细胞周期分析重要知识.docx

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细胞周期分析重要知识

细胞周期生物学基础

细胞的生成依赖于细胞的分裂而产生两个子代细胞的过程。

在分裂过程最需要复制并传递给子代细胞的是细胞核，因为它包含了细胞的遗传信息载体-DNA。

在绝大多数情况下，一个生物体的每个细胞都含有相等的DNA物质和相同成份的染色体。

因此，细胞在分裂前必须复制DNA这样它的子代细胞就能够拥有及父代相同的DNA含量。

细胞由DNA含量增加至分裂，再由它的子代继续复制并分裂，这个过程称之为细胞周期。

在细胞周期中最具特征性的阶段是在分裂前的DNA含量增加并达到2倍量的时候，并在此时细胞开始分裂其自身-有丝分裂期。

细胞周期中这两个循环步骤通常以一字母来表示：

S期（合成期）和M期（有丝分裂期）。

当细胞周期中的S期和M期被定义后，我们可观察到在有丝分裂完成后和DNA合成刚开始之时有短暂的停顿或间隙，同样的停顿或间隙存在于DNA合成期后和有丝分裂开始之时。

这两个间隙我们将之命名为G1和G2期。

这样整个细胞周期可划分为G1→S→G2→M→G1，如下图所示：

图1显示了细胞周期中个环节在流式细胞仪上分析时的图谱特征

当细胞没有进入分裂过程时（我们机体中的绝大部分细胞），它们处于细胞周期的G1期的位置上。

因此G1细胞在数量上绝对是居各期细胞之首并在流式图谱上形成最高的信号峰。

在G1期细胞中有一群细胞特别安静并且没有进入细胞循环的任何生物学特征，我们称这些细胞为G0期细胞。

一些发生在G1和G2期细胞内的生物过程现还不完全明了。

处于G1期的细胞已开始为分裂前的DNA的复制和细胞成长准备许多RNA和蛋白分子。

处于G2期的细胞则会修复在DNA复制过程发生的错误并识别出在M期时将DNA平均等分的切割位置。

细胞循环中这些阶段的长度因细胞种类的不同而不同。

典型细胞循环中各期的发展时间为：

G1期12小时，S期6小时，G2期4小时及M期0.5小时。

分析和流式细胞术细胞周期分析

流式细胞最初的应用之一便是检测细胞的DNA含量，它可快速将细胞循环中的其它阶段及有丝分裂期区别开来。

这些检测是基于对细胞内DNA以化学定量方式的染色（染料着色数量直接及细胞内DNA含量相关）。

有相当多的对DNA有高亲合力的染料可用于此应用。

而不同的染料及DNA分子结合的位点不同。

现用得最多的两种DNA结合染料是蓝光激发的碘化匹啶（PI）（或偶尔也有用EB）和紫外激发的DAPI和Hoechst染料33342和33258。

PI染料是一种插入性的及双链DNA和RNA（当要特异地检测DNA时，经常使用RNAse去除RNA）结合，而DAPI和Hoechst染料仅及DNA的螺旋结构的亚级凹槽结合并及RNA完全没有任何结合。

Hoechst33342是现唯一令人满意的能对活细胞DNA时行染色的染料。

其他一些染料在染色前需要破坏细胞膜，故经常使用去污剂或低渗溶液处理或溶剂进行固定（酒精）。

*注意：

使用溶剂进行固定（如酒精）经常会引起细胞聚集，详情见分析细胞聚集。

当运用DNA结合荧光染料后，可观察到一个有特征的图谱，那就是由各种细胞组成的一个细胞周期分布图。

当二倍体细胞被化学定量式DNA染料着色后并在流式细胞仪上分析，会观察到一个很“窄”荧光峰。

它将出现在以荧光强度为X轴、细胞数量为Y轴的坐标上。

因为种种原因G1期细胞具有相同的DNA含量，理论上G1期细胞的DNA含量荧光强度应当一致，并在直方图上的一个通道上出现信号（如图2.2A中，在直方图上出现一条G1期细胞的荧光直线）。

图2.2分别显示了一个理想状态中一台完美的流式细胞仪无偏差检测的直方图（A）和实际分析得到的呈高斯分布的直方图（B）。

在B图中，使用Dean和Jett多项式S期分析模型进行分析识别出的G1、G2和S期细胞分布。

如果流式细胞仪十分完美且DNA染料的特异性绝对专一，这种情况将会发生。

而在实际中，流式细胞仪本身存在着许多变异性，此外DNA染料的着色也存在生物学的变异。

因此，检测得出的G1期细胞的荧光分布正常的是呈高斯曲线分布。

这种“钟”型分布及检测的变异相关（图2.2B）。

检测中的变异越大，高斯曲线的宽度越宽。

有一个名为“变异系数”（CV）的指标用于描述峰的宽度。

CV是一种规格化的标准差，定义为CV=100*标准差/平均值。

相类似，G2和M期细胞它们拥有两部的正常G1期细胞的DNA含量，从而在直方图上形成一个两倍于G1信号峰D.I.2.0的高斯峰（见图2.2）。

实际上，G2/G1的比值常小于2.0，可能是因为G2期细胞的DNA-蛋白（染色质）聚集得更紧密或更浓缩。

从而DNA染料着色时及DNA位点的结合能力被削弱。

最常见的G2/G1的比值是1.97。

在理论上的完美流式细胞仪上检测时，S期细胞将分布自所有G1期细胞直方图右侧并一至延伸到所有G2期细胞直方图的左侧。

因为细胞一旦开始进入S期便会开始合成DNA，并紧帖着G1期细胞开始向外延伸。

而后DNA含量不断增加直至完成S期阶段进入G2期。

不幸的是，实际中的直方图分布并不是如此简单，这是因为G1、G2期的DNA峰分布并直线，而是有宽度的高斯分布，而S期分布则更宽。

所形成的结果是早期S期细胞及G1期细胞相互叠加，而后期S期细胞及G2期细胞相互叠加。

区分这些叠加细胞而计算出正确的G1、S和G2期细胞是以下章节讨论的内容。

二倍及异倍体细胞的DNA含量

正如前面介绍的那样，机体所有的G1期细胞，极少例外，都具有相同的DNA含量和染色质结构。

在哺乳动物中，每个染色体具有两条构成。

这在细胞遗传学者认为是具有“双重DNA含量”（根据实际观察到的染色体数量）的细胞，并且定义了“2N”来描述它们（N是指单个染色数量，单倍染色体的DNA含量）。

而流式细胞仪通常也有相关的术语来描述：

“DNA指数（D.I.）1.0”来指代这些G1期细胞的DNA含量。

具有其他DNA含量的细胞并意味着一定是属于异常，如以上介绍的S期和G2细胞和仅有单倍染色体生殖细胞，及一些在体内具有四倍DNA含量（D.I.2.0）的细胞（其他例外情况，如存在少数多核细胞）。

所有这些细胞的DNA都具有“整倍”关系，它们之间的差别都是以完整的染色体组为单位的，而这些染色体组中的各染色体都拥有其自身的完整性。

任何DNA含量异常的细胞其染色体组首先发生的异变或致少染色体的结构发生了改变，这们将这些细胞称为“异倍”DNA含量（针对于整倍体之言）。

因为整个细胞或细胞核DNA流式细胞仪无法确切检测出染色体数量，流式细胞仪无法确定哪些是DNA指数为1.0的正常细胞，所以要使用已知样本来事先定义二倍体细胞。

同样的，当细胞的DNA指数为2.0时我们称之为G2期细胞，或四倍体细胞或一个拥有异常DNA含量的异倍体细胞。

在流式细胞仪进行检测时，它的位置事先也要精确地进行定义。

流式细胞仪通过观察DNA指数为非1.0整倍的细胞而能检测出染色体的变化，但这些细胞的染色体的结构和数量必须发生了改变。

因为名词“异倍体”实际是指通过染色体来确认的，当我们通过流式细胞仪检测DNA含量来发现它们时，要以“DNA-异倍体”来形容它们。

DNA异倍体细胞通常，但非绝对，及恶性组织有关系。

但一些例外情况必须注意，如一些良性肿瘤（如内分泌腺肿瘤）和恶变前的上皮细胞。

当一个恶性肿瘤通过流式细胞仪DNA-异倍体峰检测出来时，直方图分析时会发现在肿瘤中异倍体细胞及二倍体细胞相互混合。

二倍体细胞包括淋巴细胞、内皮细胞、纤维原细胞和一些基质成份，它们经常在样本中占一定的数量。

肿瘤和基质细胞都会有部分细胞正在进行细胞循环过程，经历着G1→S→G2→M期（基质细胞的S和G2期细胞数量通常比恶性细胞的要少得多），所以此时得到的DNA直方图通常是由两个细胞循环相互叠加构成的，但MultiCycle和ModFit都有专门的模型对它们进行分析。

细胞周期分析和DNA含量直方图

DNA直方图要求数学方法来进行分析目的是精确地识别出被覆盖的G1、S和G2期细胞的分布；这些分析方法已经历了过去二十多年的发展及完善。

从DNA含量直方图中提炼出细胞周期图的方法也从简单的图形识别发展到更为复杂的曲线拟合。

所有简单分析方法都是基于G1和G2期细胞及S期之间叠加很少，G1和G2期细胞数量及直方图上检测到的G1、G2期数量接近的假设。

有两种具体计算方法。

第一种是通过计算G1期曲线的左半部分和G2期曲线的右半部分，然后翻倍后得出G1、G2期细胞，而剩余部分便是S期细胞。

第二种方法是只利用最中间的S期细胞分布，并向左侧G1期平均荧光强度和右侧G2期平均强度延伸而计算出S期细胞。

而左、右侧剩余部分便分别是G1和G2期细胞。

这些方法仅在只有一个细胞循环周期的直方图上才能得出比较准的结果。

以上两种方法都假设G1和G2峰是左右对称的（实际上不同组织染色后并不形成这种对称峰）并且两峰的中间点能够被精确地识别出来。

然而由于G1和G2峰及S期峰总是相互叠加的，所以这些峰的平均值往往并不在它们的最高点上，特别是G2峰。

如果存在第二个细胞周期时，两种周期的细胞相互叠加从而使这种分析方式变得很不可靠。

此外，在这种简单的图形分析方法通常不对细胞碎片和细胞聚集建立模型进行排除。

更具柔性和精确的细胞周期分析方法是基于用数学方法构造出的DNA含量分布图，然后使用曲线拟合方法将这些模型及数据进行匹配。

建立得最好的模型是由Dean和Jett在1974年通过预言细胞周期直方图是呈高斯分布的理论而建立的。

相互叠加的G1、G2峰和S峰可用高斯曲线重新被描述出来。

在最初的提议中，增宽的S期分布是由一个光滑的二次幂抛物线方程来描述的（抛物线的一个部分，y=a+bx+cx2）。

这个模型可以被简化为一次幂曲线（一个增宽的梯型，如以一条直线方程，y=a+bx）或零度斜线（一个增宽的矩型，直线模型，y=a）来拟合。

当直方图的质量及理想中相差太大时，特别是G1或G2峰不呈高斯曲线分布时（底部增宽，倾斜或存在肩峰），简化模型可减少引起G1、S、G2峰叠加的影响。

正如下面章节将要讨论的那样，这种情况经常出现在临床样本中。

在这种情况下，建意使用保守的零次幂或一次幂来拟后S期，除非对直方图的质量高度可靠可选用二次幂。

有些实验驱动形成的S期（通常是培养细胞）分布将会更复杂些，一些可选的分析模型可运用于这些分布。

最为适合的模型是将S期切割成一系列的高斯曲线，然后计算这些曲线的和。

在这个模型中，每个高斯曲线都可达到任意高度。

因此S期可被完全地描述出来，故此模型适用于一些复杂的S期图型。

以上这些模型的优点也是在实践中的主要缺点。

相当灵活的描述S期峰型时会将任何人为造成的假数据也描述出来，并且还会增加近G1、G2期端的S期区域模糊性。

一个比较折中的解决办法是由Fox（1980）提出的，他在Dean和Jett的多项式S期模型中再增加了一个高斯曲线。

Fox的模型能够较好地描述S期图型并同时又保持了S期曲线的平整性。

它特别适用于分析经药物干预后形成的高S期细胞。

Fox模型整合在MultiCycle软件中，其名称为“SynchronousS”。

使用二次幂曲线模型几乎可拟合所有直方图数据。

拟合模型可生成数学表达式或函数来计算直方图中各期细胞的分布。

表达式中有一系列的参数（通常在7至22），它们必须被调整从而给出最及原始数据一致的模型。

因为模型使的函数并非简单的线性方程，而是非线性的二次幂函数。

对于这种二次幂函数分析方法和相应的计算机程序最初由Bevington（1969）提出。

最为通用此类分析方法是由Marquardt（1963）提出的。

所有的二次幂拟合技术都是带自修整功能的：

拟合函数模型中的参数能自动修正从而可得出及原始数据最为贴近的方程，最终模拟出最接近的图型。

当修正过程中无更优方案出现时，计算便会停止并得出理论上的最佳方案。

拟合的优度使用卡方检测来验证

，或是它的简化公式：

来求证，它可检测拟合数据及实际数据的离散程度。

二次幂拟合的速度是由寻找并发现最佳拟合参数的效率来决定的。

马夸特运算方法会使用优化的方案来寻找最低卡方值及最佳的拟合参数。

二次幂拟合方法的优点这种模型可以直接分析有两个甚至三个细胞周期相互叠加的样本。

叠加模式分析部分是运用去卷积的数学方法来统计单个细胞周期的。

二次幂拟合方法的另一个优点是在拟合过程中它被分析时的起点等参数的影响较小。

这些参数包括人为定义的细胞峰算术平均位置和CVs值，及直方图所分析区域的范围。

当细胞周期和碎片分析模型能最优化地拟合数据时，分析结果几乎不受起始参数和相关人员操作的影响。

有一点需充分认识：

从肿瘤组织中获得的DNA含量直方图经常较正常直方图相去甚远（高CVs值，多碎片和细胞聚集）或更加复杂（出现几个相互叠加的细胞周期），并经常出现意料之外的峰型（如，偏峰及非高斯分布峰型）。

这些情况在福尔马林固定的样本中更为多见。

当一个偏向的G1峰或带有尾峰的G1，其右侧延伸至S期时，对S期细胞的统计应格外小心。

在分析这些不典型直方图时的一个重要方面是通过简化假设来减少模型的拟合参数而降低分析模型的复杂性。

这可能会降低模型对直方图细节的分析能力，但它同样也降低了错误分析数据的可能性。

如上所述，有些模型可能会假设一个偏态的或低部过宽的G0或G1峰是S期的一个部分，从而引起了真正S期细胞的过量统计。

一些更保守的模型在分析，因多个细胞峰相互叠加或聚集细胞和细胞碎片过多时而引起的CVs过宽或细胞峰未很好分离的样本时，它的精度会更好。

这些情况将在以下的章节中进行讨论。

在以上情况下推荐使用Dean和Jett的计算方法中零次幂（加宽矩形）或一次幂（加宽的四边形）来替代较为灵活但更易出错的二次幂模型。

此外还可强制规定G2和G1期峰的CVs值相等（它们通常下是相当接近的），或规定二倍体细胞的CVs值及异倍峰的相等，或根据以往实验室经验提供G2/G1的比值。

请参考第8章-拟合选项，来获得更多的相关信息。

最后，下面将介绍，仔细地拟合细胞聚集和碎片背景也是在分析复杂直方图中获得最佳细胞周期结果的重要方面。

拟合“碎片”及细胞核切割物背景

几乎所有作流式细胞仪DNA含量分析的细胞或细胞核悬液都存在一些被破坏或损坏的细胞核（碎片），它们通常分布在二倍体G1期的左侧。

当样本源自于新鲜组织或细胞，这些碎片信号会出现在直方图的左边界并迅速回落至底线。

在理想状态下，碎片信号并不会影响细胞周期直方图。

然而实际中却非如此，现在发现用计算机拟合碎片分布并去除其对细胞周期各峰的影响至关重要。

传统的碎片拟合假设是碎片曲线从高峰迅速回落至底线并可用一个指数函数（e-kx）来拟合。

但是其中存在两大原因而造成了指数曲线拟合并不能精确模拟出碎片的分布：

1）许多碎片分布并不是真正成指数曲线分布的。

而一个从高峰迅速回落至一定高度后进入一个缓慢回落或平台过程的情况却最为多见。

这个较为缓慢的回落部分对细胞周期的影响比指数曲线预测的影响要大得多。

2）碎片是因为细胞被溶解、破碎或细胞核被切割而造成的，所以它们只向DNA峰的左侧延伸（微小DNA含量峰）。

因此，碎片峰的形态是依靠于DNA直方图中个峰位置的，并且碎片不可能独立于细胞细胞峰之外。

因为S期是细胞周期中含量最低分布最广的部分，S期的计算受以上影响最大。

图2.3.拟合石蜡包埋组织二倍体细胞。

（A）使用简单指数曲线拟合碎片曲线，（B）直方图依靠，指数似后，（C）切核模式拟合碎片。

如图所示各种分析方法对细胞周期中S期的影响各不相同。

简单指数拟合开始点从碎片的最左侧开始至接近于G1峰，如图（D），所得出的S期检测结果及（A）图中差别很大。

图（E）显示窄范围直方图依赖性指数碎片拟合，得出的S期细胞比图（B）要少22%。

相比而言，切核模式拟合的结果受改变分析区域的影响最小，如图（E）。

为了演示以上两种观点，可以试用不同的模型来分析由石蜡包埋组织提取细胞的DNA直方图。

图2.3A显示了以一个简单的指数曲线来拟合G1期峰左侧的碎片。

这种模式并没有识别出许多混入G1期的碎片，根据分析区域的不同过多或过少地预测了混入S和G2期峰内的碎片。

在MultiCycle中整合了一个更为成熟的指数模型来拟合碎片。

在此要意识到DNA碎片是从DNA阳性峰开始只向左侧延伸，MultiCycle中的模型假设每个DNA阳性峰都会产生一定的碎片并向左侧延伸。

因为DNA含量峰左侧从零到阳性出现的左侧及右侧直方图的坐标长度不同，所以MultiCycle指数曲线会拟合出一个看似“陡峭”的曲线，并且它的后端将延续覆盖很多通道并因下降速度不同而出肩峰。

MultiCycle中的“直方图依赖”性指数模型的运用结果如图2.3B和2.3E。

在这两个例子中，因数据中绝大部分细胞都属于G1期，背景碎片曲线由G1峰的左侧向右侧迅速下降。

图2.3E显示了在近G1峰处拟合碎片的曲线，而2.3B显示了远G1峰的拟合曲线。

因为此碎片拟合曲线并不是真正的指数函数，所以选择的分析区域不同得出的曲线也不同。

S期的统计数据也不相同，2.3B及2.3E图中S期值分别是4.1%和3.2%。

从有利的方面分析，这个模型比简单的指数模型要更有效。

然而使用一个可对经切片机处理过和石蜡组织所形成的碎片专门分析的模型可得到一个更佳的分析结果。

此模型可拟合碎片曲线的任何部分，并且它并不受不同分析区域的影响，图2.3C和2.3F显示该模型的结果。

这个模型在分析石蜡切片样本时特别有效，详情见下文。

分析石蜡组织在流式细胞仪DNA检测应用中变得越来越重要。

它不仅可对这类样本进行回顾性研究，从而使流式细胞仪分析结果及病人长期追踪建立关系，而且在许多新鲜组织不可用的情况下分析石蜡标本已作为临床检测的重要来源。

为了取得有效的细胞周期信息，在分离细胞核及选择细胞周期分析模型时要特别注意。

作为从石蜡组织中提取细胞的一个步骤，组织块通常要用切片机将组织切成近50μm的薄片，从而不可避免出现细胞核碎片。

这些细胞核碎片将影响S期细胞的计算，但使用一个可分析切核的模型来分析碎核可有助于纠正这些影响。

可以想象在切片机刀片轨道上的细胞核将被随机地切成两个部分。

如果将细胞核简单地想象成球形体并被垂直地随机切割，切割的部位从零位点到整个细胞核的概率应该是相等的。

在这个假设模型下，将出现一个由自完整核DNA峰相开始的最大切割碎片或未切割核向左延伸到DNA含量为零的连续线。

这当然是一个最简化的模型，但在1988年由MultiCycle推出后，它在拟合这些类型的碎片时比以往的模型的效果都要好。

实际上，需仔细观察这个模型所拟合曲线并比较它及图2.4中介绍的改良后模型的效果。

图2.4.显示了细胞核经切割后形成的碎片。

以最简单的球形细胞核为例，如果细胞核的直径为“r”，刀片以“h”距离切割细胞核，所形成的碎片的体积计算公式如上如所列。

因为细胞核是随机切割的，所以其大小理论分布曲线如上图所示。

因为细胞核在形态实际上很接近圆形或扁椭圆形，在更确切的模型中，细胞核会更多地延未端被切割而产生较小的碎片，产生“新月型”的碎片，而剩余部分则相对较大。

由此产生的切核碎片直方图从零开始至完整核呈凹型分布，而不是平坦分布如图2.4。

Bagwell（1990）已证实这个

圆形模型也同样适用于椭圆形核产生的碎片。

这个模型已被包含在MultiCycle中用于纠正背景碎片的影响。

在用于分析细胞周期的DNA分布图中一般是二倍体和异倍体细胞核的混合物，其中的各个通道中都混有被随机切碎的细胞核并向左延伸形成凹型峰分布，而以上的模型可去除这些影响。

细胞核被切割的可能性要及细胞核的半径相关，在MultiCycle软件中，这种可能性可根据DNA含量的多少（如S期和G2期的细胞核要较G1期的大）来推算细胞核的大小而算出相应的被切割概率。

图2.5.使用切核模式分析淋巴细胞（A，D，G）,Hela细胞（B，E，H）和两者的混合物（C，F，I）细胞周期。

（A,B,C）是对新鲜细胞分析的直方图，（D,E,H）是采自经50微米切片的石蜡包埋组织,（G,H,I）是采自经20微米切片的石蜡包埋组织.经软件拟合的碎片部分用水平阴影线表示，S期用对角网格线表示。