食品生物技术实验指导书.docx

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食品生物技术实验指导书

食品生物技术实验指导

何志平等编

农业与食品科学学院

20012.10

实验一质粒DNA的提取及电泳检测

一实验目的

通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。

二实验原理

1.细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。

2.质粒DNA的提取方法有三种：

碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。

3.碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。

当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。

三实验材料：

转化后的细菌（含有质粒的大肠杆菌）

四、实验用具和药品

1.实验用具:

摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（1.5mL）

2.实验试剂：

1溶液I

50mmol/L葡萄糖

25mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（pH8.0）

10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

2溶液II

0.4mol/LNaOH，2%SDS，用前等体积混合

3溶液III5mol/L乙酸钾60ml

冰乙酸11.5ml

水28.5ml

4TE缓冲液

10mmol/LTris·HCl（pH8.0）

1mmol/LEDTA（pH8.0）

570%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6RNA酶

将RNA酶溶于10mmol/LTris·HCl（pH7.5）、15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

7加样缓冲液（6X）：

40%蔗糖、0.25%溴酚兰

电泳缓冲液：

0.045mol/LTris-硼酸  0.001mol/LEDTA（0.5XTBEbuffer）

贮存液：

5X：

54gTris碱

  27.5g硼酸

  20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）

五实验步骤

（一）细菌繁殖

挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基（附加100mg/mlAmp）,37℃过夜振荡（200r/min）培养。

（二）菌体收集

将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，离心30sec5000r/min；弃上清提取质粒

（三）质粒提取

方法一：

碱裂解法提取质粒DNA

1．.将上述沉淀重悬于250μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡；

2．加入250μL溶液Ⅱ，盖紧管口，快速颠倒离心管5~10次；

3．加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5~10次；9000r/min离心5min上清转移到另一新1.5mL离心管中；

4．加等体积氯仿，振荡混合，静置，9000r/min离心5min，上清转移到另一新1.5mL离心管中；

5．加入1/10体积3mol/L的醋酸钠和2倍体积的乙醇，充分混匀，静置5min；9000r/min离心5min；

6．弃上清，用70％ethanol洗涤；

7．加30μLTE溶解，-20℃保存。

方法二：

试剂盒提取方法

1.离心收集的菌体中加入含RNAase的溶液Ⅰ250μL，重悬菌体；

2.加溶液Ⅱ250μL，轻轻颠倒离心管~10次，静止（1-2分钟），至溶液澄清；

3.加入350μL冰预冷的溶液Ⅲ，快速颠,20-30次；

4.12000r/min离心10min；

5.将上清转移到DNA结合离心管中，12000r/min离心1min；

6.加入去蛋白试剂500μL，12000r/min离心1min；

7.加洗涤液750μL，12000r/min离心1min；

8.加洗涤液700μL，12000r/min离心1min；

9.DNA结合柱12000r/min离心2min，去除残余的洗涤液；

10DNA结合柱放入另一个新的1.5mL离心管中，室温1-2min，加入洗脱缓冲液50-100μL；

1112000r/min离心1min；

（四）检测提取DNA质量的电泳检测。

●取2ul质粒DNA+2ul加样缓冲液+6ulddH2O；

●配制1%的琼脂糖凝胶

●电泳30min，EB染色，拍照。

注意事项：

氯仿对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。

六实验作业

1.思考本实验的关键步骤是什么？

2.琼脂糖电泳鉴定质粒DNA时，能看到几条带，快慢顺序是什么？

3.附上电泳图片。

实验二、固定化α-淀粉酶及活性测定

一、实验目的和原理

目的：

学会包埋法制备固定化酶的操作技术

内容：

制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固定化酶的方法称为交联法，本实验即采用包埋法。

二、实验器材

1．恒温水浴锅

2．恒温振摇仪

三、实验试剂

1.海藻酸钠

2.CaCl2

3.碘原液：

称取碘1.1g。

碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶解，然后转入容量瓶中。

再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶中，最后定容至50ml。

摇均后放于棕色试管中备用。

4.比色稀碘液：

取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。

5.2%淀粉溶液：

称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。

然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至100ml。

6.pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：

称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）45.23g,柠檬酸（C6H8O7.H2O）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中定容至1000ml。

四、实验操作

（1）酶液的制备

精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。

将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。

最后，将溶液与残渣全部移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。

（2）配制CaCl2溶液：

0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。

（3）配制海藻酸钠溶液：

0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。

（4）海藻酸钠溶液与酶液的混合：

将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入酶液，搅拌后吸入到注射器中。

（5）固定化酶制备：

以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。

（6）固定化α-淀粉酶活力测定及活力回收率的计算

a.首先用吸管取1ml的标准终点色溶液，加至白瓷板的空穴内，作为终点参照的标准。

b.固定前总酶活力测定：

取20ml2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。

将试管置于60℃水浴5分钟。

然后加入前面制备的酶液0.5ml。

摇匀后，立即用秒表记录时间。

此后，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。

当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。

c.固定化酶活力测定：

取20ml2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。

将试管置于60℃水浴5分钟。

然后加入前面制备的固定化酶。

摇匀后，立即用秒表记录时间。

此后，不断振摇，每经一段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。

当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的时间。

d.酶活力计算：

以60℃、pH6的条件下，每小时水解1g淀粉的酶量为一个活力单位。

固定前原酶活力单位=60/T×20×2%×n/0.5

固定后的酶活力单位=60/T×20×2%×n/10

T：

反应到终点时的时间（分）

n：

酶粉稀释的倍数

5.固定化后酶活力回收率计算：

酶活力回收率=（固定后的酶活力单位/固定前原酶活力单位）×100%

五、思考题

1、固定化酶有哪些优点？

实验三、固定化酵母细胞发酵

一、实验目的和原理

目的：

学会包埋法制备固定化酵母的操作技术

内容：

采用包埋法制备固定化酵母，应用固定化酵母进行发酵。

二、实验器材

1、恒温水浴锅

2、恒温振摇仪

三、实验试剂

1.海藻酸钠

2.CaCl2

3.葡萄糖

四、实验操作

1．制备固定化酵母细胞

（1）酵母细胞的活化：

1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。

（2）配制CaCl2溶液：

0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。

（3）配制海藻酸钠溶液：

0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。

（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：

将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。

防止高温杀死酵母细胞。

（5）固定化酵母细胞：

以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。

2．固定化酵母细胞的发酵

（6）冲洗：

将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。

（7）发酵：

150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锤形瓶→密封→25℃发酵24h。

五、思考题

1、微火加热并不断搅拌的目的是什么？

2、为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？

3、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？

实验四溶菌酶的制备

一、实验目的与内容

目的：

1.掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；

2.掌握测定蛋白质标准曲线的制作方法；

3.能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。

内容：

1.从鸡蛋清中粗提取出溶菌酶；

　　　2.制作测定蛋白质的标准曲线。

二、溶菌酶的粗提取

（一）实验仪器和试剂

1.实验仪器

721型分光光度计、摇床、高速离心机

2.实验材料和试剂：

200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管

鸡蛋1只、0.02mol/LPBS（pH8.0）,

（二）实验步骤

1.取鸡蛋一个，破壳去蛋清置于250ML烧杯中，并记录器体积；

2.加入1.5倍体积的pH7.0的PBS缓冲液，搅拌均匀，取0.5ML蛋清至1.5ML离心管中备用（样品1）；

3.用醋酸将蛋清也的pH调至4.7，充分搅拌；

4.3500rpm/min,离心20min,去上清;

5.取0.5ML蛋清至1.5ML离心管中备用（样品2）

二、SDS-PAGE蛋白电泳

（一）原理:

聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 （简称Acr）和交联剂N,N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下,聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶,并以此为支持物进行电泳.聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带,如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质,蛋白质样品电泳后,就应只分离出一条区带.

   SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键,并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物,使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷,掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异.因此,各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移率,不再受原有电荷和分子形状的影响,而只是棒长的函数.这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）.由于SDS-PAGE可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度,因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度,如果被鉴定的蛋白质样品很纯,只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质,那么SDS—PAGE后,就只出现一条蛋白质区带.

   SDS—PAGE可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统.本实验采用垂直板状不连续系统.所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径等所组成.

1.蛋白样品浓缩效应

   在不连续电泳系统中,含有上、下槽缓冲液（Tris—Gly,pH8.3）、浓缩胶缓冲液（Tris—HCl,pH6.8）、分离胶缓冲液（Tris—HCl,pH8.8）,两种凝胶的浓度（即孔径）也不相同.在这种条件下,缓冲系统中的HCl几乎全部解离成Cl－,两槽中的Gly（pI＝6.0,pKa=9.7）只有很少部分解离成Gly的负离子,而酸性蛋白质也可解离出负离子.这些离子在电泳时都向正极移动.C1—速度最快（先导离子）,其次为蛋白质,Gly负离子最慢（尾随离子）.由于C1—很快超过蛋白离子,因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域,该区电位梯度最高,这是在电泳过程中形成的电位梯度的不连续性,导致蛋白质和Gly离子加快移动,结果使蛋白质在进入分离胶之前,快、慢离子之间浓缩成一薄层,有利于提高电泳的分辨率.

2.分子筛效应

   蛋白质离子进入分离胶后,条件有很大变化.由于其pH升高（电泳进行时常超过9.0）,使Gly解离成负离子的效应增加;同时因凝胶的浓度升高,蛋白质的泳动受到影响,迁移率急剧下降.此两项变化,使Gly的移动超过蛋白质,上述的高电压梯度不复存在,蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中,按其分子的大小移动.分离胶的孔径有一定的大小,对不同相对分子质量的蛋白质来说,通过时受到的阻滞程度不同,即使净电荷相等的颗粒,也会由于这种分子筛的效应,把不同大小的蛋白质相互分开.

（二）实验仪器和试剂

1.电泳仪，水平摇床

2.试剂:

丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris-base，TEMED，SDS，过硫酸铵，甘油，溴酚兰，甘氨酸，DTT，考马斯亮蓝R-250，甲醇，冰醋酸，蛋白Marker（50ul装），溶菌酶10mg。

3.缓冲液

（1）2MTris-HCL（pH8.8）100ml：

24.2gTris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH8.8，最后定容至100ml。

（2）1MTris-HCL（pH6.8）100ml：

12.1gTris-base，50ml蒸馏水，加入浓盐酸调pH6.8，最后定容至100ml。

（3）10%SDS100ml：

10gSDS，加入70ml蒸馏水在60℃搅拌溶解，待泡沫消失后，定容至100ml。

（4）50%（w/v）甘油 100ml：

50ml甘油，50ml蒸馏水，混匀即可。

（1）1%（w/v）溴酚兰10ml：

100mg溴酚兰，蒸馏水定容至10ml。

0.139g乙酸钠溶于100ml蒸馏水中，调pH至5.2。

4.工作液：

（1）30%聚丙酰胺母液（A液）实际需要250ml

100ml：

                   丙烯酰胺29g，

双丙烯酰胺1g，

去离子水在37℃溶解，

定容到100ml。

0.45μm滤器过滤除菌，棕色瓶保存。

pH≤7.0。

（2）4×分离胶缓冲液（B液）100ml：

            75ml2MTris-HCL（pH8.8）

                          4ml10%SDS

                          21ml蒸馏水

                          4℃存放。

（3）4×浓缩胶缓冲液（C液）100ml：

50ml1MTris-HCL（pH6.8）

                          4ml10%SDS

                          46ml蒸馏水

                          4℃存放。

（4）10%过硫酸铵（D液）5ml：

          0.5g过硫酸铵，5ml蒸馏水，0.1ml分装。

（5）TEMED（E液）

（6）1×Tris-甘氨酸缓冲液1L：

Tris-base3g    

  甘氨酸14.4g

SDS1g

蒸馏水定容到1L，pH8.3左右。

（7）5×上样缓冲液 10ml：

                0.5ml1MTris-HCL（pH6.8）

                       1ml1MDTT

                       2ml10%SDS

                       1ml1%溴酚兰

                       5ml50%甘油

                       0.5ml蒸馏水

（8）考马斯亮蓝染色液 1L：

                  考马斯亮蓝R-2501.0g

                       甲醇450ml

                       冰醋酸100ml

                       蒸馏水450ml

（9）考马斯亮蓝脱色液 1L：

     甲醇100ml

                       冰醋酸100ml

                       蒸馏水800ml

（二）制胶：

1、  配10%分离胶10ml：

吸取A液3.3ml，B液2.5ml，蒸馏水4.2ml，D液100μl，在小烧杯中摇匀，再加入E液10μl，立即混匀并用10ml注射器吸取大约8ml混合溶液，沿着玻璃板之间缝隙左上处，缓慢灌胶，一直到距前玻璃板上沿1.5cm处为止。

（注意：

A当凝胶完全浸没玻璃板底的时候，留意观察是否漏胶。

若漏胶，则立即停止灌胶，重新固定模具之后再继续。

B灌胶应缓慢进行，避免有气泡产生）

2、  水膜封闭空气：

在分离胶上面小心加入一层蒸馏水，以隔绝空气，促进凝胶聚合。

等待约20—30min，交界面有明显的折光线，且倾斜模具，交界面不随之改变，为凝胶凝固良好。

用滤纸小心洗干水分。

3、  配5%浓缩胶5ml：

吸取A液0.67ml，C液1.0ml，蒸馏水2.3ml，D液50μl，在小烧杯中摇匀，再加入E液5μl，立即混匀，灌胶，到到前玻璃板上沿即可。

4、  插上齿梳，确保无气泡。

等待凝胶完全聚合，约需30分钟。

5、  小心拔出梳子，卸下封条，将玻璃板颠倒放置，使浅玻璃板朝内，固定在电泳架上。

将整个电泳架放入电泳槽，在内外槽中倒入电泳缓冲液，内槽液面应在前后玻璃板之间。

（三）点样：

1、  吸取20μl蛋白样品到EP管中，加入4μl上样缓冲液，混匀，沸水中加热5min

2、  全部样品上样，小心不要使样品漂散。

3、  同时吸取蛋白Marker10—20μl点样。

（四）电泳：

连接好正负极导线，稳压120V，至溴酚兰到达分离胶底部。

（五）染色：

1、  剥胶

2、  将凝胶小心放入考马斯亮蓝染液浸泡，45℃摇床摇30min。

3、  脱色：

将凝胶浸泡入考马斯亮蓝脱色液中，放入一小块海绵，45℃摇床摇4—8h，其间更换脱色液3—4次，观察蛋白电泳情况.

（六）标准曲线绘制

以标准蛋白分子量的对数（logMr）为纵坐标,相对迁移率为横坐标作图.

电泳迁移率=样品迁移距离/溴酚篮迁移距离.

根据待测样品的相对迁移率,可以根据标准曲线计算出分子量.

注意事项：

甲醇、乙酸、过硫酸铵、TEMED等对眼睛、皮肤、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌剂并可损伤肝脏和肾脏，操作时需戴手套、口罩。

 四实验作业

1.利用等电点沉淀法粗步提纯蛋白需要注意哪些方面?

2.SDS-PAGE分离蛋白的原理？

3.附上电泳图片。