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尿中修饰核苷检测在肝细胞性肝癌诊断中的意义
尿中修饰核苷检测在肝细胞性肝癌诊断中的意义
【关键词】核苷类,尿;癌,肝细胞;电泳,毛细管
Abstract:
Objective:
Toinvestigatethevaluefordetectingthemodifiednucleosidesinurinefordiagnosingtheheaptocellularcarcinoma.Methods:
Fourkindsofurinarynucleosides(M5U,I,Ac4c,X)from21preoperativeandpostoperativepatientswithprimaryheaptocellularcarcinomaweredetected.Tencaseswithbenigntumorofliver,21caseswithcirrhosisofliverand30healthypersonswereexaminedwithhighperformancecapillaryelectrophoresis(HPCE).Results:
Theaveragelevelof4kindsofnucleosidesfrompreoperativepatientswithheaptocellularcarcinomawashigherthanthatfrompostoperativepatientswithheaptocellularcarcinoma(P).Theaveragelevelof4kindsofnucleosidesfrompatientswithheaptocellularcarcinomawashigherthanthatfrompatientswithbenigntumorofliver,patientswithcirrhosisofliverand30healthypersons(P or).Theaveragelevelfrompatientswithbenigntumorofliver,patientswithcirrhosisofliverand30healthypersonshadnosignificantdifference.Therewasnosignificantcorrelationbetweentheaveragelevelof4kindsofnucleosidesandAFPorthetumorsize.Conclusion:
Urinarymodifiednucleosidesmaybehelpfulindiagnosingtheheaptocellularcarcinoma.Theaveragelevelof4kindsofnucleosideshasclinicalsignificanceindifferentiatingbenignandmalignanthepatictumors.
Keywords:
nucleosides,urine;carcinoma,hepatocellular;electrophoresis,capillary
修饰核苷是机体RNA代谢产物,RNA代谢产生正常核苷与修饰核苷,尿中修饰核苷的排量可以反映机体细胞的代谢速度。
肿瘤细胞的增殖较正常细胞加快,导致修饰核苷的产生和排出增多。
早期研究尿中修饰核苷需要收集24h尿。
Gehrke等[1]研究表明用“随机尿样”检测,以核苷含量(nmol)/肌酐(μmol)作为标准可取得与24h尿样一样的结果,这大大方便了尿核苷的临床检测。
近年来利用尿中修饰核苷作为恶性肿瘤的潜在诊断标记物已有报道[2-4]。
本研究旨在探讨国人肝细胞性肝癌患者与非HCC患者尿中修饰核苷的不同水平,了解其诊断HCC的灵敏度及特异度。
探讨尿中修饰核苷与HCC肿瘤大小、AFP等的关系,并探讨HCC患者治疗前后尿中修饰核苷水平变化。
1材料和方法
研究对象HCC组:
共21例,男19例,女2例,年龄34~76岁,平均岁,均临床确诊并经手术后病理检查证实为HCC,均无远处转移。
肝良性占位组:
共10例,男4例,女6例,年龄33~74岁,平均岁。
其中血管瘤5例,单纯性囊肿3例,囊腺瘤1例,血管平滑肌脂肪瘤1例,均经病理确诊。
肝硬化组(LC):
共21例,所有患者均根据病史、临床表现、B超或CT以及肝功能等实验室检查明确诊断。
其中男17例,女4例,年龄37~73岁,平均岁。
ChildA级患者3例,ChildB级患者13例,ChildC级患者5例;均为失代偿期肝硬化患者。
所有患者均符合下述排除标准:
①除外内分泌、循环、神经及泌尿系统的原发性疾病。
②除外其他部位的恶性肿瘤。
③除外消化性溃疡、胰腺疾病、结肠疾病及肾功能衰竭等。
④所有受试者在采标本前2周内未使用白蛋白、干扰素、生长抑素类药、胰岛素、激素类药物及对肝脏有损害的药物。
正常对照组:
共30例,为我院门诊查体的健康体检者,男24例,女6例,平均岁,全部排除心、肝、脑、肾、胃肠道、胰腺及内分泌系统的疾病,无用药史。
4组间性别、年龄差异无显着性,具有可比性。
尿液标本均于治疗前随机收集,并收集21例HCC组手术后3d内尿液标本。
实验部分
仪器和试剂:
BeckmanMDQ毛细管电泳系统。
RE5000型旋转蒸发器(北京成萌伟业科技有限公司产品)。
直径25mm,μm微滤膜。
4种核苷标准品(M5U、I、AC4C、X)、内标3-脱吖尿苷(3-Dzu)、十二烷基磺酸钠(SDS)、二水合磷酸二氢钠(NaH2OP4·2H2O)和十水合四硼酸钠(Na2B4O7·10H2O)均购自Sigma公司;苯基硼酸亲和凝胶(Affi-Gel601)购自Bio-Rad;未涂层石英毛细管柱购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。
4种核苷标样均溶于水,分别配制mmo1/LM5U,8mmol/LI,mmo1/LAc4c,mmo1/LX,为贮备液。
根据实验需要将其稀释至所需的浓度。
尿中核苷的提取:
收集到样品之后立刻放入-20℃的冰箱中冷冻。
测定核苷之前,将尿样置于室温下解冻。
用苯基硼酸亲和凝胶色谱法来提取尿中核苷。
将混有内标3-Dzu的尿样10ml经苯基硼酸柱分离富集核苷。
经苯基硼酸柱洗脱的溶液,在真空旋转蒸发器中蒸发至干,再用300mmol/LSDS、25mmol/LNa2B4O7·10H2O、50mmol/LNaH2PO4·2H2O为缓冲液加至1ml。
与原尿样相比,尿中核苷浓度浓缩了10倍。
毛细管电泳分析:
以300mmol/LSDS、25mmol/LNa2B4O7·10H2O、50mmol/LNaH2PO4·2H2O为缓冲液(pH=),未涂层石英毛细管(50μ,总长52cm,有效长度42cm)为分离通道,在7kV恒压、29℃下电泳,检测波长为254nm,毛细管柱使用前用mol/LNaOH、Milli-Q超纯水分别冲30min和20min。
每次电泳后,毛细管分别用mol/LNaOH、Milli-Q超纯水、缓冲液冲洗120s、120s、180s。
尿中核苷浓度用内标法定量,所得结果转化为核苷含量(nmol)/肌酐(μmol)。
肌酐值的测定:
肌酐浓度用毛细管区带法测定。
具体方法为:
将尿离心后,取10μl用Milli-Q超纯水稀释10倍,在Beckman的MDQ毛细管电泳仪上,以mol/LpH为的磷酸盐为缓冲液,在52cm×50μ的未涂层石英毛细管上,于20kV恒压,25℃下进行电泳分离,检测波长为214nm,外标法定量。
核苷的定性与定量的识别方法为:
①将未知峰的迁移时间与核苷组分的迁移时间相对照。
②在尿样中加入标样。
当标样核苷与尿样的预处理方式相同时,尿中核苷的浓度可以通过建立核苷标样的工作曲线推算而得。
统计学处理方法所有数据进行正态性检验,多组样本均数比较进行方差齐性检验,组间比较采用单因素方差分析,方差齐性者用LSD-t法,方差不齐者用Dunnet-t3法。
肝癌手术前后四种核苷均数比较用配对t检验方法。
双变量相关分析采用Sperman等级相关法。
2结果
五组样品测定的结果见表1。
肝癌组四种尿中修饰核苷与肿瘤体积均无相关性r分别为-、、-、-,均P。
肝癌组四种尿中修饰核苷与血清AFP均无相关性r分别为、-、-、-,均P。
联合检测尿中M5U、I、AC4C、X四种核苷以对照组Mean+2SD为阳性判定值,其诊断HCC的灵敏度为%,特异度为%。
而以AFP20μg/L为阳性判定值,其诊断HCC的灵敏度为%,特异度为%。
联合检测尿中四种核苷诊断HCC的灵敏度高于血清AFP,差异有显着性。
联合检测尿中四种核苷诊断HCC的特异度稍高于血清AFP,差异无显着性。
若联合检测4种核苷和血清AFP则灵敏度即可提高至%(20/21)。
3讨论
尽管肿瘤患者尿中修饰核苷的增高机制尚未完全清楚,但多种肿瘤尿中修饰核苷增高的事实,使尿中修饰核苷能够成为用于肿瘤普查的广谱肿瘤标记物。
甲胎蛋白(AFP)是目前诊断肝癌最特异的标记物,但AFP诊断肝癌仍有假阳性和假阴性,约有30%以上的患者血清AFP含量小于20μg/L。
因此,寻找新的肿瘤标记物以弥补现有标记物的不足将非常有必要。
核苷标记物在HCC诊断中的应用研究,国内外尚不多见且多集中于单个核苷假尿嘧啶核苷(pseudouridine,Pseu)的研究。
Tamura等发现肝癌患者尿中Pseu平均浓度明显高于肝硬化患者和健康对照。
Yang等研究认为尿核苷检测结合主成分分析法(PCA)能较好地鉴别肝癌、肝炎与肝硬化患者。
国内袁成等发现Pseu的含量在原发性肝癌组中升高显着,肝良性占位病变和健康组均无显着升高,肝硬化组Pseu有2例显着升高。
高健等发现HCC组尿Pseu浓度明显高于正常对照组肝炎组、肝硬化组及肝良性占位病变组;而与转移性肝癌组和消化道恶性肿瘤组差异无显着性。
本研究发现未发生转移的HCC患者尿中四种修饰核苷含量已明显增高,提示其可作为HCC患者早期诊断的指标之一,并有助于肝脏良恶性肿瘤的鉴别诊断。
研究发现,尿中修饰核苷M5U、I、Ac4c、X与HCC患者AFP、肿瘤体积大小均无相关性。
推测其原因可能为体积大的肿瘤进入生长周期的瘤细胞比例较小且有大量细胞发生坏死。
小肿瘤的细胞群生长迅速,具有较高的转录活性,RNA转化速度较快,尿中核苷的排放水平较高。
研究中发现11例AFP阴性的HCC患者有10例联合检测4种核苷为阳性(10/11),故对AFP阴性的HCC患者可起到补充诊断的作用。
利用尿中修饰核苷作为标记物进行检测,有可能弥补AFP检测所遗留的不足,且检测方便。
但由于检测方法及被检修饰核苷种类的不同,各家报告差异较大。
如能建立稳定的检测方法,分析出某种修饰核苷的变化与肿瘤细胞增殖的关系,将使其可能成为用于HCC普查及治疗后随访的理想的肿瘤标记物。
【参考文献】
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TamuraS,AmuroY,NakanoT,etal.Urinaryexcretionofpseudouridineinpatientswithhepatocellularcarcinoma[J].
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袁成,张黎明,王景祥,等.假尿嘧啶核苷的高效液相色谱法测定及其与肝细胞性肝癌的关系[J].肿瘤,1994,14(4):
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高健,沈鼎明.尿液假尿嘧啶核苷对肝细胞性肝癌诊断价值的探讨[J].中华肝脏病杂志,1996,4
(1):
29-32.
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