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FISH方式.docx
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FISH方式
FISH
一.玻片预处置:
玻片用热香皂水洗刷,用自来水冲洗12-15次,蒸馏水冲洗3次,在1%稀盐酸中浸泡24h,自来水洗净,蒸馏水冲洗3次,双蒸水冲洗3次,121℃灭菌20min(160℃烘箱4h以上),以去除玻片上可能有的核酸。
二.硅化处置:
将上述处置的清洁玻片置于70%乙醇中洗1min,丙酮浸泡1min,2%APES/丙酮液浸泡10s(APE-S氨丙基三乙氧基硅烷),丙酮浸泡10s,双蒸水冲洗3次,50℃烘1h。
三.载片的包被:
粘附剂:
称取明胶溶于125-200ml双蒸水中,加热搅拌助溶,待明胶完全溶解后(很重要),加入明矾,溶解后稀释至250ml。
包埋玻片:
明胶的温度维持在60℃左右,将预备好的玻片在粘附剂中上下浸蘸几下(浸蘸时务必整个玻片完全浸于液体中),分散开竖放在架子上,于空气自然干燥。
(用铝箔包好,幸免污染,4℃备用)
四.样品预处置:
1)样品超声2mins,8000r/min离心3min,弃上清液,用PBS[]将搜集到的微生物冲洗一次。
12000r/min离心5min去上清,悬于200μlPBS。
2)加入3倍体积4%多聚甲醛[](600μl)4℃下留宿。
12000r/min离心5min去固定剂重悬于200μlPBS;
(若样品需保留,可于-20℃条件下,贮存于50%乙醇/PBS溶液中,杂交实验前,用PBS清洗2次,离心搜集)
五.制片,杂交,观看
1)取10μl样品涂布于载玻片,自然干燥。
在玻片上加入200ul溶菌酶溶液(1mlPBS加20ul20mg/L溶菌酶储蓄液),加灭菌培育皿盖,幸免风干,室温10min,除去酶液
2)在玻片上加入200ul蛋白酶K(1mlPBS加20ul20mg/L蛋白酶K储蓄液),放入生化培育箱中,37℃,30min,除去酶液
3)别离用50%乙醇,80%乙醇,95%乙醇,100%乙醇各脱水3mins,风干备用
4)双蒸水溶解原探针,使浓度50ng/mL左右,取探针10μL,杂交液[]90μL混合(假设有三个探针,那么别离取10μL,杂交液为70μL),使最终探针浓度为5ng/mL的混合杂交液
5)取通过预处置的样品涂于载片,充分干燥后,加20μL混合杂交液(样品与混合杂交液体积比为10μL:
20μL)。
轻轻盖一片盖玻片
6)置杂交炉中80℃变性3min,46℃杂交2h,(杂交温度按探针Tm值与去离子甲酰胺浓度的不同计算)
7)杂交炉中掏出载玻片放入48℃的杂交洗脱液[]中,轻轻摇晃去掉盖玻片,轻摇10min,换洗脱液,再轻摇10min,再用相同温度的灭菌去离子水进行洗涤。
8)风干后,盖上盖玻片,封固,观看
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