生物技术制药.docx

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生物技术制药

生物技术制药

一、概述

1、生物药物

生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

2、生物技术制药

采用现代生物技术人为地创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品。

3、生物技术药物

采用DNA重组技术、单克隆抗体技术或其它生物新技术研制的蛋白质、治疗性抗体或核酸类药物。

4、生物技术

以生命科学为基础，利用生物体（或生物组织、细胞及其组分）的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种（品系）进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。

5、生物技术的内容

基因、细胞、酶、发酵、生化、蛋白质、抗体、糖链工程和海洋生物技术。

6、生物技术的相关学科

生物学（微生物学、分子生物学、遗传学）

化学（生物化学、无机、有机、分析、物理化学）

工程学（化学工程、电子工程）

医学、药学、农学。

7、生物技术的应用

（1）、医药利用基因治疗人类疾病的技术取得了突破性进展，原来用于治疗单基因缺陷的遗传病的治疗技术，现在已快速扩展到癌症、爱滋病、乙型肝炎、心血管病，此外，诊断试剂、酶试剂、动植物医药产品、核酸类药物也取得了很大进展。

（2）、农业转基因动植物的新品种，大幅度提高产量和质量。

（3）、食品氨基酸（天冬氨酸、半胱氨酸），有机酸（苹果酸、酒石酸），做食品添加剂，香料，葡萄糖，果糖，淀粉酶。

（4）、工业农药、香料、饲料、工业酶、有机酶、皮革工业脱毛软化、丝绸脱胶、加酶洗衣粉。

（5）、环境净化利用微生物或酶处理废物和废水。

（6）、能源微生物发酵产甲烷—沼气。

二、生物技术发展简史

生物技术是人类对生物资源（微生物、动植物）的利用、改造并为人类服务的技术，它的发展已有几千年的历史，将其发展过程按技术特征可分为三个阶段。

1、传统生物技术阶段出现在公元前几千年，直到20世纪30年代，主要是酿造技术，当时人们只知道酿造技术，但不知道这些技术的内在原因，1680年出现了显微镜，人们才知道有微生物的存在，1857年用实验方法证明了酒精发酵与酵母菌有关，并最终确征为酶，到此才揭开了发酵现象的奥秘。

该阶段的产品：

乳酸、酒精、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶。

该阶段生产的特点：

过程简单，大多数属于兼气发酵或表面培养，生产设备要求不高，产品化学结构简单，属于初级代谢产物。

2、近代生物技术阶段20世纪40年代，第二次世界大战的爆发，急需疗效好、毒副作用小的抗细菌感染药物，出现了青霉素，产量低，产品价格昂贵，随着发酵新技术的出现，又相继发现了链霉素、红霉素、金霉素等药物。

该阶段的主要产品：

抗生素、维生素、甾体、氨基酸；食品工业的工业酶制剂、食用氨基酸、酵母、啤酒；化工业的酒精、丙酮、丁醇、沼气；农林业的农药；环境保护业的生物治理污染。

该阶段生物技术的特点：

（1）、产品类型多，初级（氨基酸、酶、有机酸）；次级（抗生素）；生物转化（甾体）。

（2）、生物技术要求高，纯种、无菌、通气、产品质量要求也高。

（3）、生产设备规模大，500立方米，2000立方米。

（4）、技术发展速度快，青霉素，200单位每毫升，8万单位每毫升，形成了交叉学科生化工程。

3、现代生物技术

标志，1953年美国Watson和英国的Crick共同提出了DNA的双螺旋结构，揭开了生命科学划时代的一页，此后，又相继出现了一系列新发现和新进展，遗传中心法则，破译遗传密码，基因重组，单克隆抗体，DNA测序。

产品见表1-1。

动植物细胞培养技术。

该阶段产品种类很多，胰岛素、干扰素、生长激素等。

该阶段生物技术的内容包括：

（1）、重组DNA技术及其它转基因技术；

（2）、细胞和原生质体融合技术；

（3）、酶或细胞的固定化技术；

（4）、植物脱毒和快速繁殖技术；

（5）、动物细胞大量培养技术；

（6）、动物胚胎工程技术；

（7）、现代发酵技术（高密度发酵、连续发酵、新型发酵技术）；

（8）、现代生物反应工程和分离工程技术；

（9）、蛋白质工程技术；

（10）、海洋生物技术。

三、医药生物技术新进展

近10年是生物技术迅速发展的时期，主要有四个方面的进展。

1、基础研究不断深入

重组DNA，新基因的克隆和基因表达调控的研究全面展开，分子生物学理论和技术两大体系已基本完成，生物学中的中心法则所体现的遗传信息的转移规律奠定了遗传工程的理论基础，有关基因表达的各种研究结果又丰富和发展了中心法则，DNA测序，为对付不治之症提供了可能性。

人类基因组计划的研究目标就是要定位所有的基因和测定它们的核苷酸序列，人类基因组大约有10万个基因，30亿个核苷酸对，完成这项研究是一项空前浩大的工程，它的实施对人类了解自身和医学发展有划时代的意义。

与疾病相关的基因有约5000个，一些重要的遗传病基因已被分离并测序。

3、新产品不断出现

自20世纪80年代以来，仅美国、日本开发的生物新技术新药物便达200多种，大都是重组蛋白质药物和重组DNA药物。

世界范围内，销路最好的生物技术药物，临床应用时间比较长，疗效比较好，毒副作用比较小，干扰素，抗病毒、抗癌，有种属特异性，动物干扰素对人无效，最初收集大量血液，提取白血球再与诱导物作用来生产，现在用基因重组技术把干扰素基因插入大肠杆菌来生产。

白介素与机体免疫功能有关，白介素-2促进淋巴细胞分化增殖。

乙型肝炎疫苗，预防乙肝。

集落刺激因子，可减轻化疗时副作用，可用于爱滋病、白血病。

肿瘤坏死因子，可损伤癌细胞。

研制更新一代的药物和更新的应用方法，集落刺激因子和白介素的基因构建到酵母细胞中，使之产生融合蛋白质，药效增强。

生产方法从利用重组DNA的微生物生产转向利用动植物来生产蛋白质类药物，构建新型多价活疫苗。

3、新试剂、新技术不断出现

细胞工程及基因工程的应用产生了新的医疗技术—细胞移植和基因治疗。

细胞移植用于骨髓移植，治疗白血病、淋巴病，免疫缺陷，再生障碍性贫血及放疗、化疗后的肿瘤病人，基因治疗目前仍在实验阶段，可用于遗传病、癌症、爱滋病的治疗，心脏内直接注入外来基因，两三周长出新血管，关键点是如何将有用基因引入靶组织中，并使之在合适的地方、合适的时间表达合适量的活性多肽或蛋白质。

生物试剂的开发，单克隆抗体，专一性强，由鼠源性转向人源性，应用：

基础研究，诊断，体内显像定位，食品和环境检测，体内治疗和导向治疗。

工业上利用单抗进行亲和层析高效纯化天然基因工程基因，单抗可与放射性核素、酶、荧光素标记技术相结合，用于检测和治疗。

病毒、细菌、寄生虫和某些肿瘤的诊断，免疫学，激素、酶和环境污染因子的检测，显像定位，单抗与抗癌药物偶合后，减少副作用，加大药量。

4、新型生物反应器和新分离技术不断出现

传统：

搅拌式生物反应器

改进：

塑料袋、填充床、气升式、流化床、固定床、袋式、膜式、中空纤维、固定化培养。

搅拌形状改进：

浆式、棒式、船帆式、笼式通气。

1000升。

四、我国的医药生物技术

我国起步晚，20世纪80年代初，把生物技术定为科技和产业发展的重要新领域之一，85年制定了生物技术发展政策，89年制定了90—2000年和2020年发展纲要。

20世纪70年代，起步时是固定化酶的研究，固定化细胞，80年代初期，开发研究乙型肝炎基因工程疫苗，基因工程干扰素，国内投入大量资金建立30个生物技术领域国家重点实验室，可生产活性多肽类药物、干扰素、白介素、心钠素等多种生物药物。

五、医药生物技术发展展望

20世纪生物技术是科研阶段，产业初期。

21世纪将进入大规模产业化，研究成果转变成产品。

三大类药物：

生物、化学、中药。

发展比较迅速的医药生物技术有四个领域：

1、利用新发现的人类基因，开发新型药剂

完成人类基因组计划会发现许多新基因，而且很多与疾病有关或直接参与疾病的形成，找到了目的基因—也就是需要修复的基因可以帮助我们利用基因工程来寻找新药或基因治疗的方法，21世纪50%-70%的新药来自基因工程的研究。

2、新型疫苗的研制

疫苗在许多疾病的预防、治疗中起着其他药物无法代替的作用，现在正在进行爱滋病及20多种基因型癌症疫苗的研制，用于防治癌症、爱滋病、关节炎、贫血、骨质疏松、百日咳、乙肝等疾病。

3、基因工程活性肽

淋巴因子，生长因子，激素，酶，都属于活性多肽。

由两条以上肽链组成，很强的生物活性，常以微量存在于人体（基因工程方法生产）应用：

（1）在体外和离体研究中作为细胞培养补充剂

（2）基础研究对象（3）作为研究其他现象（免疫）的一种辅助剂（4）诊断剂（5）生物治疗的研究开发脑啡肽、胃肠肽。

4、其他

疾病早期诊断，PCR，单克隆抗体转基因材料外源基因在植物中表达，脑啡肽，干扰素，生长激素，转血红蛋白基因的烟草植物生产人造血浆。

一、生物药物的来源

1、生物药物的定义

生物药物是指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，从生物体、生物组织、细胞、体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。

2、生物药物的原料来源

天然的生物材料：

人体、动植物、微生物和各种海洋生物。

随着生物技术的发展，有目的人工制得的生物原料成为当前生物制药原料的重要来源，如用基因工程技术制得的微生物或细胞。

生物药物原料的选择、预处理与保存方法。

（1）、原料选择原则有效成分含量高，原料新鲜，来源丰富、易得，产地较近，原料中杂质含量少，成本低。

（2）、预处理与保存预处理：

就地采集后去除结缔组织、脂肪组织等不用的成分，将有用成分保鲜处理，收集微生物原料时，要及时将菌体与培养液分开，进行保鲜处理。

保存方法：

冷冻法，适用于所有生物原料，-40℃；有机溶剂脱水法，丙酮，适用于原料少、价值高，有机溶剂对原料生物活性无影响；防腐剂保鲜，常用乙醇、苯酚等，适用于液体原料，如发酵液、提取液。

二、生物药物的特性

1、药理学特性

（1）、治疗的针对性强细胞色素c用于治疗组织缺氧所引起的一系列疾病。

（2）、药理活性高注射用的纯ATP可以直接供给机体能量。

（3）、毒副作用小、营养价值高蛋白质、核酸、糖类、脂类等生物药物本身就直接取自体内。

（4）、生理副作用时有发生生物体之间的种属差异或同种生物体之间的个体差异都很大，所以用药时会发生免疫反应和过敏反应。

2、生产、制备中的特殊性

（1）、原料中的有效物质含量低激素、酶在体内含量极低。

（2）、稳定性差生物药物的分子结构中具有特定的活性部位，该部位有严格的空间结构，一旦结构破坏，生物活性也就随着消失。

酶，很多理化因素使其失活。

（3）、易腐败生物药物营养价值高，易染菌、腐败。

生产过程中应低温、无菌。

（4）、注射用药有特殊要求生物药物易被肠道中的酶所分解所以多采用注射给药，注射药比口服药要求更严格，均一性、安全性、稳定性、有效性。

理化性质、检验方法、剂型、剂量、处方、储存方式。

3、检验上的特殊性

由于生物药物具有生理功能，因此生物药物不仅要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标。

第一节概述

生物技术的核心是基因工程，基因工程技术最成功的成就是用于生物治疗的新型生物药物的研制。

之前，许多在疾病诊断、治疗和预防中有重要价值的内源性生理活性物质（激素、细胞因子、神经多肽、调节蛋白、酶类、凝血因子等）以及某些疫苗，由于材料来源困难或制造技术问题而无法研制出产品，即使应用传统技术从动物器官中提取出来，也因为造价太高而使患者负担不起。

而应用基因工程技术就可以从根本上解决上述问题，它的应用使人们在解决癌症、心血管疾病和内分泌疾病等方面中取得明显效果，它为上述疾病的预防、治疗和诊断提供了新型疫苗、新型药物和新型诊断试剂。

利用基因工程生产的药物主要是医用活性蛋白和多肽：

免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体；细胞因子，干扰素、白介素、生长因子；激素，胰岛素、生长激素；酶类，尿激酶、链激酶超氧化物歧化酶。

利用基因工程技术生产药物的优点：

1、大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。

第二节基因工程药物生产的基本过程

基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。

基因工程药物制造的主要程序是：

目的基因的克隆；构建DNA重组体；将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌；工程菌的发酵；外源基因表达产物的分离纯化；产品的检验等。

通常将基因工程药物的生产分为上游和下游技术。

上游阶段是研究开发必不可少的基础，它主要是分离目的基因，构建工程菌，主要在实验室完成。

下游阶段是从工程菌的大规模培养到产品的分离纯化、质量控制，该阶段是将实验室成果产业化、商品化。

制备基因工程药物的一般程序：

获得目的基因组建重组质粒构建基因工程菌

培养工程菌产物分离纯化除菌过滤半成品检定成品检定包装

基因的表达系统有原核生物系统和真核生物生物系统。

选择表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达量的多少和分离纯化的难易。

下游下工技术主要包括工程菌大规模培养最佳参数的确定、新型生物反应器的研制、高效分离介质及装置的开发、分离纯化的优化控制、高纯度产品的制备技术、生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造、电子计算机的优化控制等。

第三节目的基因的获得

对于原核生物，其基因总量不大，可以选用合适的限制性核酸内切酶切下目的基因，而对于真核生物不能进行直接分离。

真核细胞中基因总量较大，从染色体中直接分离纯化目的基因极为困难，另外，真核基因一般都有内含子，如果以原核细胞作为表达系统，即使分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA转录后的加工系统，真核基因转录的mRNA也不能被加工、拼接成为成熟的mRNA，因此不能直接克隆真核基因。

克隆真核基因常用的方法有逆转录法和和学合成法。

一、逆转录法

逆转录法就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成互补DNA，然后进行互补DNA的克隆表达。

从产生该蛋白质的真核细胞中提取mRNA，以其为模板，在逆转录酶的作用下，反转录合成该蛋白质mRNA的互补DNA，再以互补DNA为模板，在逆转录酶或DNA聚合酶作用下，最终合成编码该蛋白质的双链DNA序列，该序列不含内含子。

1、mRNA的纯化

细胞内含有三种RNA，mRNA占RNA总量的2%-5%，相对分子量大小不一致，分离也有很大的困难，但是mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸组成的末端，长达20-250个腺苷酸，足以吸附于寡聚胸苷酸-纤维素上，从而可以用亲和层析法将mRNA从细胞总RNA上分离出来，可得到纯度较高的mRNA。

2、互补DNA第一链的合成

mRNA的3’末端常含有一多聚腺苷酸序列，可用寡聚脱氧胸苷酸为引物，在逆转录酶的催化下，开始互补DNA的合成。

在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，在反应中以及反应后可通过测定放射性标记的dNTP掺入量，计算出互补DNA的合成效率，在凝胶电泳后，进行放射自显影分析产物的分子大小，探索最佳反应条件。

3、互补DNA第二条链的合成

先用碱解或核酸酶酶解的方法除去互补DNA-mRNA杂交链中的mRNA链，然后以互补DNA第一链为模板合成第二链，并用核酸酶S1专一性切除单链DNA。

4、互补DNA克隆

载体有两种质粒和噬菌体，根据重组后插入的互补DNA是否能够表达、能否经转录和翻译合成蛋白质，又将载体分为表达型载体和非表达型载体。

互补DNA插入片段小于10千碱基对，可选用质粒载体，如大于10千碱基对则选用噬菌体作为载体。

二、化学合成法

较小的蛋白质或多肽的编码基因可以采用人工化学合成法合成，其先决条件是已知目的基因的核苷酸序列，或已知蛋白质的氨基酸序列，按相应的密码子推导出DNA的碱基序列。

用化学方法合成目的基因不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火使连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。

人工化学合成的限制：

1、不能合成太长的基因，50-60个碱基对；2、人工合成碱基对时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大的困难；3、费用较高。

第四节基因表达

基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。

进行基因表达，我们所关心的是目的基因的表达产量、表达产物的稳定性，产物的生物学活性和表达产物的分离纯化。

一、宿主细胞的选择

宿主细胞应满足以下要求：

1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用廉价易得的原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，产物容易提取。

宿主细胞的种类及特点

宿主可分为两大类：

原核细胞—大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌；

真核细胞—酵母菌、丝状真菌、哺乳动物细胞。

1、原核细胞

（1）、大肠杆菌

生长迅速、对其研究比较深入，所以常用，特点：

表达基因工程产物的形式多种多样，有细胞内不溶性表达（包含体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等，极少数还可以分泌到细胞外表达。

限制：

没有信号肽，所以产品多为细胞内产物，提取时需破碎细胞，这样细胞质内其他蛋白质也释放出来，造成提取困难，由于分泌力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物必须在下游处理过程中经过变性和复性处理才能恢复其生物活性。

（2）、枯草芽孢杆菌

分泌能力强可将蛋白质产物直接分泌到培养液中，不形成包含体，但该菌也不能使蛋白质产物糖基化，另外由于它有很强的胞外蛋白酶，会对产物进行降解。

（3）、链霉菌

主要特点：

不致病、使用安全、分泌能力强、可将表达产物直接分泌到培养液中，具有糖基化能力。

2、真核细胞

（1）、酵母

特点：

是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。

繁殖迅速、可以廉价地大规模培养，没有毒性。

能将表达产物直接分泌到胞外，表达产物能糖基化。

（2）、丝状真菌

特点：

有很强的蛋白质分泌能力，能正确进行翻译后加工，而且糖基化方式与高等真核生物相似。

（3）、哺乳动物细胞

特点：

产物可分泌到胞外，细胞培养液成分完全可控制，使产物纯化较容易，表达产物能糖基化，接近或类似与天然产物；动物细胞生产慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度较稀。

综上所述，目前使用最广泛的宿主仍然是大肠杆菌和酿酒酵母。

因为对它们的遗传背景研究得比较清楚，建立了许多适合于它们的克隆载体和DNA导入方式，并且许多外源在这两种宿主菌中得到表达成功。

二、大肠杆菌中的基因表达

1、载体

根据真核基因在原核细胞中表达的特点，表达载体应具备下列条件：

（1）、载体能够独立复制，有复制起点，有严紧型和松弛型，严紧型伴随宿主染色体的复制而复制，在宿主细胞中拷贝少（1-3）；松弛型的复制可不依赖与宿主细胞，在宿主细胞中拷贝多达3000个。

（2）、应有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。

（3）、应具有很强的启动子，能为达成杆菌的RNA聚合酶所识别。

（4）、应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。

（5）、应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。

（6）、所产生的mRNA必须有翻译的其始信号。

2、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

外源基因在宿主中的表达受许多因素影响的，所以在建立表达体系时要综合考虑各种因素的作用，建立一个合适的表达体系，从而使外源基因得到最大的表达量，获得最多的表达产物。

（1）、外源基因的拷贝数

外源基因是克隆到载体上的，所以载体在宿主中的拷贝数就直接与外源基因的表达相关，应将外源基因克隆到高拷贝的质粒载体上，这对于提高外源基因的总体表达水平非常有利。

（2）、外源基因的表达效率

启动子的强度—在转录水平上直接影响基因的表达、核糖体结合位点的有效性、SD序列和起始ATG的间距、密码子的组成等都会不同程度地影响外源基因的表达。

（3）、表达产物的稳定性

表达的外源基因，其产物会受到宿主细胞内降解该蛋白质的酶的作用，使得实际产量很低。

可采用下列方法来提高表达产物的稳定性：

组建融合基因，产生融合蛋白；利用大肠杆菌的信号肽或某些真核多肽中自身的信号肽，把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，而使外源蛋白不易被酶降解；采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性；选用蛋白酶缺陷型大肠杆菌为宿主细胞。

（4）、细胞的代谢负荷

外源基因在宿主细胞内的大量表达，必然会影响宿主细胞正常的生长代谢，有些产物对宿主还会有毒害作用，将细胞杀死，为了减轻宿主细胞的代谢负荷，同时还得提高外源基因的表达水平，可以采取当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表达。

即将细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段，使表达产物不会影响细胞的正常生长，当宿主细胞的生物量达到饱和时，再进行基因产物的诱导合成，以减低宿主细胞的代谢负荷；另外，将宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开，当宿主细胞迅速生长时，抑制重组质粒的复制，当细胞生长量累积到一定水平后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加质粒拷贝数。

（5）、工程菌的培养条件

优化培养条件使外源基因大量表达。

3、真核基因在大肠杆菌中的表达形式

三种：

融合蛋白、非融合蛋白、分泌型。

（1）、融合蛋白

融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。

优点：

基因操作简便、蛋白质在菌体内比较稳定、不易被细菌酶类所降解、容易实现高效表达。

缺点：

只能做抗原作用，原核多肽序列可能会影响真核蛋白的免疫原性。

可再切割成两个多肽链。

（2）、非融合蛋白

表达非融合蛋白的操纵子必须改建成：

细菌或噬菌体的启动子—细菌的核糖体结合位点—真核基因的起始密码子—结构基因—终止密码。

要求核糖体结合位点序列与翻译起始密码之间的距离要合适，稍有不适就会影响表达效率。

优点：

能够较好地保持原来的蛋白活性；

缺点：

容易被蛋白酶破坏，氨基末端常常带有甲硫氨酸，在人体内用药时可能会引起人体免疫反应。

（3）、分泌型

将外源基因接到信号肽之后，使之在胞质内有效地转录和翻译，当表达的蛋白质进入细胞外膜和细胞内膜之间的周质后时，被信号肽酶识别切割，从而释放出有生物活性的外源基因表达产物。

特点：

一些可被细胞内蛋白酶所降解的蛋白质在周质中是稳定的；由于有些蛋白质能按一定的方式折叠，所以在细胞内表达时无活性的蛋白质分泌表达时却具有活性；蛋白质信号肽和编码序列之间能被切割，因而分泌后的蛋白质产物不含起始密码所编码的甲硫氨酸。

产量不高，信号肽不被切割或不在特定位置上切割。

三、酵母中的基因表达

1、载体

酵母载体是可以携带外源基因在在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。

从大肠杆菌中制备质粒要比从酵母中容易得多，因此酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段在转入酵母中。

酵母载体有两类：

普通表达载体和精确表达载体。

普通表达载体，只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其氮末端氨基酸是否有增减并无严格要求。

精确表达