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临床微生物实用手册
临床微生物实用手册
(内部资料)
试剂配制
1、革兰氏染液
①甲液:
结晶紫:
1.25g95%酒精:
50mlDH2O:
450ml
②乙液:
Na2CO3:
6.25gDH2O:
500ml
③碱性碘液:
I2:
6.0gKI:
12.0gNaOH(1mol/L):
270ml待KI完全溶于DH2O,后,再加I2
④丙酮酒精液:
95%酒精:
70ml丙酮:
30ml
⑤碱性复红水溶液:
碱性复红:
8g95%酒精:
100LDH2O:
900m
2、抗酸染液(萋-尼)
1.石炭酸复红染液:
(1)储存液
①碱性复红液:
碱性复红8g,加95%乙醇至100ml,充分振荡使复红溶解。
②5%石炭酸水溶液:
40~50℃水浴加热石炭酸使之融解,取液态石炭酸5g溶于90ml热蒸馏水中,待溶液冷却至室温时,补充蒸馏水至100ml。
(2)石炭酸复红工作液:
经定性滤纸过滤的碱性复红储存液10ml与5%石炭酸水溶液90ml充分振荡、混合均匀后,用定性滤纸过滤。
2.5%盐酸乙醇脱色液:
35%浓盐酸5ml与95%乙醇95ml混合。
3.亚甲蓝复染液:
(1)储存液:
亚甲蓝0.3g溶于95%乙醇50ml中,完全溶解后加蒸馏水至终体积100ml。
(2)亚甲蓝复染液:
以蒸馏水5倍稀释0.3%亚甲蓝储存液,经充分振荡、混合均匀后,亚甲蓝的终浓度为0.06%,使用定性滤纸过滤,即得亚甲蓝染液。
3、甲基红试剂
①甲基红:
0.2g②95%酒精:
300ml③DH2O:
200ml
配制:
将甲基红称入乳钵内,加1mol/LNaOH10ml左右(提高甲基红溶解度),碾磨,加入酒精300mlDH2O180ml,混匀后,再加入1mol/LHCL10ml左右,中和其中的NaOH,最后试剂弱带酸性
4、靛基质试剂
①对二甲氨基苯甲醛:
5.0g②纯戊醇或正丁醇:
75ml③浓盐酸:
25ml
配制:
浓盐酸要待对二甲氨基苯甲醛溶解于纯戊醇后,再一滴滴徐徐加入
5、伏-波(VP)试剂
甲液:
a萘酚:
6.0g无水乙醇:
100ml乙液:
KOH:
40g肌酸:
0..3gDH2O:
100ml
注:
甲液应储存于棕色瓶中
5、100g/L去氧胆酸钠溶液
①去氧胆酸钠:
5g②0.1mol/LNaOH:
5ml③溶解后加DH2O45ml
于冰箱可保存半月有效。
6、氧化酶,细胞色素氧化酶
①10g/L盐酸二甲基对苯二胺(或)四甲基对苯二胺)水溶液
②10g/La-萘酚乙醇液
7、硝酸盐还原试剂
①甲液:
对氨基苯磺酸:
0.8g5mol/L醋酸:
100ml
②乙液:
a-萘胺:
0.5g5mol/L醋酸:
100ml
8、6g/L酚红指示剂
酚红:
3g1mol/LNaOH:
10ml1mol/LHCL:
10mlDH2O:
480ml
配制:
将酚红放入乳钵内加NaOH研磨,加DH2O280ml,无水乙醇200ml混匀后,加入HCL混匀。
配好后液体应为透明橙红色。
染色
1、革兰氏染色法
试剂:
①结晶紫②碳酸钠溶液③碱性碘液④丙酮酸酒精
⑤碱性复红水溶液
方法:
1.将标本均匀涂布于洁净玻片上,自然干燥,火焰微热固定
2.滴加结晶紫(革兰甲液)和碳酸钠液(革兰乙液)各2滴,初染30秒钟,水洗。
3.用碱性碘液2滴固定30秒钟,水洗
4.用丙酮酸酒精脱色至无兰色脱落为止(约5-10秒),水洗。
5.用碱性复红水溶液复染5秒钟,水洗待干镜检。
结果:
革兰氏染色阴性细菌在视野下呈淡红色。
革兰氏阳性细菌呈深紫色
注意事项:
1.涂片应均匀,厚薄适宜,应自然干燥后再加微热固定。
以热而不烫手为易,过热易使细菌变形。
2.脱色要至无兰色脱落为止。
3.复染时间不可过长,以免细菌均染成G—菌。
4.枯草杆菌,链球菌有时染成紫红色,是因为细菌繁殖代谢中有紫色嗜变性,不一定全是染色原因,所以要根据其菌体形态加以确定。
2、抗酸杆菌染色
试剂:
①石碳酸复红溶液②盐酸酒精溶液③碱性美兰溶液
方法:
1.加满石碳酸复红溶液在已固定德标本玻片上,加温2-3分钟,使染液即有蒸汽上升又不致沸腾,不时添加染液,以免在受热情况下干凅。
2.倾出染液,以DH2O冲洗后用盐酸酒精溶液脱色,直至玻片无红色为止。
3.DH2O冲洗,用碱性美兰复染1分钟。
4.DH2O冲洗,待干镜检。
结果:
抗酸杆菌被染成红色,背景为兰色。
结核、麻风杆菌为抗酸阳性(奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性)
3、庞氏染色法
试剂:
庞氏染液
方法:
涂片经自然干燥后经火焰固定,滴加庞氏染液2滴,静染3-5分钟后,水洗,待干镜检。
结果:
双级体杆菌菌体呈淡兰色
两端级体呈深紫兰色
报告:
查见双级体杆菌或未查见白喉杆菌
4、墨汁染色查新型隐球菌
试剂:
优质印度墨汁
方法:
取一滴优质印度墨汁或国产优质墨汁于洁净载玻片上,加入待检标本(液体标本需离心后取沉淀)一滴,与之混合,加盖玻片于底倍镜下,将出光调暗,观察菌体及其周围荚膜。
阴性结果:
在高倍镜下可见黑色背景中透明宽厚的荚膜,似晕轮,有较厚的细胞膜,有时可见生芽的。
内有脂质颗粒析出。
注意:
要与白细胞区别。
白细胞无芽出现象、无荚膜、细胞壁薄、无脂质颗粒析出。
5、细菌细胞壁染色法
用途:
观察细菌细胞壁是否缺损
试剂:
甲液:
100g/L鞣酸水溶液乙液:
5g/L龙胆紫
方法:
用无菌生理盐水涂片,将细菌均匀涂布于玻片上,待其自然干燥后,滴加甲液固定15分钟,水洗,滴加乙液染色3分钟,水洗,自然干燥待检。
结果:
有细胞壁的细菌,周边染成紫色,内部无色,缺壁细菌染料可进入菌体,菌体被染成深紫色。
注意事项:
1.所用菌种必须是新分离所得菌
2.涂片需自然干燥,切勿在火焰上固定
6、鞭毛申云氏法(水法)
试剂:
①200g/L鞣酸②200g/L钾明矾③1:
12饱和石碳酸
④碱性复红酒精液
⑤应用液:
取1,2,3,4液个2ml,2ml,5ml,1.5ml混匀,用滤纸过滤后备用
方法:
1.“训练”菌种:
将菌种接种于软琼脂平皿中央(点种),37℃24h后取平板边缘扩散菌,再转软琼脂。
反复几次(视情况而定)。
2.取一洁净玻片,置于桌面,垫高一端,是与桌面呈15o角左右,用洁净滴管在玻片中央滴加一滴蒸馏水,用滴管顺玻片将液滴摸成卵圆形。
3.用接种环挑取一定量平板边缘菌,轻轻乳化于玻片高的一端的液滴边缘,让其自然往下流动5分钟左右。
4.轻轻将玻片放平,滴加与液滴同等量的应用,染色5分钟,用水沿一端(最好是从高的一端)轻轻冲洗,待干镜检。
结果:
菌体呈深紫红色
鞭毛呈淡紫红色
注意事项:
1.所用应用液必须新鲜配制,以配制后2-3天内使用为宜。
所用器皿,特别是玻片必须洁净。
2.所用代测菌应使用多次反复转种软琼脂后的新鲜菌种
3.方法中3项的时间要严格掌握,此步的原理是用蒸馏水:
这种低渗液渗入菌体内,使菌体,鞭毛都发生不同程度的膨胀,时间太长菌体易裂
正确选择需要鉴定的细菌
1、血培养:
主要病原菌:
沙门菌,布氏杆菌,其它革兰阴性杆菌,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌
以下菌应视为非致病菌(除非>1次血培养分离出):
芽孢杆菌属,凝固酶阴性葡萄球菌,草绿色链球菌,棒状革兰阳性杆菌
2、脑脊液培养:
主要病原菌:
B群β溶血链球菌(新生儿),流感嗜血杆菌(2月-2岁儿童),肺炎链球菌,脑膜炎奈瑟氏菌
3、咽部标本培养(上呼吸道标本):
主要病原菌:
A群β溶血链球菌
选择性报告:
溶血隐秘杆菌
咽炎中非致病菌:
金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,卡他莫拉菌,α溶血链球菌,所有革兰阴性杆菌,所有酵母菌
4、痰标本(下呼吸道标本)
主要病原菌:
肺炎链球菌,克雷伯菌属,流感嗜血杆菌,金黄色葡萄球菌,铜绿假单胞菌
非病原菌:
酵母菌,草绿色链球菌,凝固酶阴性葡萄球菌
5、尿培养
主要病原菌:
大肠埃希菌,变形杆菌,克雷伯菌,其它革兰阴性杆菌,肠球菌,腐生葡萄球菌,纯的金黄色葡萄球菌
6、生殖道标本培养:
主要病原菌:
淋病奈瑟菌,滴虫,酵母菌,女性细菌性阴道病综合征,孕妇携带的B群β溶血链球菌
非病原菌:
金黄色葡萄球菌,任何革兰阴性杆菌(包括大肠杆菌,变形杆菌),B群β溶血链球菌(仅为孕妇报告)
生殖道标本(女):
阴道高位拭子:
酵母菌,阴道毛滴虫,细菌性阴道感染
宫颈或宫颈内部:
淋病奈瑟菌,沙眼衣原体,人乳头瘤病毒
肛门或直肠拭子:
淋病奈瑟菌,B群链球菌(+阴道拭子)
7、脓,吸取物或组织标本:
主要病原菌:
金黄色葡萄球菌,化脓性链球菌,其它β溶血链球菌,铜绿假单胞菌,其它革兰阴性杆菌
非致病菌:
凝固酶阴性葡萄球菌,少量棒状革兰阳性杆菌
8、抽吸物组织标本的厌氧培养:
主要病原菌:
金黄色葡萄球菌,化脓性链球菌,其它β溶血链球菌,铜绿假单胞,其它革兰阴性杆菌,梭状芽孢杆菌,梭菌属,拟杆菌属,其它厌氧菌
非致病菌:
凝固酶阴性葡萄球菌,少量棒状革兰阳性杆菌
9、粪便培养:
主要病原菌:
沙门菌,志贺菌,弯曲杆菌,霍乱弧菌,副溶血弧菌,产毒性大肠杆菌,难辨梭菌(常规实验室检测不出)
常用的细菌鉴定
链球菌科(链球菌属和肠球菌属)的鉴定索引
GPC(椭圆,呈双、短链、长链)
触酶(-)
α溶血β溶血γ溶血
菌落、菌体特征胆汁七叶苷
胆汁溶菌试验杆菌肽CAMP七叶苷-+
optochin(5ug)S黄色素+草链D群
A链马尿酸钠胆汁七叶苷6.5%NaCl
S(溶菌,>15)R+
肺链胆汁七叶苷B链+-+-
--D群G链肠球菌属D链
草绿链球菌群D群
阿拉伯糖甘露醇山梨醇乳糖马尿酸钠
粪肠球菌-++++
屎肠球菌++-+-
鸟肠球菌-+++-
坚韧肠球菌---+-
微球菌科细菌的鉴定索引
GPC(圆形,呈葡萄、双、四联状)
+触酶-
微球菌科链球菌科
菌落、菌体特征
葡萄糖发酵
-+
四联球菌葡萄球菌属
玻片法血浆凝固酶
+-
金黄色葡萄球菌试管法血浆凝固酶
甘露醇发酵
+-
新生霉素(>16mmS)
尿素
麦芽糖发酵
表葡腐葡溶葡
新SRS
尿++-
麦+++
特殊细菌特点:
产单核李斯特菌:
主要存在于脑脊液和血中的病原菌
规则的革兰阳性杆菌,长短不一,β溶血但溶血环不超过菌落边缘,触酶阳性,26℃有动力,35℃无动力
芽孢杆菌属:
(主要病原菌:
炭疽芽胞杆菌)规则革兰阳性杆菌&芽孢(不着色)
可能炭疽芽胞杆菌:
生长迅速,不溶血,菌落粘在一起,无动力
伤寒沙门氏菌
标本采集:
未使用抗生素前提下
第一周分离阳性血液90%粪便10%
第三周分离阳性血液50%粪便85%尿25%
使用抗生素后:
骨髓,玫瑰疹
药物敏感性
超广谱-内酰胺酶(ESBLs):
克雷伯菌属,大肠艾希氏,
特点:
质粒编码,非边界耐药(青霉素类,头孢菌素,氨曲南);通常对抑制剂(棒酸、他巴唑、他唑巴坦)敏感。
治疗用药:
碳青酶烯、抑制剂复合类或头霉素
AmpC-内酰胺酶:
肠杆菌属,枸橼酸杆菌属,
特点:
染色体、质粒编码,诱导酶,非边界耐药(青霉素类,头孢菌素1,2,3代,头霉素)对抑制剂不敏感。
治疗用药:
碳青酶烯,头孢4代
抗生素:
青霉素类抗生素
天然青霉素:
青霉素G青霉素V
不产青霉素酶的G+球菌和G-球菌
耐青霉素酶青霉素:
苯唑西林氯唑西林
奈夫西林氟氯西林
产青霉素酶的G+菌和G-球菌
作用机制
青霉素类抗生素作用于细胞壁合成后阶段的酶
阻断肽聚糖合成的最后阶段—肽聚糖链的组装和三维结构的构建。
该阶段由下面几种酶催化完成:
转糖基酶、转肽酶、D-羧肽酶、内肽酶
不同β-内酰胺类抗生素在不同程度上有抑制上述酶的作用
头孢菌素类抗生素
第一代头孢菌素:
头孢噻吩、头孢唑啉等
对G+菌有较强作用
第二代头孢菌素:
头孢呋辛、头孢克洛等
对产β-内酰胺酶的G-杆菌有作用
第三代头孢菌素:
头孢噻肟、头孢他啶等
对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用
第四代头孢菌素:
头孢吡肟、头孢匹罗等
对肠杆菌科细菌和铜绿假单孢菌作用强
头孢菌素类抗生素和青霉素结合蛋白结合,抑制细菌细胞壁合成。
PBP位于质膜,不同的头孢菌素与不同的PBP结合,发生不同的效应,使菌形成丝状体或球体,最终溶解死亡。
其他β-内酰胺类抗生素
单环-内酰胺类抗生素:
氨曲南
对G-杆菌作用强
头霉素类:
头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑
对G+菌和产ESBLS有较好作用
氧头孢烯类:
拉氧头孢-氧头孢烯类衍生物
对产β-内酰胺酶的G-杆菌有较强的作用,对产酶的金葡菌也有一定作用
碳青霉烯类抗生素:
亚胺培南、美洛培南等
对G-杆菌(除嗜麦芽窄食单胞菌外)有很强的活性
β-内酰胺酶抑制剂-与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性
克拉维酸可从链霉菌培养液中分离得到
舒巴坦半合成的酶抑制剂
他唑巴坦半合成的酶抑制剂
青霉素+β-内酰胺酶抑制剂
氨基糖苷类抗生素
链霉素、卡那霉素、妥布霉素、核糖霉素、巴龙霉素、新霉素
庆大霉素、福提霉素
阿米卡星、奈替米星、地贝卡星
革兰阴性杆菌有强大的抗菌活性;革兰阴性球菌效果差;革兰阳性球菌有一定活性
大观霉素、丙大观霉素:
淋病奈瑟菌敏感,解脲脲原体敏感
氨基糖苷类抗生素和细菌核糖体30S小亚基发生不可逆的结合,抑制MRNA的转录和蛋白合成;造成遗传密码子的错读,产生无意义的蛋白质;吸附在菌体表面,造成细胞膜的损伤,导致膜的渗漏,胞内的K+、腺嘌呤等物质外漏。
喹诺酮类抗生素
第一代喹诺酮类抗生素:
奈啶酸等
大肠杆菌有作用
第二代喹诺酮类抗生素:
环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等
对G+菌和G-菌均有作用
第三代喹诺酮类抗生素(超广谱类抗生素):
左氧氟沙星、司帕沙星等
对G+菌(如MRS、PRSP、肠球菌)作用强于二代4-8倍
作用机制
作用于DNA旋转酶,干扰细菌DNA的修复和重组
大环内酯类抗生素
常用的有:
红霉素、麦迪霉素等
主要用于G+菌,对苛养菌及厌养菌有作用,对衣原体、支原体、立克次体、螺旋体等有抑制作用
新一代大环内酯类抗生素:
阿齐霉素、罗红霉素、克拉霉素、地红霉素等
较红霉素有更强的抗菌活性
作用机制
大环内酯类抗生素可逆结合在细菌核糖体50S大亚基的23S单位上,抑制肽酰基转移酶,影响核蛋白位移,抑制细菌蛋白合成和肽链的延伸。
四环素、氯霉素和林可酰胺类抗生素
四环素类抗生素广谱抗生素米诺环素多西环素等
四环素类抗生素主要与细菌30S核糖体亚单位结合,阻滞氨酰基转移RNA与信使RNA核蛋白体的受位位点的结合,阻滞肽链延伸,抑制蛋白质合成。
氯霉素类抗生素易进入脑组织氯霉素甲砜霉素
氯霉素主要作用于细菌70S核糖体的50S亚基,使肽链延长受阻而抑制蛋白质合成。
林可酰胺类抗生素盐酸林可霉素克林霉素G+球菌、白喉杆菌、破伤风梭菌、厌氧菌、沙眼衣原体
林可酰胺类抗生素与细菌50S核糖体亚基结合,抑制蛋白质合成,并可干扰肽酰基的转移,阻止肽链的延长。
糖肽类抗生素
万古霉素替考拉宁
对G+球菌有强大的活性
多粘菌素B和EG-菌强大的活性
糖肽类抗生素与一个或多个肽聚糖合成中间产物D-丙氨酰-D-丙氨酸末端形成复合物,可阻断肽聚糖合成中的转糖基酶、转肽基酶及D-D羧肽酶的作用
磺胺类药物及增效剂
用于全身感染,口服吸收好:
磺胺甲恶唑、磺胺嘧啶、磺胺甲氧吡嗪;
用于肠道,口服吸收差:
柳氮磺胺啶银、磺胺二甲氧嘧啶;
局部应用:
磺胺米隆、磺胺醋酰钠
作用机制
磺胺类药物分子结构中含有对氨基笨磺酰胺,能竟争性地与二氢叶酸合成酶结合,阻止氨基苯甲酸与二氢叶酸合成酶结合,使菌体内核酸合成重要物质辅酶F(四氢叶酸)钝化而导致细菌生长受到抑制。
甲氧苄胺嘧啶(TMP)能与二氢叶酸还原酶结合,抑制二氢叶酸还原酶,使二氢叶酸还原成四氢叶酸受阻而达到抑菌目的。
硝基呋喃类:
用于肠道、尿路感染和外用
呋喃坦啶、呋喃唑酮
干扰细菌体内的氧化还原酶系统,阻断细菌的代谢,产生抑杀细菌的作用
硝基咪唑类:
甲硝唑、替硝唑用于厌氧菌
硝基咪唑类药物被厌氧菌还原而阻断DNA合成,从而阻止DNA的转录复制,导致细菌死亡。
替硝唑可干扰DNA合成,并能穿透细胞膜,快速进入细胞内。
(不断更新完善中)
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