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下学期补充讲义一
中国农业科学院研究生院基因工程原理
2014年下学期补充讲义
(一)
分子生物学研究简史
吴乃虎
(中国科学院遗传与发育生物研究所)
黄美娟
(北京大学生命科学学院细胞遗传学系)
一、分子生物学的含义
1.分子生物学(MolecularBiology)术语的索源
一般认为分子生物学这个术语最早似乎是由美国科学家沃伦·维弗(WarrenWeaver)于1938年给洛克菲勒基金会“RockefellerFoundation”一份报告中首先使用的。
他的原话是:
“AmongthestudiestowhichtheFoundationisgivingsupportisaseriesinarelativelynewfield,wtichmaybecalledmolecularbiology”
(在本基金给于资助的研究项目中,有一系列研究涉及相对新的领域,它可以称为分子生物学)。
当然也有一种说法认为“分子生物学”这个术语最初是由布什(VannevarBush)于20世纪40年代创造的。
此后随着时间的推移,这个术语的使用变得越来越普及。
似乎是在1956年,首次建立了分子生物学专门研究机构,即剑桥分子生物之医学研究委员会实验室:
英文名称如下:
TheMedicalReseachCouncilLaboratoryofMolecularBiologyatCambridge。
1959年头一种专门刊物“分子生物学杂志”(TheJournalofMolecularBiology)创刊。
1963年建立第一个国际性的专门学术组织,即欧洲分子生物学协会(TheEuropeanMolecularBiologyOrganization)
2.分子生物学定义
分子生物学有多种不同的定义:
(1)RobertF.Weaver的定义
广义的定义是:
在分子水平上解释生命现象。
R.F.Weaver认为这个定义缺点是难以同生物化学相区分,故不甚适用。
狭义定义是:
在分子水平上研究基因的结构与功能。
这个是R.F.Weaver认可并推荐的定义。
由此可见,就其研究内容而言“分子生物学”与“分子遗传学”之间并无实质性的差别。
参阅RobertF.Weaver编著的“MolecularBiplogy(5thEdition)”,2012,TheMcGraW-HillCompanies。
*附生物化学定义:
用化学原理和方法,研究生命现象的学科。
通过研究生命体的化学组成、代谢、营养、酶功能、遗传信
传递、生物膜、细胞结构及分子病等阐明生命现象。
(2)DavidClark定义
分子生物学通常是指那些与基因、基因产物及遗传相关的生物大分子的生物学。
换言之,分子生物学经常可用另一个更合适的术语“分子遗传学”于以替代。
由此可见,在DavidClark心目中,分子生物学就是分子遗传学,二者属于同一科学领域。
参阅D.Clark编著的“MolecularBiology-UnderstandingtheGeneticRevolution”(二版))2007。
科学出版社(英文版)
(3)LizabethA.Allison的定义
广义的定义是:
分子生物学是在分子水平上研究生命现象的一门科学。
狭义的定义是,研究DNA的分子结构、遗传信息的编码以及基因表达与调节的分子基础的一门生命科学。
参阅L.A.Allison编著的FundamentalMolecularBiology(2ndEdition),2012。
(4)我们的定义:
广义的定义是:
分子生物学是一门研究构成活细胞生命活动基础的蛋白质、核酸、其他高分子聚合物及相关组分的结构与功能的生命科学。
狭义的定义是:
分子生物学是一门偏重于研究基因的复制、转录、翻译、表达调节机理以及参与这些过程的蛋白质因子的结构与功能的生命科学。
参见吴乃虎等编著的“基因工程术语”,2006年,科学出版社。
(5)全国科学技术名词审定委员会公布的“生物化学与分子生物学名词”规定的定义:
分子生物学:
从分子水平研究生命现象物质基础的学科。
研究
细胞成份的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生
命现象的关系,如遗传信息的传递,基因的结构、复制、转录、
翻译、表达调控和表达产物的生理功能以及细胞信号的转导
等。
总而言之,有关分子生物学定义多种多样,以上所列仅是一小部分。
也许最令人满意而简短的定义是由雅克·莫诺(JacquesMonod)给出的:
分子生物学的核心思想是,生命的基本特征可以用它的大分子结构于解释。
正是居于上述认识,如今的生物化学、遗传学、分子生物学及生物物理学之间的界限已经变得越来越模糊。
至于分子生物学和分子遗传学之间究竟有何差别,实在难以言明。
二、分子生物学发展简史
1.传递遗传学
科学界公认分子生物学是由遗传学和生物化学综合发展而来的一门交叉学科。
因此回顾分子生物学发展简史必须从19世纪中期孟德尔豌豆杂交实验讲起。
但需明白,根据分子生物学的定义,关于基因的早期研究显然不能纳入分子生物学或分子遗传学的范畴。
因此特称这一阶段的基因研究为传递遗传学(transmissiongenetics)。
分子生物学的研究历史是从1953年之后开始的。
传递遗传学又称经典遗传学,它的主要研究内容可概括为如下4个方面:
(1)遗传的孟德尔定律
(2)遗传的染色体理论
(3)遗传的重组与作图
(4)重组的物理证据
2.生化遗传学
20世纪40年代初期,遗传学家已经清醒地认识到,如果继续沿用经典遗传学的研究方法和实验体系,是难以有效地揭示基因控制蛋白质合成及表型特征的遗传机理。
因此,他们开始广泛地应用诸如粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)和肺炎链球菌(Streptococuspneumoniae)等微生物为研究材料,并着力从生物化学的角度探索基因与蛋白质及表型之间内在联系的分子本质。
人称这个阶段的遗传学为生化遗传学或微生物遗传学。
生物化学家和微生物学家参与遗传学的研究,是促使经典遗传学向分子遗传学(或分子生物学)过渡的一支不可忽视的重要力量。
生化遗传学在短短的二三十年间就取得如下4项重要的成就:
(1)1941年,G.Beadle和E.Tatum提出了“一种基因一种酶假说”(one-geneone-enzymehypothesis)。
后修改为“一种基因一种多肽”。
(2)微生物遗传交换方式的发现
1928年F,Griffith在肺炎链球菌中发现了转化(transformation)现象;
1946年J.Lederberg和E.Tatum发现了细菌接合作用(conjugation);
1952年N.Zinder和J.Lederberg发现了细菌转导(transduction)现象。
这三种遗传交换方式的发现,为以微生物为材料研究基因分子本质及其功能奠定了良好的实验体系,极大地促进了生化遗传学的研究与发展。
(3)1944年,微生物学家O.Avery等人证明肺炎链球菌的转化因子是DNA。
(4)1952年,A.Hershey和M.Chase在噬菌体感染实验中发现,转化因子的确是DNA而不是蛋白质,肯定了Avery的结论。
至此,基因的分子载体是DNA已是不争的事实。
生化遗传学的发展为分子遗传学(或分子生物学)的诞生奠定了坚实的理论基础。
它上承经典遗传学,下启分子遗传学,是前者向后者发展过程中重要的过渡阶段。
3.分子遗传学的诞生
1953年J.Watson和F.CrickDNA双螺旋模型的建立,标志着遗传学研究已经跨入了分子遗传学的新阶段。
它全面继承和发展了经典遗传学和生化遗传学的科学内涵,又孕育并催生了基因工程学、基因组学和表观遗传学等数个现代遗传学主要分支的相继问世。
毫无疑义在整个遗传学的发展史上,分子遗传学的确起到了承上启下的传承作用。
应该说二十世纪50年代初期至70年代初期,是分子遗传学迅
猛发展快速进步的年代。
在这短短的二十余年间,许多有关遗传学的基本原理相继提出,大量的重要发现不断涌现。
主要有如下几个方面:
(1)1956年,美国科学家科A.Kornberg在大肠杆菌中发现了DNA聚合酶Ⅰ(DNApolymeraseⅠ)。
这是可以在试管中合成DNA链的头一种核酸酶,从此拉开了DNA合成研究的序幕;
(2)1957年,H.Fraenkal-Conrat和B.Singer证实,烟草花叶病毒TMV的遗传物质是RNA,进一步表明RNA同样具有重要的生物学意义;
(3)1958年M.Meselson和F.W.Stahl发现了DNA半保留复制(semiconservativereplication)机理,揭示了基因之所以能够代代相传准确保留的分子本质;
(4)同年F.Crick提出了描述遗传信息流向的中心法则(centraldogma),阐明了在基因表达过程中,遗传信息从DNA到RNA再到蛋白质的传递途径;
(5)1961年两位法国科学家M.F.Jacob和J.Monod建立了解释原核基因表达调节机理的操纵子模型(operonmodel),说明基因不但在结构上是可分的,而且在功能上也是有分工的;
(6)自1961年开始,经过M.W.Nirenberg和H.G.Khorana等科学家的努力,至1966年全部64种遗传密码子(geneticcodon)均已成功破译,从而将RNA分子上的核苷酸顺序同蛋白质多肽链中的氨基酸顺序联系起来,它是分子遗传学发展过程中影响最为深远的科学发现之一;
(7)1970年,美国科学家H.N.Temin和D.Baltimore发现了RNA病毒及其反转录酶(reversetranscriptase),证明遗传信息也可以从RNA反向传递到DNA,这是对中心法则的重大修正;
(8)1970年,H.O.Smith和D.Nathans从流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)中首先分离到Ⅱ型限制性内切核酸酶,它与1967年发现的DNA连接酶(DNAligase),同为DNA体外重组技术的建立提供了酶学基础。
正是上述这些研究发现与进展构成了分子遗传学的核心内容。
4.基因工程学
(1)20世纪70年代诞生基因工程的理论基础主要有如下三个方面:
第一,在20世纪40年代确立了遗传信息(geneticinfomation)的携带者,即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,明确了遗传的物质基础问题;
第二,在20世纪50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理,弄清了基因的自我复制和传递的问题;
第三,在20世纪50年代末期和60年代,相继提出了中心法则和操纵子学说,并成功地破译了遗传密码系统,阐明了遗传信息的流向和表达问题。
由于这些问题的相继解决,人们期待已久的应用类似于工程技术的程序主动地改造生命体的遗传特性,创造具有优良性状的生物新类型的美好愿望,从理论上讲已有可能变为现实。
(2)20世纪70年代诞生基因工程的技术基础:
(a)限制性内切核酸酶(restrictionendonulease)和DNA连接酶的DNA分子体外切割与连接技术;
(b)基因克隆载体的(cloningvector)构建方法;
(c)大肠杆菌转化体系的建立;
(d)DNA序列分析(DNAsequencing)技术;
(e)核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)技术;
(f)琼脂糖凝胶电泳(agarosegelelectrophoresis)技术。
有趣的是,这些技术差不多是同时得到发展,并被迅速地应用于DNA体外重组(invitrorecombination)实验。
(3)基因工程的优点:
第一,具有跨越天然物种屏障的能力,可以把来自不同物种
的DNA(基因)转移到与其毫无亲缘关系的新寄主细胞中进行复制与表达。
这意味着应用基因工程技术有可能按照人们的主观愿望和社会需求,创造出自然界原本并不存在的新的生物类型。
第二,能够使特定的DNA片段或目的基因在大肠杆菌寄主细胞中大量扩增。
如此人们便能够制备到大量纯化的特定DNA片段或目的基因,从而极大地促进了有关基因分子遗传学的基础研究工作。
第三,确立了反向遗传学(reversegenetics)研究途径。
传统遗传学是根据生物个体的表型特征去探究其相应的基因型的结构,人们习惯上称这样的遗传学研究途径为正向遗传学(forwardgenetics)。
随着分子遗传学尤其是重组DNA技术的发展与应用,科学工作者已有可能通过配合使用基因克隆、定点诱变(site-directedmutagenesis)、PCR扩增及转基因等各项技术,首先从基因开始研究其核苷酸序列特征、蛋白质产物的结构与功能,进而根据人们的需求对基因进行修饰改造,然后再返回到生物体内观察其生物学活性与表型特征的变化。
为与传统的正向遗传学相区别,人们称这样的遗传学研究途径为反向遗传学。
5.基因组学
基因组(genome)这个术语是1986年由T.Roderick首先使用。
系由基因(gene)和染色体(chromosome)两个英语单词缩合而成。
它是指生命体细胞所携带的全部遗传信息,包括所有的基因及基因间序列的总和。
例如人类基因组便是由复杂的核基因组和简单的线粒体基因组两大部分组成。
前者含有约22000个基因,后者则只有37个基因。
由于两者复杂度相差过于悬殊,因此通常所说的人类基因组全测序,一般就是指核基因组全测序。
(1)人类基因组
人类基因组含有22条常染色体及两条性染色体X和Y,其DNA分子的总长度约为3.3×109bp。
但各条染色体DNA分子的长度并不一样,最长的一条达250Mb,最短的一条则仅有55Mb。
人类线粒体基因组DNA是一种长度为16569bp的环形分子。
每个细胞平均拥有800个左右的线粒体颗粒,其中每个颗粒含有10个基因组拷贝。
一个成年人个体大约拥有总数达7.5万亿个细胞,每个细胞都含有相同的基因组拷贝。
但也有某种特殊类型的细胞,比如处于终极分化状态的血细胞(hemocyte)并不存在细胞核,因此也就没有核基因组(nucleargenome)。
体细胞是二倍体,每个细胞都含有两套共44条常染色体和两条性染色体(其中男性的为X和Y,女性的两条都是X)。
单倍体细胞精子和卵子,都只有一套22条常染色体和一条性染色体,其中精子的有X和Y的两种不同的类型,而卵子则只有X的一种类型。
因此,一套完整的人类核基因组,实际上包括22条常染色体和一条Y染色体及一条X染色体,总数为24条染色体。
所以核基因组也称为染色体基因组(chromosomegenome)。
(2)人类基因组计划
在讨论基因组问题时,不能不提及人类基因组计划(HumanGenomeProject,HGP)。
这是一项在1984年由美国科学家首先提出并于1990年10月1日正式启动的、以测定人类基因组全序列为主要目标的国际性合作研究项目。
除了美国之外,参加该项目的国家还有中国、英国、法国、德国、和日本共6个国家,预计总投资30亿美元。
其工程之浩大,任务之艰巨,与制造原子弹的“曼哈顿(Manhattan)计划”、载人登月的“阿波罗(Apollo)计划”相比,均毫不逊色。
人类基因组计划分两步进行:
第一步,图谱(map)的绘制,即将所有的基因全部定位在单倍体基因组的全套24条染色体上,然后对这些功能基因进行核苷酸序列的测定。
第二步,对染色体基因组的DNA分子包括编码的和非编码的进行全序列测定。
它的根本目的在于绘制出一部揭示人体生命奥秘的“天书”,为生命科学特别是医学研究提供极其珍贵的参考资料。
该计划原订于2005年完成,但实际上提前了4年,在2001年人类基因组序列草图的两个版本,便同时分别在《Science》和《Nature》杂志上发表。
随着研究工作的逐步深入和积累的资料日渐丰富,事实上自1995年开始有关基因组的分析范围,便已经由原来确定的图谱绘制和序列测定两大主题,扩展到了包括基因功能鉴定在内的三大任务。
为了适应这种变化了的情况,于是有关的科学工作者便提出了一个更加综合的、能切实反映具体学科内涵的新的术语-基因组学(genomics)于以替代。
(3)基因组学
基因组学是利用基因组全序列提供的信息,结合高通量的基因组分析技术,在基因组水平上研究生命体基因的结构和功能、表达与调节、发育及分化等一系列基础理论问题的分子遗传学的崭新研究领域。
虽然基因组学的概念已得到广大科学工作者认同,但由于历史短暂且发展迅速,因此目前有关于它的具体的研究范围尚难准确界定。
基因组学的主要内容包括:
a.结构基因组学(structuralgenomics);
b.功能基因组学(functionalgenomics);
c.基础基因组学(fundamentialgenomics);
d.应用基因组学(appliedgenomics);
e.比较基因组学(comparativegenomics)。
共五大分支学科。
其中功能基因组学主要涉及转录本组学(transcriptomics)、蛋白质组学(proteomics)和代谢物组学(metabolomics)等研究方向。
基因组学对分子遗传学的发展产生了深刻的影响:
长期以来,分子遗传学家都是以单个基因或由少数几个基因组成的操纵子作为主要的研究对象。
然而由于正常的细胞生命活动,是通过整个基因组所有基因间的协同表达和综合调节的结果。
因此仅靠对单个基因孤立的研究,是难以揭示出细胞新陈代谢过程的真实情况。
基因组学则不然,它的出发点是把基因组的结构与功能作为一个有机的整体看待,认为细胞的生命活动是通过由各个基因的表达调节组成的统一的网络体系综合体现的。
所以它比单基因的研究途径,能够更加有效地接近细胞生命活动的真实面目。
事实上也的确如此,当今分子遗传学的主要进展,例如下面将要叙述的表观遗传学的许多概念,便是来源于基因组学而非单个基因的研究。
6.表观遗传学
最近十多年来,随着分子遗传学尤其是基因组学研究工作的不断深入,在诸多的生命体中发现了越来越多的非孟德尔遗传(non-Mondelianinheritance)现象,和异常的遗传模式(disparatepatternofinheritance)。
这些问题强烈地吸引着一大批有关科学工作者的浓厚兴趣。
如此便有力地促进了表观遗传学的研究,使之迅速地发展成为分子遗传学研究领域中相对独立的一门新兴科学。
(1)表观遗传学概念
英语中,表观遗传学(epigenetics)一词系由后成论(epigenesis)和遗传学(genetics)两个单词缩合而成。
它是专门研究在生命体发育与分化过程中,导致表型性状特征发生改变,而相应基因的核苷酸序列却没有变化的特殊的遗传现象。
这种只对表型有影响但并不导致基因型改变的类型独特的遗传变化,叫做表观遗传改变(epigeneticchange)。
表观遗传学的主要论点是,生命体的大部分性状都是由DNA序列中编码蛋白质的基因负责传递的,但是DNA序列以外的化学标记(chemicalmarker)编码的表观遗传密码(epigeneticcode),对于生命体的表型特征尤其是健康状况,同样也有深刻的影响。
近年来表观遗传学的研究成果告诉我们,DNA并非是遗传信息的惟一载体。
(2)生命体遗传信息的三个不同层次
第一个层次由基因组DNA中编码蛋白质的基因构成。
已知在人类基因组中,此类基因所占的比例还不到全部DNA序列的2%,然而它对于生命活动的重要性已经是众所周知的事实。
第二个层次仅含有非编码的RNA(non-codingRNA,ncRNA)基因,主要包括rRNA基因、tRNA基因、snoRNA基因以及miRNA基因和siRNA基因等。
这类RNA基因存在于基因组DNA广袤的非编码蛋白质的序列中(详见第二章)。
如同蛋白质编码基因一样,RNA基因在生命过程中的作用也是不可或缺的。
第三个层次为表观遗传信息层(epigeneticlayerofinformation)。
它是贮藏于环绕在DNA分子的周围、并同DNA相互结合的蛋白质及其他化合物当中。
尽管目前我们对于表观遗传信息层的功能效应尚不十分清楚,但有大量的报告提示它对于生命体的作用,可能比RNA基因信息层还要重要。
一般认为表观遗传信息层可能在生长、发育、衰老(aging)及癌变的过程中起到关键的作用。
最常见的例子是同卵双生子(twins),虽然他们具有完全一样的基因组DNA序列,但往往也存在着一些外观表型的差异。
在不少的同卵双生子中均观察到,有一个成员患上了诸如神经分裂症(schizophrenia)、躁郁症(bipolardisorder)及儿童糖尿病(childhooddiabetes)等与遗传有关的复杂的疾病,而另一个成员的健康状态却是正常的情况。
产生这些差异当然有可能与环境因素有关系,然而研究者们更加倾向于用表观遗传改变这一概念给于解释。
(3)表观遗传学研究的重要意义
在不断加强表观遗传学研究的基础上逐步增进表观遗传学的基础知识,不仅在理论上对全面理解细胞命运和类型的决定以及表型的维持,具有重要的意义,而且在实际应用方面,还有可能为某些遗传性疾病的治疗和新药的制备指明新的途径。
因此无怪乎有学者认为目前总体的趋势是,遗传学的研究正逐步地让给表观遗传学,它是分子遗传学发展的暂新阶段。
三、分子遗传学的主要研究内容:
分子遗传学或说是分子生物学,主要研究对象是基因,所以有时也称之为基因的分子生物学(MolecularBiologyofGene)它的主要研究领域包括如下几个方面:
(1)DNA和RNA的分子结构及其复制机理;
(2)基因及基因组的结构与功能;
(3)DNA的复制、转录与翻译;
(4)基因表达调控的分子机理;
(5)遗传与变异的分子机理;
(6)基因控制细胞发育分化的分子机理。
四、主要参考书
中文参考书:
1.闫隆飞、张玉麟主编,分子生物学(二版)1997年,中国农业大学出版社。
该书第一版于1993年出版。
2.朱玉贤、李毅、郑晓峰编,现代分子生物学(三版),2010年,高等教学出版社,该书于1997年出第一版。
3.孙乃恩、孙东旭编著,分子遗传学,1990年,南京大学出版社(听说己出第二版)。
4.张玉静主编,分子遗传学,2000年,科学出版社。
5.路铁刚、丁毅主编,分子遗传学,2008年,高等教学出版社。
英文参考书:
6.L.A.Allison,FundamentalMolecularBiology(2ndEdition),2012.JohnWiley&Sons,Inc.
7.R.F.Weaver,MolecularBiology(5thEdition),2012.TheMcGraW-HillCompanies,Inc.
(其第二版由刘进元等人译成中文,清华大学出版社出版2007年;第4版由郑用链等人译成中文,科学出版社出版,2010年)。
8.J.D.Watsonetal.,MolecularBiologyofGene(6thEdition),2008.CSHLPress。
(7thEdition),2014.
(已被杨焕民等人译成中文,由科学出版社出版,2009年)。
9.G.M.Malaci
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