学年高中生物第1部分微生物的利用第1课时大肠杆菌的培养和分离学案浙科版选修1.docx

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学年高中生物第1部分微生物的利用第1课时大肠杆菌的培养和分离学案浙科版选修1

第1课时　大肠杆菌的培养和分离

[学习目标]　1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。

3.说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。

一、微生物培养的基本条件

1.微生物

（1）概念：

结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。

（2）用途：

许多种抗生素来源于放线菌和霉菌；酒由酵母发酵产生；腐乳由红曲霉和毛霉发酵制成；微生物能用于治理环境污染，在新能源领域也将发挥巨大作用。

2.培养基

（1）概念：

培养基是微生物生存的环境和营养物质。

（2）分类：

培养基按物理性质常可分为固体培养基和液体培养基，一般都含有水、碳源、氮源和无机盐四类营养物质，另外还需满足微生物生长对pH、特殊营养物质和氧气的要求。

通常细菌培养基要用蛋白胨和酵母提取物来配制，还要加入一定量的氯化钠以维持一定的渗透压；霉菌培养基一般用无机物配制或添加蔗糖的豆芽汁即可。

（3）酸碱性：

细菌通常要求在中性偏碱的环境中生长，霉菌要求在中性偏酸的环境中生长；因此，在制备培养基时需调节培养基的酸碱度。

特别提醒

　有关培养微生物所需营养的三点提醒

（1）不同微生物对营养的需求不同，所以培养不同的微生物所需要的营养可能不同。

（2）对异养微生物来说，含C、H、O、N的有机物既是碳源又是氮源、能源。

（3）培养微生物时营养物质要协调。

营养物质过少不能满足微生物的营养需要，过多对微生物的生长有抑制作用。

3.灭菌操作

（1）常见灭菌方法

①对于培养皿、试管、三角瓶、镊子等常采用高压蒸汽灭菌法灭菌。

②对于不能加热灭菌的化合物，如尿素等，只能用G6玻璃砂漏斗过滤，但玻璃砂漏斗使用前也要在121℃下用纸包好灭菌。

③实验操作过程中，一般采用灼烧的方法对接种环进行灭菌。

（2）高压蒸汽灭菌操作的要求

①灭菌前各种用品均需用牛皮纸或报纸包好，在121℃下灭菌15min，实验过程中所需的棉花不能用脱脂棉，因为其易吸水，吸水后容易引起污染。

②如培养基中有葡萄糖，为防止其分解碳化，要用500_g/cm2压力（90℃以上）灭菌30min。

归纳总结

1.培养基的类型

划分

标准

培养基种类

特点

用途

按物理状态

液体培养基

不加凝固剂

扩大培养或工业生产

半固体培养基

加少量凝固剂而呈半固体状态

观察微生物的运动、分类鉴定

固体培养基

加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等

微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

按功能

选择培养基

允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长

培养分离特定的微生物

鉴别培养基

根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

鉴别不同种类的微生物

按化学成分

天然培养基

含化学成分不明确的天然物质

工业生产

合成培养基

培养基的成分已明确

分类、鉴别

2.无菌操作，既包括各种器皿必须是无菌的，也包括各种培养基必须是无菌的，同时还要求在接种时，不能带有其他杂菌，所以在实验过程中，应时刻保持这种无菌意识。

例1

　（2018·浙江学军中学月考）下列关于培养基的说法，不正确的是（　　）

A.培养基配制的原则一是目的要明确，二是营养要协调、三是pH要适宜

B.配制培养基时还要考虑微生物对特殊营养物质的要求，否则微生物可能不能生长或生长极差

C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基

D.选择培养基是允许特定种类微生物生长，但抑制或阻止其他微生物生长的培养基

答案　C

解析　培养基配制的原则一是目的要明确，弄清培养基的所属类型，二是营养要协调，符合目的微生物的生长需求，三是pH要适宜，A正确；有的微生物对营养物质具有特殊的要求，配制培养基时还要考虑微生物对特殊营养物质的要求，否则微生物可能不能生长或生长极差，B正确；固体培养基中去除凝固剂（如琼脂、明胶等）即可制成液体培养基，C错误；选择培养基是指在微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，目的是从众多微生物中分离所需要的微生物，D正确。

例2

　（2019·温州高二检测）下列关于灭菌的叙述，正确的是（　　）

A.用于细菌等微生物培养的培养基都必须用高压蒸汽灭菌锅灭菌

B.锥形瓶、培养皿、移液管等器具的高压蒸汽灭菌时间一般为15min（121℃条件下）

C.超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌30min即可

D.灭菌后的培养基、器具就已经达到了完全无菌

答案　B

解析　培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌，若培养基中有碳酸氢钠、尿素等高温易分解的成分，就不能用此方法，A项错误；超净工作台或接种箱用紫外灯灭菌30min，同时还需打开过滤风，C项错误；灭菌后的培养基、器具不一定达到了完全无菌，而且要防止二次污染，D项错误。

方法技巧

　三种常用灭菌方法的比较

灭菌方法

适用材料或用具

灭菌条件

灭菌时间

灭菌后处理

高压蒸汽灭菌

培养基、玻璃器皿等

121℃，1kg/cm2压力（若培养基中含有葡萄糖，为防止其碳化，90℃以上，500g/cm2压力）

15min（若含有葡萄糖，灭菌时间30min）

实验用具在60～80℃烘箱中烘干；培养基冷却待用

灼烧灭菌

接种环、接种针或其他金属用具；玻璃刮刀

在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧

烧红（或玻璃刮刀上的酒精燃尽）

防止过热杀死目的菌种，冷却后使用

过滤灭菌

不能加热灭菌的化合物，如尿素培养基等

G6玻璃砂漏斗过滤

尿素滤液过滤完毕

玻璃砂漏斗用1mol/L的HCl浸泡，抽滤去酸后蒸馏水洗至中性，干燥后保存

二、细菌的培养与分离

1.细菌的分离方法

（1）划线分离法：

通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作。

由于划线过程中，接种环上的菌液逐渐减少，因此划线最后部分的细菌间距离加大，经过培养可获得单菌落。

（2）涂布分离方法：

用此法分离时，需要先将培养的菌液稀释，通常稀释10－5～10－7倍。

取0.1mL稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上，用玻璃刮刀涂布在培养基平面上，然后进行培养。

通常以每个培养皿中有20个以内的单菌落最为合适。

（3）两种分离法的比较：

划线分离法，方法简单；涂布分离法，单菌落更易分开，但操作复杂些。

2.大肠杆菌的培养和分离

（1）实验内容：

将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。

（2）实验步骤

培养基灭菌

↓

倒平板

↓

接种

↓

划线分离

↓

培养观察

↓

菌种保存

将50mLLB液体培养基和50mLLB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌

将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面

在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12h

用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿

将培养皿倒置（盖在下面），放在37℃恒温培养箱中培养12～24h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落

在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在斜面上，37℃培养24h后，置于4℃冰箱中保存

归纳总结

1.划线分离法的操作步骤

2.涂布分离法的操作步骤

（1）操作图示

（2）相关说明

①将分别盛有9mL水的6支试管灭菌，并按101～106的顺序编号。

②用移液管吸取1mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。

用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。

③从101倍稀释的试管中吸取1mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复②步的混匀操作。

依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。

例3

　（2018·浙江效实中学期中）如图表示利用划线分离法分离和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是（　　）

A.步骤①倒平板操作时，只需要在超净台中不需要在酒精灯火焰旁进行

B.步骤②③使用的工具是接种环，接种前需在明火上烧红后冷却

C.步骤④恒温培养箱培养后的结果说明整个过程中蘸取菌液4次

D.该方法使单菌落更容易分开，但操作复杂些

答案　B

解析　即使在超净台中，步骤①倒平板操作时，也需要在酒精灯火焰旁进行，A错误；步骤②③中接种环都需要进行灼烧灭菌，即在火焰上灼烧，待冷却后才可以蘸取菌液进行平板划线，B正确；划线分离法中只蘸取菌液1次，C错误；平板划线法操作简单方便，但是单菌落不易分离，D错误。

例4

　（2018·嘉兴高二检测）图甲、图乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：

（1）图甲是利用__________法进行微生物接种，图乙是利用______________法进行微生物接种。

（2）这两种方法所用的接种工具分别是______________和__________；在接种过程中对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是______________和酒精消毒。

（3）下图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________（填“图甲”或“图乙”）。

（4）下列关于微生物培养和分离的叙述不正确的是________。

A.利用图乙所示接种法可以分离微生物但不能对微生物进行计数

B.接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落

C.利用图甲所示接种法接种过程中，每次划线前后都要对接种环进行灭菌

D.图乙所示接种法中使用的接种工具须保存在70%的酒精中

答案　

（1）划线分离　涂布分离　

（2）接种环　玻璃刮刀　灼烧灭菌　（3）图乙　（4）A

解析　

（1）分析图示可知，图甲为用划线分离法进行微生物接种，图乙是利用涂布分离法进行微生物接种。

（2）前者利用的工具是接种环，后者利用的工具是玻璃刮刀。

对于接种环而言，灭菌的操作方法是灼烧，玻璃刮刀通常浸泡在70%酒精中消毒。

（3）题图中，菌落均匀分布，分离效果较好，是涂布分离法操作的结果。

（4）采用涂布分离法，可以通过培养基表面的菌落数，对微生物进行计数，但采用该方法计数通常比实际菌落数偏低，A项错误。

方法技巧

　划线分离法与涂布分离法的比较

项目

划线分离法

涂布分离法

原理

连续划线。

由于划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次划线从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落

将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养皿表面形成单个菌落

操作工具

接种环

玻璃刮刀

使用要求

用时需灼烧

放置在70%酒精中，用时需灼烧

特点

操作简单，但是单菌落不易分离

操作复杂，单菌落易分离

相同点

使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种

1.判断正误：

（1）纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有划线分离法和涂布分离法（　　）

（2）在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌（　　）

（3）单菌落的分离是消除杂菌污染的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株最简便的方法之一（　　）

（4）接种环在每次转移菌种之前都需要进行高压蒸汽灭菌，以杀灭接种环上的杂菌（　　）

（5）根据微生物对营养物质的需求，配制相应的培养基，如“细菌喜荤，霉菌喜素”，经高压蒸汽灭菌之后还要调节pH（　　）

（6）有些化合物不能加热，如尿素等需采用玻璃砂漏斗进行过滤灭菌，常用的有G5或G6玻璃砂漏斗（　　）

（7）培养微生物的培养基分装到培养皿后进行灭菌（　　）

答案　

（1）√　

（2）×　（3）√　（4）×　（5）×　（6）×　（7）×

2.（2019·西湖区高二检测）金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒。

下列有关接种金黄色葡萄球菌的实验叙述错误的是（　　）

A.将灼烧的接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位

B.取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌

C.对接种环进行灼烧处理

D.接种后还要将试管口灭菌加塞

答案　A

解析　接种环伸入试管后应先接触未长菌的部位，待接种环冷却后再接触长菌多的部位。

3.（2018·浙江效实中学检测）在分离、纯化大肠杆菌实验中，划线接种（甲）、培养结果（乙）如图所示。

有关叙述错误的是（　　）

A.接种前应对培养基进行高压蒸汽灭菌

B.连续划线的目的是获得单个细菌形成的菌落

C.接种过程中至少需要对接种环灼烧5次

D.甲中a区域为划线的起始位置

答案　D

解析　培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌，A项正确；菌液经过连续划线，菌液中的菌体越来越少，最后容易形成单菌落，B项正确；在每次划线前后都要对接种环进行灭菌，因此按照图中划线顺序（d→c→b→a），整个划线过程中至少需要对接种环灼烧5次，C项正确；每次划线的菌种来自上一区域的末端，因此划线的起始区域菌落多，由图乙可知，甲中d区域菌落多，为划线的起始位置，D项错误。

4.下列关于微生物的培养和分离的叙述中，不正确的是（　　）

A.细菌能在液体培养基中以二分裂方式迅速扩增

B.噬菌体或大肠杆菌可在蛋白胨培养基中增殖

C.灭菌的目的是消灭与培养菌竞争的杂菌

D.涂布分离法分散细菌得到单菌落的效果更好

答案　B

解析　噬菌体属于病毒，营寄生生活，不能在蛋白胨培养基中增殖。

5.大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中大约含有109个，且能够与致病菌混杂生长。

如果食品和饮用水中出现大肠杆菌，就意味着食物可能被粪便污染而带上致病菌，因而常将大肠杆菌的数量作为食品卫生的检测指标之一。

请据此回答下列问题：

（1）测定街边出售的奶茶中大肠杆菌的数目，常用涂布分离法。

该方法首先配制LB________培养基，进行高压蒸汽灭菌后冷却至60℃，在____________旁倒在培养皿中形成平板；对奶茶样品进行一定倍数的稀释，取0.1mL奶茶稀释液，加在培养皿的固体培养基上，用__________涂布在培养基平面上，然后进行培养；观察统计培养皿中________数目；该数据比实际数值要________（填“高”或“低”），原因是_______________________________

________________________________________________________________________。

实验完成后需要对培养基进行________处理，然后才能倒掉。

（2）若要对上述培养基中的菌种进行扩大培养，则需配制LB________培养基，灭菌后，将__________在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取单菌落中的菌体接种到新的培养基中，在适宜环境中培养________h即可。

答案　

（1）固体　酒精灯火焰　玻璃刮刀　菌落　低　培养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起，共同形成一个菌落　灭菌　

（2）液体　接种环　12

解析　

（1）微生物的分离通常用固体培养基。

为防止杂菌污染，要在酒精灯火焰旁倒平板。

在用涂布分离法分离细菌时，为了使细菌均匀涂布在固体培养基上，常用玻璃刮刀把菌液涂布在培养基上，通过观察菌落数推算细菌数目。

培养基中可能有两个或多个细菌紧挨在一起，共同形成一个菌落，因此观察到的菌落数可能比实际菌落数低。

为了防止实验菌污染环境，实验完成后需要对培养基进行灭菌处理，然后才能倒掉。

（2）对微生物进行扩大培养，通常使用LB液体培养基。

一般用接种环转移带菌的培养物。

接种时，先将接种环在酒精灯火焰上烧红后冷却，然后蘸取带菌的培养物，接种到新的培养基中，在液体培养基中，适宜条件下培养12h。

题组一　微生物的营养与培养基

1.要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用（　　）

A.固体培养基

B.液体培养基

C.加青霉素的培养基

D.加入高浓度食盐的培养基

答案　A

解析　分离微生物应使用固体培养基。

2.牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，下列关于琼脂的说法不正确的是（　　）

A.不会被所培养的微生物分解利用，对所培养的微生物无毒害作用

B.在微生物生长温度范围内保持固体状态

C.琼脂凝固点低，利于微生物的生长

D.琼脂在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强

答案　C

解析　在液体培养基中加入凝固剂如琼脂后，制成琼脂固体培养基，它是实验室中最常用的培养基之一，固体培养基中可形成肉眼可见的单个细胞繁殖而来的子细胞群体，即菌落，用于微生物的分离、计数和菌种鉴定等。

琼脂作为一种理想的凝固剂，是由其性质决定的，琼脂不会被微生物利用且对微生物无毒害作用，在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强。

琼脂在98℃以上可溶解于水，在45℃以下凝固，所以在微生物生长温度范围内保持固体状态。

题组二　无菌操作

3.下列操作与消毒灭菌无关的是（　　）

A.接种前用肥皂清洗双手，再用酒精擦拭双手

B.接种前用火焰灼烧接种环

C.培养基在60℃左右时搁置斜面

D.在酒精灯的火焰旁完成倒平板的操作

答案　C

4.培养微生物时必须进行无菌操作，下列消毒灭菌方法中，常用于各种器皿灭菌的是（　　）

A.70%酒精浸泡B.紫外线照射

C.高压蒸汽法D.5%次氯酸钠溶液浸泡

答案　C

解析　玻璃刮刀采用70%酒精浸泡消毒；杀灭空气中的微生物常采用紫外线照射；各种器皿通常采用高压蒸汽灭菌法灭菌；5%次氯酸钠溶液浸泡常用于植物切段消毒。

5.防止杂菌入侵，获得纯净的培养物，是研究和应用微生物的前提。

下列叙述错误的是（　　）

A.实验室里可以用紫外线或化学药物进行消毒

B.接种环、接种针等金属用具，直接在酒精灯火焰的内焰部位灼烧灭菌

C.在实验室中，切不可吃东西、喝水，离开实验室时一定要洗手，以防止被微生物感染

D.使用后的培养基丢弃前一定要进行灭菌处理，以免污染环境

答案　B

解析　对接种环等金属用具进行灼烧灭菌，应放在酒精灯火焰的充分燃烧层即外焰处。

题组三　大肠杆菌的培养与划线分离

6.（2018·湖州一中期末）下列有关划线分离操作的叙述，错误的是（　　）

A.必须使用固体培养基

B.必须在酒精灯火焰旁接种

C.必须将接种后的培养皿倒置培养

D.必须将接种前的培养皿、培养基、待分离微生物等进行灭菌处理

答案　D

解析　用划线分离法分离微生物，必须采用固体培养基，A项正确；划线分离和涂布分离操作都需要在酒精灯火焰旁进行，以防止杂菌污染，B项正确；划线分离和涂布分离接种操作后，需要将培养皿倒置，以防止皿盖上的水滴滴入培养基造成污染，C项正确；分离操作前需对培养基和培养皿等灭菌，但是待分离微生物不能进行灭菌处理，D项错误。

7.（2019·金华模拟）要筛选得到纯净的菌种，通常在固体培养基上划线分离，下列操作正确的是（　　）

A.每次划线时，接种环都需蘸菌液一次

B.划线分离时，需要把接种环深入到培养基中进行接种

C.在超净台中接种时要在酒精灯火焰旁进行

D.划线分离后将培养皿正放在恒温培养箱中培养

答案　C

解析　采用划线分离时，菌种只蘸取一次，A项错误；划线分离时，接种环在培养基表面进行划线操作，B项错误；微生物培养的关键是无菌操作，因此，在超净台上接种时，需要在酒精灯火焰旁进行，以防止空气中微生物的污染，C项正确；划线分离结束后，应将培养皿倒置于恒温培养箱中培养，D项错误。

8.下列划线分离的图解中，正确的是（　　）

答案　C

解析　划线分离的划线有许多要求。

A的划线方法不对，而B错在划线2的起点，D项错在4与1交叉了。

题组四　涂布分离法

9.漆酶属于木质素降解酶类，在环境修复、农业生产等领域有着广泛用途。

下图是分离、纯化和保存漆酶菌株的过程，相关叙述正确的是（　　）

A.生活污水中含有大量微生物，是分离产漆酶菌株的首选样品

B.筛选培养基中需要加入漆酶，通过菌落特征挑出产漆酶的菌落

C.在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化

D.斜面培养基中含有大量营养物，可在常温下长期保存菌株

答案　C

解析　漆酶降解木质素，则漆酶菌株多存在于木质素含量丰富的场所，生活污水中含有大量微生物，但不一定含有产漆酶的菌株，A项错误；产漆酶菌株可降解木质素，可在筛选培养基中加入木质素来筛选产漆酶的菌株，筛选时可通过菌落特征挑出产漆酶的菌落，B项错误；在涂布平板上长出的菌落，再通过划线进一步纯化，C项正确；斜面培养基应在4℃环境下保存，D项错误。

10.涂布分离法是微生物培养中的一种常用的接种方法。

下列相关叙述错误的是（　　）

A.操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释

B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面

C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落

D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理

答案　C

解析　涂布分离法包括系列稀释和涂布平板两个过程，涂布平板之前需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，A项正确；涂布平板时，需要将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面，B项正确；只有稀释度足够大的菌液才能在培养基表面形成单个的菌落，C项错误；操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理，以防止杂菌污染，D项正确。

11.（2018·江苏，31节选）酵母的蛋白质含量可达自身干重的一半，可作为饲料蛋白的来源。

有些酵母可以利用工业废甲醇作为碳源进行培养，这样既可减少污染又可降低生产成本。

研究人员拟从土壤样品中分离该类酵母，并进行大量培养。

下图所示为操作流程，请回答下列问题：

（1）配制培养基时，按照培养基配方准确称量各组分，将其溶解、定容后，调节培养基的________，及时对培养基进行分装，并进行____________灭菌。

（2）取步骤②中不同梯度的稀释液加入标记好的无菌培养皿中，在步骤③中将温度约______（在“25℃”“50℃”或“80℃”中选择）的培养基倒入培养皿混匀，冷凝后倒置培养。

（3）挑取分离平板中长出的单菌落，按步骤④所示进行划线。

下列叙述合理的有____________（多选）。

a.为保证无菌操作，接种针、接种环使用前都必须灭菌

b.划线时应避免划破培养基表面，以免不能形成正常菌落

c.挑取菌落时，应挑取多个菌落，分别测定酵母细胞中甲醇的含量

d.可以通过逐步提高培养基中的甲醇的浓度，获得甲醇高耐受株

答案　

（1）pH　高压蒸汽（湿热）　

（2）50℃　（3）a、b、d

解析　

（1）配制培养基时，进行计算、称量、溶解、定容后，需先调pH再分装到锥形瓶中进行高压蒸汽灭菌。

（2）倒平板时的培养基温度约为50℃，冷凝后倒置培养。

（3）平板划线时，接种针、接种环使用前和每次划线后都需要进行灼烧灭菌，以免造成杂菌污染，a正确；划线时不能划破培养基表面，否则不能形成正常菌落，b正确；挑取菌落时，应挑取多个不同的菌落，分别测定酵母细胞中蛋白质含量，c错误；逐步提高培养基中甲醇的浓度，能筛选出其中的耐受菌，获得甲醇高耐受菌株，d正确。

12.下列是有关大肠杆菌的培养实验，请回答问题：

（1）配制培养大肠杆菌的培养基时，根据“细菌喜荤，霉菌喜素”的规律，通常在培养基中加入蛋白胨和__________作为营养物质，为维持一定的渗透压，常需加入一定量的__________________。

（2）大肠杆菌培养和分离的实验中，在________________中进行扩大培养，培养液经________后，在LB固体培养基上进行__________，并将培养皿____________放在恒温培养箱