,NC297为中抗品种,生产种植中应选种NC297。
2.药剂筛选实验中,通过对比72%农用链霉素、90%多菌灵与蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果,结果显示蜂胶对青枯假单胞杆菌的抑制效果不佳,与72%农用链霉素差别明显。
3.盆栽实验与田间药效实验中,通过蜂胶与72%农用链霉素防治烟草青枯病的比较,结果显示蜂胶的防治效果都不超过30%,而72%农用链霉素的防治效果均在65%以上,可见蜂胶对烟草青枯病的防治效果没有农用链霉素好,但还是有一定的防治效果的,尤其作为一种天然产物,对有机、绿色烟叶的生产种植还是有一定的价值跟意义的。
关键字:
烟草青枯病;青枯假单胞杆菌;蜂胶;防治;效果
ABSTRACT
EffectofpropolisonthepreventionandcontrolofTobaccobacterialwilt
KongCongcong
DirectedbyAssociateProfessorLANJian-qiang
Intheorganictobaccoproductionprocess,anychemicalsynthesisofpesticidescannotbeused.Sopropolisweretested.Throughtheresistanceexperiment,thedrugsensitivitytest,thePathogenicitytestandthefieldexperiment,itprovidedapreliminarybasisforthecontroloftobaccobacterialwiltofpropolis:
1.Theresistanceexperiment,throughthecomparisonofacupunctureinoculationmethodandinjectioninoculationmethod,showedthattheinjectioncouldmakeplantsmoreeasyandfastonset.Sotheinjectioninoculationmethodappliedtothisexperimentalstudy.BypathogenicitytoPseudomonassolanacearumofHonghuadajinyuan,NC297,MSK326,yun87andyun97,theresultsshowedthatHonghuadajinyuanandyun87werehighlysusceptiblevarieties,MSK326andyun97weremoderatesusceptiblecultivars,NC297wasmoderateresistantvariety.SoNC297shouldbechosetoplant.
2.Thedrugsensitivitytest,byinhibitingeffectof72%streptomycin,90%carbendazolandpropolisonPseudomonassolanacearum,indicatedthattheinhibitoryeffectofpropolisonPseudomonassolanacearumispoor,with72%streptomycinwassignificantlydifferent.
3.Thepotexperimentandfieldefficacyexperiment,bypropolisand72%streptomycincontroltobaccobacterialwilt,theresultsshowedthatthecontroleffectofpropoliswasmorethan30%,andthecontroleffectof72%streptomycinwasmorethan65%.Itshowedthatthecontroleffectofstreptomycinontobaccobacterialwasbetterthanthepropolis’.Butpropolisstillhavecertaineffect.Especiallythepropolisasabiologicalsourceofdrugs,haveacertainvalueandsignificancetotheproductionoftheorganictobacco.
Keyword:
Tobaccobacterialwilt;Pseudomonassolanacearum;propolis;control;effect
1.引言
烟草是重要的经济作物,在云南省一些经济落后的贫困地区,许多农民靠种植烟草维系生活,是山区农民脱贫致富,提高生活水平的有效途径。
在烟草种植过程中,烟草病害是影响烟草产量、品质的重要因素,因此世界各烟草栽培国均高度重视病害防治。
1.1我国烟草病害的研究进展
根据1997年我国16个产烟省(区)的调查,目前有烟草侵染性病害68种,其中主要病害15种。
已鉴定的62种病害中,真菌性病害30种、细菌性病害8种、病毒病害17种、类菌原体病害2种、线虫病害3种及寄生性种子植物2种。
其中有15种主要烟草病害,他们是(按为害严重程度及分布范围为序)普通花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病、赤星病、黑胫病、炭疽病、青枯病、野火病、马铃薯Y病毒病、蛙眼病、根结线虫病、空茎病、猝倒病、角斑病、根黑腐病、蚀纹病毒病。
真菌病害中,烟草黑胫病、根黑腐病和赤星病为害最为严重。
细菌病害中,为害最为严重的是烟草青枯病和烟草野火病。
病毒病害中,烟草普通花叶病和烟草黄瓜花叶病最为严重,其次是烟草马铃薯Y病毒病[1]。
近年来烤烟苗期病害越来越严重,对烟苗造成了严重影响。
做好烟草苗期病害的综合防治,是培育足够壮苗、提高烟叶产、质量,获得较好经济效益的基础性工作。
目前烤烟苗期病害最普遍、严重的病害主要有烟草炭疽病,猝倒病,立枯病和病毒病。
1.2烟草青枯病
烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的重要病害,1880年该病首先在美国的北卡罗来纳州格兰维尔(Granville)被发现,故当时被广泛称为格兰维尔凋蔫病,在中国则俗称为“烟瘟”、“半边疯”[2]。
1940年前后,该病在美国和印度尼西亚的为害最为严重,此后,在许多产烟国家逐渐演变为烟草上的重要病害,如日本、澳大利亚、韩国等[2]。
目前在中国,长江流域及其以南烟区普遍发生,个别年份常常暴发流行,造成毁灭性损失。
近几年来,该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势,在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生,局部地区为害较重。
云南省烟草青枯病早在1987年就有报道,但危害一直较轻[3,4]。
自2002年以来,云南省南部旱地烟区,烟草青枯病危害上升速度很快,局部地块发病率达到80%以上,且常与烟草黑胫病混合发生,严重时可使全田烟草枯死[5]。
目前,该病造成的损失已居各类病害的第4位,必须重视该病的防治工作。
1.2.1病原
烟草青枯病病原曾用名PseudomonassolanacearumSmith[2]或Burkholderiasolanacearum[3]。
1996年由IJSB正式更名为青枯雷尔氏菌(RalstoniasoanacearumEFSmith)[3,4]。
此后,在国际重大刊物上发表的文章均使用该名。
菌体杆状,革兰氏染色阴性,菌体大小为0.5~0.8×1.3~2.2μm,极生鞭毛1~4根,不形成荚膜和芽孢,为好气性细菌,在兼气下培养,其毒力迅速丧失。
不同寄主上的菌落形态无明显差异。
病菌生长的温度范围为18~37℃,最适温度30~35℃,致死温度为52℃,持续10min;pH值4~8,最适为6.6。
烟草青枯病菌在病残体中可以存活7个月,在土壤或堆肥中可存活2~3年以上,有的竟达8~25年,但在干燥的条件下很快就死亡,在种子表面的病菌2d后即可全部死亡。
在TTC培养基上,菌落中央呈粉红色,周围乳白色流动性较强(郑继法等,1998)[6]。
1.2.2症状
烟草青枯病属典型的维管束病害,根、茎、叶各部位均可受害,但以为害根、茎为主。
最典型的症状是:
叶片枯萎后仍呈绿色,故称“青枯病”。
在病株发病的一侧,叶片枯萎,无病的一侧叶片生长正常,呈现“半边疯”症状。
茎部发病后,外表出现黑色条斑,发病严重时黑色条斑一直延伸到烟株顶部,将病株茎部横切,可见维管束变成褐色,用力挤压切口,会从导管中渗出黄白色乳状粘液,即细菌“菌脓”[7]。
受烟草青枯病菌感染的烟株一般仍然保持直立,不折倒,未摘除的病叶紧贴茎秆上。
烤后症状:
病叶烤后,单叶重减少,光滑,等级下降,化学成份失调。
发病烟叶半片变黄或全片叶变黄时采收,烤后叶色为半叶或全叶杂色;整株烟全部枯萎变黄采收烘烤,烤后叶片为糟片,多为级外烟[8]。
1.2.3致病性变异
青枯雷尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)寄主范围虽然广泛,但菌株间的致病性具有明显寄主专化性[9,10]。
Budenhagen1964年依据不同寄主的致病性,将供试青枯菌株分为3个小种[11]。
近年来的研究发现,桑树青枯菌株的致病性与3个小种都具有明显差异,称为小种4[9,12]。
烟草青枯菌属于小种1,只能侵染茄科植物。
而且进一步的研究表明,不同地区来源的烟草青枯病菌株,对其他不同寄主植物的致病性以及对烟草不同品种的致病性都有显著差异[13]。
王国平等根据烟草青枯病菌株对烤烟品种MSK326的平均致病病级不同,分为强、中和弱致病类群,大多数调查地点强、弱致病类群并存,这表明烟草青枯病菌株间有很大的致病性差异。
青枯菌的致病性在人工培养基上还很容易减弱或丧失,从TTC培养基上菌落的形态可以鉴别致病性不同的菌落。
致病性强的野生型菌株,菌落一般较大,稍凸起,不规则圆形,中央粉红色,边缘乳白色,对光观察可见有轮纹,流动性较强;弱毒或无毒菌株的菌落一般较小,圆形,中央深红色,白边较窄或无白边,菌落表面粗糙或光滑有光泽。
来源不同的菌株之间致病性丧失的速率有很大差异。
研究表明,青枯菌致病性丧失与诸多因素有关,如菌株来源,培养基中碳、氮来源、种类、培养条件等[14]。
青枯菌在培养基上培养时间过长,易产生无毒突变体,而在无菌水中失毒则相对较慢。
分子遗传学研究指出,青枯菌的致病性基因主要携带在一个特大质粒上,而且分布在7个限制性内切酶片段上[15]。
这可能是该菌易变异的主要原因之一。
1.2.4生化型研究
Ralstoniasolanacearum可利用多种有机碳源、无机碳源、氮源,不同来源的菌株对不同碳、氮化合物的利用能力有很大差异。
自20世纪60年代以来,国际上对不同寄主上的青枯病菌株的生化型进行了研究,澳大利亚的ACHayword[16]依据对3种双糖(麦芽糖、纤维二糖、蔗糖)和3种己醇(甘露醇、甜醇、山梨醇)的利用能力,将149个青枯病菌株分为4个生化型。
1986年,华静月等[9,12]又将桑树青枯菌株分为新生化型,即生化型V。
烟草青枯菌的生化型变异很大,不同来源的菌株其生化型有很大差异[11,17],而且菌株经长时间保存后,其所属生化型也会发生变化[17]。
美国北卡的烟草青枯菌菌株主要为生化型Ⅰ[18],中国台湾省以生化型Ⅱ和Ⅲ为主[19],朝鲜则主要为生化型Ⅰ和Ⅳ[20]。
据报道,中国大陆上烟草青枯菌为生化型Ⅲ和Ⅳ[9,12,21],张建华等[21]研究了30个烟草青枯病菌株对3种双糖和3种已醇的利用能力,结果表明,供试青枯菌可分为2个生化型(Ⅲ、Ⅳ),生化型Ⅲ在测试地区和品种上均有发生。
王敏等[22]测定了81个烟草青枯菌菌株的生化型,结果表明,云南省以生化型Ⅲ为主。
在自然或人工培养条件下,青枯菌易产生无毒突变体,其生化型也发生变化,在同一个地区和同一寄主上可以分离到生化型不同的菌株。
张建华等[21]的研究从同一地区的同一品种上也分离到两个或两个以上的生化型。
此外,随着对烟草青枯菌菌株研究数量的增多,还出现了越来越多的不能归入现有任何生化型的中间型菌株[12,21-23]。
故有的学者又提出了生物亚型的概念,但对生化型与生化型之间的关系及其划分标准尚缺乏统一的认识。
1.2.5发病机制
在自然条件下,病原菌通常是从烟株的根部侵入,而且在根系又伤口的条件下更容易侵入。
Lucas等(1975)的研究结果是烟株根系形成伤口后立即进行接种,要比在24h后再接种的感染率要高得多,在伤根48h后再接种,烟株受害率更明显减少,这说明伤口在形成48h后已经基本愈合,可阻止病原菌入侵。
移栽时造成的伤口也比移栽后造成的伤口更易侵入。
病原菌在烟株其他部位侵入也是通过伤口进行的。
但是,在接种细菌数量很大的情况下,即使没有伤口也能侵入。
青枯病菌对烟株的致病作用大致可以分为三个过程,即诱导局部枯萎、破坏组织和整株枯萎。
病原菌侵入皮层后于细胞间隙生长,破坏细胞间的中胶层,使细胞质壁分离,变形,并形成空腔,继而侵染木质部薄壁组织,使导管附近的小细胞受刺激形成侵填体,并移入侵填体。
侵填体破裂后既被释放进入导管,青枯菌在导管内大量繁殖菌体及其代谢产生的大分子物质(主要是胞外多糖,EPS),其影响和阻碍植物体内的水分运输,EPS堵塞导管,并在导管内大量增殖和快速传播扩张,影响和阻碍植物体内水分运输,同时青枯菌还向胞外分泌多种细胞壁降解酶,破坏导管组织,从而引起植株萎蔫和死亡[24]。
青枯病菌引起多种植物的致死性枯萎,主要通过根和茎的伤口,或次生根的根冠进入植物体,侵染寄主的木质部,然后在整个维管束中蔓延,引起严重的萎蔫,最终导致植物死亡。
青枯菌虽然寄主范围广泛,但某些菌系在自然条件下,只能侵染少数几种或某一种植物,因此青枯菌的致病机理十分复杂。
目前,国内外对青枯菌致病机理的研究大量集中在对胞外多糖(EPS,由eps基因编码)、果胶酶(主要为内聚半乳糖醛酸酶,PG,由pgIA基因编码)和纤维素酶(主要为内切葡聚糖酶EG,由egl基因编码)在致病过程中的作用[24]。
青枯病菌在导管中生长时可产生大量胞外多糖,影响和阻塞植物内的水分运输,特别是易于对叶柄结和小叶处较小孔径的导管穿孔板造成堵塞,因而引起植株萎蔫[25]。
20世纪80年代中期以来,已从分子水平上来研究这些因素的作用。
美国威斯康星大学Sequeira实验室在多年研究胞外多糖的基础上,于1991年报道克隆出了控制胞外多糖和脂多糖的基因簇,佐治亚大学Denny实验室克隆出了控制胞外多糖等表型转变的基因,美国的Schell等和Allen等已在分子水平上进行了研究,对聚半乳糖醛酸酶的结构基因及内葡聚糖酶的结构基因均已进行了克隆、测序和功能分析。
结论是这两种酶在青枯菌致病中有一定作用[26]。
此外,在该菌中被鉴定出hrp基因在寄主和病原菌互作中起到重要作用,引起寄主发病[26]。
1.2.6田间发病动态
由于各地地理环境和气候条件不同,青枯病在各地区的发生消长态势存在很大差异。
了解病区烟草青枯病的侵染与发病动态,对病害早期监测,以及药剂防治适宜时期的确定具有重要的指导意义。
有关根部侵染的早期监测研究很少,陈顺辉等提出通过20cm土温和高感品种红花大金元的萎蔫症状监测烟草青枯病的流行动态[27]。
青枯病在我国呈由北向南、由西向东始病期逐渐提早,为害程度逐渐加重的趋势[28]。
烟草青枯病发生危害与品种、耕作类型、栽培管理、地形地势等有密切关系[29]。
据广东省的调查结果表明,在春季5月份日均气温达到23℃以上开始出现烟草青枯病病株;当旬降水50cm以下,相对湿度80%以下,日照率高于15%,青枯病轻度发生;当日均气温为25~30℃,多雨、高温、少日照条件下病害则严重流行。
病原菌从根部侵入后1周或稍长时间,烟株地上部出现青枯症状。
发病后25d内病情发展快,以后病情逐渐减弱[28]。
同一省区平原与山区发病时期也不同,山区比平原发病稍晚一些[30]。
1.2.7病害流行规律
烟草青枯病是高温高湿型病害。
低温高湿或高温干旱都不能使病害发生和流行。
发病最适宜的温度为30~35℃。
湿度是影响该病发病流行的另一重要因素。
雨量多、湿度大,病害发展快,为害重,相反雨量少、湿度低,病害发展受抑制,为害相对较轻。
暴风雨或久旱后遇暴风雨或时雨时晴的闷热天气,更有利于病害的发生和流行,往往易于造成该病的大发生[1]。
不同土壤类型,青枯病的发病程度差异较大。
土质粘重易板结或土壤含沙量过高都易诱发病害。
一般情况下,水田烟发病较轻,旱地烟发病较重,砂壤土发病较轻。
通常地势高的烟地发病较轻,地势低的烟地发病较重,低洼积水处更重,田块的入水口或流水经过处也较重。
青枯病菌主要在土壤中及遗落在土壤中的病残体上越冬,也能在各种生长着的寄主体内及根际越冬。
种子一般是不带菌的。
因此,青枯病菌的主要初侵染源是土壤、病残体和肥料。
病菌靠流水、肥料、病苗、人、畜及生产工具带菌传播。
人工操作和昆虫为害常使该病传播和入侵同时完成。
在诸多因素中,带菌土壤是最重要的初侵染源。
桥本光司(1986)对不同的土层生物鉴定研究表明,在2—25cm的土壤表层,青枯菌分布密度大,幼苗发病率高,累计发病株率为45%一66%,25cm以下的土层病菌少,发病率低于18%。
病田流水是病害再侵染和传播的重要方式。
病组织腐烂后,病菌遗留在土壤中或粪肥中越冬,成为下年的初侵染源。
1.3烟草青枯病的防治研究
青枯病的防治长期以来都是许多学者探索的问题。
1976年,在美国举行了第一届国际细菌性青枯病学术研讨会;1985年,在菲律宾又举行了亚太地区细菌性青枯病学术研讨会;1992年在中国台湾举行了亚洲细菌性青枯病学术研讨会;1997年,在法国举行了第二届国际细菌性青枯病学术研讨会[31]。
各国植病工作
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