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8护骨胶囊对去卵巢大鼠血清骨代谢指标的影响钟佳贤
护骨胶囊对去卵巢大鼠血清骨代谢指标的影响
钟佳贤1,林泽苗1,贾欢欢2,吴玉娥2,陈珺3,曹祺1,李青南2,3,*
(1.广东安诺药业股份有限公司,揭阳515300;2.广东省实验动物重点实验室,广东省实验动物监测所,广州510663;3.广东药科大学,生命科学与生物制药学院,广州510006)
[摘要]
目的:
观察去卵巢大鼠血清骨代谢指标的改变及护骨胶囊(HG)的调节作用。
材料方法:
采用去卵巢(OVX)模型,分假手术(Sham),去卵巢(OVX),仙灵骨葆(Pos)和护骨胶囊低、中、高剂量组(HG-L、HG-M和HG-H)。
术后2天连续灌胃给药3个月,取血清检测骨代谢指标。
结果:
①与Sham组比较,OVX组骨形成指标ALP、BALP、UcOC、PINP和骨吸收指标CTX均显著升高,但TRAP5a,TRAPb水平降低;OPG和OPG/RANKL比值显著降低。
②与OVX组比较,HG-L、H组进一步升高ALP,HG-H组也升高BALP,HG-L、HG-M组降低BALP;Pos组降低ALP和BALP水平。
HG和阳性药物给药组降低了UcOC和PINP水平,同时也降低CTX水平。
HG-L组的TRAP5a升高;HG-L、HG-M和Pos组使TRAP5b升高。
OPG在HG-H和Pos组增加;OPG/RANKL比值HG和阳性药物给药组均升高。
结论:
OVX使部分骨形成和骨吸收指标增加,表现为骨高转换,HG和仙灵骨葆都能降低这些指标。
由于HG能在OVX基础上进一步升高ALP,HG-H也升高BALP,而仙灵骨葆没有进一步提高ALP和BALP水平,提示护骨胶囊刺激成骨的作用较强。
[关键词]中医中药;护骨胶囊;骨质疏松;骨代谢指标
收稿日期:
作者简介:
钟佳贤(1992-),女,本科生,主要从事药物研究与推广,E-mail:
853749648@;*通讯作者:
李青南(1956-),女,教授,硕士生导师,主要从事骨质疏松模型及相关药效学研究,E-mail:
qingnanli@。
EffectsofHugucapsulesonbonemetabolicindicatorsinovariectomizedrats
ZHONGJia-xian1,LINZe-miao1,JIAHuan-huan2,WUYu-e2,CHENJun3,
CAOQi1,CAOKe-guang1,LIQing-nan2,3,*
(1.GuangdongAnnolPharmaceuticalCo.,Ltd,Jieyang515300,China;
2.GuangdongKeyLaboratoryofLaboratoryAnimals,GuangdongLaboratoryAnimalsMonitoringInstitute,Guangzhou510663,China;
3.SchoolofBiosciencesandBiopharmaceutics,GuangdongPharcemeuticalUniversity,Guangzhou510006,China)
[Abstract]
Objective:
TostudytheeffectoftheHugucapsulesonbonemetabolicindicatorsinovariectomizedrats.Method:
Ovariectomized(OVX)ratsweredividedintosixgroups,includingShamgroup,OVXgroup,Xianlinggubaogroup(positivecontrol)andHGlow,mediumandhighdosegroup(Sham,OVX,Pos,HG-L,HG-M,HG-H),eachgroupwith10rats.TheratswereigadministratedmedicinecontinuouslyforthreemonthstwodaysafterOVX.TheXianlinggubaoinPoscontrolgroupandnormalsalineinShamandOVXcontrolgroup,respectively.Aftertreatment,thebonemetabolicindicatorsinserumweredetected.Result:
①ALP,BALP,UcOC,PINPandCTXwereincreasedinOVXgroup,andthelevelsofOPGandTRAP5a,bandtheOPG/RANKLratioweredecreasedsignificantlycomparedwithShamgroup.②HG-L、Hgroupssignificantly increasedALPandBALPwasincreasedinHG-HanddecreasedinHG-LandHG-McomparedwithOVX,PosdecreasedALPandBALPlevels.LevelsofUcOC,PINPandCTXinHGandPoswerelowerthanthoseinOVX.ThelevelofTRAP5ainHG-LwashigherthanthatinOVXgroupwhileHG-HandPosweresignificantlylower.TRAP5bofHG-LandHG-MwereincreasedthanthatinOVXgroup.TheOPGlevelsofHG-HandPosandtheOPG/RANKLratiosallthemedicinegroupsweresignificantlyincreasedwhencomparedwithOVXgroup.Conclusion:
OVXcanincreasepartofbonemetabolicmarkersandshowedtoahighboneturnover,HGandXianlinggubaocanpartlyinhibithighboneturnover。
HG-L、HgroupsfurtherincreasedALPandBALPwhileXianlinggubaodidnotincreaseALPandBALPlevels,andforthisreason,indicatesthatstimulationeffectofboneformationinHGisstronger.
[Keywords]Traditionalchinesemedicine;Hugucapsules;Osteoporosis;Bonemetabolicindicators
前言
去卵巢大鼠能模拟人的原发性骨质疏松,其表现为骨高转换,而骨转换过程可以通过骨代谢指标反映出来,间接显示成骨细胞与破骨细胞的活性[1]。
随着骨质疏松症的流行病学、病理生理研究的不断深入,骨代谢指标检测也广泛的应用于临床骨质疏松的跟踪治疗及代谢性骨病的鉴别诊断中。
中药复方护骨胶囊已上市11年,上市前做了动物去卵巢实验和I、Ⅱ、Ⅲ期临床试验,均显示有较好的防治骨质疏松的作用。
并于2004年获得批文,开始临床应用。
目前对其处方的配伍、数理药效的分析,血清药理学对成骨细胞的影响都做了一定的研究[25-27],临床研究显示[28],护骨胶囊治疗后能明显改善原发性骨质疏松症中医辨证属于肾精亏虚、筋骨失养患者的腰脊部疼痛、胫膝酸软、步履艰难等主要临床症状及提高患者的骨密度,且治疗过程中未发现其对心、肝、肾功能及血液系统有明显的损害,临床应用安全。
但由于当年做动物实验的条件有限,动物实验做得相对简单,对于此药作用机理的研究不够深入,广东安诺药业股份有限公司为完善动物实验,全面的了解药物的药效机制,借助现代先进的仪器设备和方法,按照美国FDA骨质疏松新药临床前研究的标准设计动物实验。
采用双侧去卵巢大鼠模型,在整体动物水平研究中药护骨胶囊对去卵巢大鼠血清骨代谢指标的影响,完善护骨胶囊防治骨质疏松的作用机理,为临床更好的应用提供实验依据。
1.材料与方法
1.1动物模型与实验分组
3月龄SPF级雌性SD大鼠60只,体重(210±3)g,随机分为6组:
假手术组、去卵巢组、仙灵骨葆组(阳性对照组)和护骨胶囊低、中、高剂量组(Sham、OVX、Pos、HG-L、HG-M、HG-H),每组10只。
大鼠适应性喂养2w后,进行如下干预:
1.去卵巢造模:
假手术组在手术中不切除卵巢,仅摘除少量脂肪,其余各组均切除双侧卵巢。
2.药物干预(每日):
去卵巢手术2天后,Sham组与OVX组灌服生理盐水[10mL/(kg·d)],Pos组灌服等剂量的仙灵骨葆[0.270g/(kg·10mL·d)],HG-L、M和H组分别灌服等剂量的HG[0.243、0.486、0.972g/(kg·10mL·d)],HG-M为临床成人的等效剂量。
各组大鼠自由进食和饮水,每周称量并记录体重一次,按体重调整给药剂量,共计给药3个月。
药物干预结束时,心脏抽血处死大鼠,收集各只大鼠血液,所获血标本置于室温环境下放置4h,3000r/min,离心15min,吸取血清后静置放于冰盒中,每组混合成一管,采用0.22μm滤器除菌后分装,用1.5mLEP管分装并置于-80°C冰箱保存。
1.2实验药物
中药护骨胶囊组[由淫羊藿、巴戟天、制何首乌、杜仲、骨碎补、熟地黄、龟甲等组成,由广东安诺药业股份有限公司(原东莞万成制药有限公司)生产,批号:
20150101,规格:
0.45g];仙灵骨葆阳性药物组(由淫羊藿、续断、补骨脂、知母、丹参等组成,由贵州同济堂制药有限公司生产,批号:
20140701规格:
0.50g)
1.3血清骨代谢指标的检测
取每组血清标本2ml送至上海邦奕生物科技有限公司采用Elisa试剂盒检测血骨代谢指标12项:
骨形成指标:
碱性磷酸酶(ALP)和骨碱性磷酸酶(BALP)、骨钙素(OC)和羧化不全骨钙素(UcOC)、Ⅰ型前胶原羧基末端前肽(PICP)和Ⅰ型前胶原氨基末端前肽(PINP);骨吸收指标:
抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP5a和TRAP5b)、Ⅰ型胶原N末端肽(NTX)和Ⅰ型胶原C末端肽(CTX);另外还检测了骨保护素(OPG)与核因子NF-kB配体的受体激活剂(RANKL)。
1.4统计分析
应用SPSS16.0统计软件进行分析处理,所有数据以均数±标准差(x^-±s)表示,组间行方差齐性检验、单因素方差分析(one-wayANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1护骨胶囊对去卵巢大鼠血清骨形成指标的影响(见表1、图1)
表1、图1可见:
与Sham组比较,OVX组的ALP、BALP、UcOC和PINP水平均显著升高(P<0.01),OC、PICP水平有所降低,但无统计学差异(P>0.05);HG组与OVX组相比,ALP水平在HG-L和HG-H组显著升高(P<0.01),HG-M组略有降低,无统计学差异(P>0.05);BALP水平在HG-L、HG-M组显著降低(P<0.01),而HG-H组升高(P<0.01);Pos组与OVX组比,ALP和BALP水平均降低(前者P<0.05,后者P<0.01);而UcOC和PINP水平,HG组和Pos组与OVX组比均显著降低(P<0.01),HG-H组PINP水平降低无统计学差异(P>0.05)。
表1实验后各组大鼠血清骨形成指标的变化(x^-±s)
Table1Theeffectaftertheexperimentonserumboneformationindexsingroupsofrats(x^-±s)
组别Group
数量n
碱性磷酸酶ALP(U/L)
骨碱性磷酸酶BALP(U/L)
骨钙素OC(ng/L)
羧化不全骨钙素UcOC(pg/mL)
I型前胶原羧基端前肽PICP(ng/L)
I型前胶原氨基端前肽PINP(µg/L)
假手术组Sham
10
10.20±0.42
7.08±0.21
961.29±21.58
746.14±18.51
208.84±6.58
15.41±0.73
去卵巢组OVX
10
12.31±0.4454**
7.91±0.11**
949.63±33.22
1088.60±20.17**
199.47±7.96
17.21±0.44**
阳性药物组Pos
10
11.53±0.24**#
7.05±0.09##
881.48±5.63**##
925.86±27.90**##
267.71±15.05**##
15.65±0.42##
护骨低剂量组HG-L
10
13.62±0.44**##△△
6.80±0.23##
909.72±29.77*
769.28±32.06##△△
245.25±9.16**##△
14.18±0.45*##△△
护骨中剂量组HG-M
10
12.30±0.21**△□□
6.08±0.13**##△△□□
941.03±20.29△
854.12±16.25**##△△□□
224.76±9.28##△△□
14.40±0.45*##△
护骨高剂量组HG-H
10
13.21±0.14**##△△◇◇
7.93±0.19**##△△□□◇◇
847.10±22.20**##□□◇◇
932.80±14.14**##□□◇◇
210.80±8.90△△□□
16.57±0.43*△□□◇◇
注:
*,**P<0.05,0.01VSSham;#,##P<0.05VSOVX;△,△△P<0.05,0.01VSPos;
□,□□P<0.05,0.01VSHG-L;◇,◇◇P<0.05,0.01VSHG-M.
图1实验后各组大鼠相对OVX组有意义的血清骨形成指标变化柱形图
Fig.1ThechartsonchangesofserumboneformationindexesingroupsthathavestatisticalsignificanceofdifferencestoOVXgroupafterexperiment.*,**P<0.05,0.01VSSham;#,##P<0.05VSOVX;△,△△P<0.05,0.01VSPos;
□,□□P<0.05,0.01VSHG-L;◇,◇◇P<0.05,0.01VSHG-M.
2.2护骨胶囊对去卵巢大鼠血清骨吸收指标的影响(见表2、图2)
表2、图2可见:
与Sham组比较,OVX组的CTX水平升高(P<0.01),NTX的水平有所下降,但无统计学差异(P>0.05)。
与OVX组CTX水平比,HG和Pos组均显著降低(P<0.01);HG-L、HG-M组和HG-H组(54.13nmol/L、56.30nmol/L,后者61.84nmol/L),HG-H与Pos组结果相似。
与Sham组比较,OVX组TRAP5a和TRAP5b水平降低(P<0.01)。
与OVX组相比,HG-L组的TRAP5a水平升高(P<0.01),而HG-H组的TRAP5a水平明显降低(P<0.05),HG-M组介于中间,无统计学差异(P>0.05),与Pos组相似。
TRAP5b水平,HG-L和HG-M组高于OVX组,有显著性差异(P<0.01),Pos和HG-H组都下降至接近OVX组(前者P<0.01,后者P>0.05)。
2.3护骨胶囊对去卵巢大鼠血清骨代谢指标OPG和OPG/RANKL比值的影响(见表2、图2)
表2、图2可见:
与Sham组相比较,OVX组的RANKL水平有所下降,但无统计学差异(P>0.05);与OVX组比,RANKL水平在HG低、中剂量组有统计学差异的下降(P<0.01),但HG-H组则增加(P<0.05),Pos组与OVX组比无统计学意义的变化(P>0.05)。
OPG为RANKL的拮抗剂,OVX组与Sham组比下降(P<0.01),与OVX组比,只有HG-H组和Pos组有统计学意义的增加(P<0.01)。
OPG/RANKL比值,OVX组显著降低(P<0.01),HG和Pos组都增加(P<0.01),HG-M组增加无统计学差异(P>0.05)。
表2实验后各组大鼠血清骨吸收指标和OPG水平、OPG/RANKL比值的变化(x^-±s)
Table2Theeffectaftertheexperimentonserumboneabsorption
indexs,OPGlevelsandOPG/RANKLratiosingroupsofrats(x^-±s)
组别Group
数量n
抗酒石酸酸性磷酸酶5aTRAP5a(U/L)
抗酒石酸酸性磷酸酶5bTRAP5b(U/L)
Ⅰ型胶原N末端肽NTX(nmol/L)
Ⅰ型胶原C端肽CTX(nmol/L)
骨保护素OPG(ng/L)
核因子kb受体活化因子配体RANKL(pg/mL)
骨保护素/核因子kb受体活化因子配体OPG/RANKL
假手术组Sham
10
10.16±0.30
5.97±0.23
17.55±0.53
63.92±2.66
1343.28±33.30
36.68±1.38
36.67±2.07
去卵巢组
OVX
10
9.23±0.24**
4.43±0.12**
16.77±0.41
69.46±3.06**
1129.24±44.71**
34.67±1.25
32.57±0.17**
阳性药物组Pos
10
9.00±0.36**
5.35±0.07**##
18.06±0.48#
61.34±1.00##
1339.45±30.65##
36.43±0.67
36.77±0.28##
护骨低剂量组HG-L
10
11.11±0.19**##△△
6.08±0.19##△△
16.60±0.88△
54.13±2.00**##△△
1143.05±28.13**△△
29.82±1.10**##△△
38.37±1.91##
护骨中剂量组HG-M
10
9.60±0.20*△□□
5.75±0.30##△
19.75±0.53**##△△□□
56.30±1.58**##△
1126.94±11.59**△△
32.11±1.58**#△△□
35.16±1.96□
护骨高剂量组HG-H
10
8.70±0.15**#□□◇◇
4.66±0.12**△△□□◇◇
19.60±0.92**##△□□
61.84±1.31##□□◇◇
1350.96±18.61##□□◇◇
37.10±0.78#□□◇◇
36.44±1.20##
注:
*,**P<0.05,0.01VSSham;#,##P<0.05VSOVX;△,△△P<0.05,0.01VSPos;
□,□□P<0.05,0.01VSHG-L;◇,◇◇P<0.05,0.01VSHG-M.
图2实验后各组大鼠相对OVX组有意义的血清骨吸收指标变化柱形图
Fig.2ThechartsonchangesofserumboneresorptionindexesingroupsthathavestatisticalsignificanceofdifferencestoOVXgroupafterexperiment.*,**P<0.05,0.01VSSham;#,##P<0.05VSOVX;△,△△P<0.05,0.01VSPos;□,□□P<0.05,0.01VSHG-L;◇,◇◇P<0.05,0.01VSHG-M.
3.讨论
3.1切除双侧卵巢建立绝经后骨质疏松症大鼠模型已成为公认的标准化的绝经后骨质疏松经典模型[3]。
此模型的病理变化与妇女绝经后骨质疏松有许多相似之处,其中包括具备骨吸收与骨形成均异常增加的“高转换型”骨质疏松的特征[17]。
本实验中,大鼠卵巢摘除3个月后,部分反映骨形成的指标如ALP、BALP、UcOC和PINP及反映骨吸收的指标如CTX的含量均显著升高(P<0.01),表明去卵巢后骨形成与骨吸收部分指标增加,但TRAP5a和TRAP5b水平较假手术组降低,这与方玲娜、戴如春等[11]采用70只7月龄SD雌性大鼠OVX3w、15w后TRAP5b水平降低的结果文献相似。
3.2骨形成指标分析
ALP和BALP是最常用的评价骨形成和骨转换的指标[18],故成为反映成骨细胞活性的特异及敏感指标,成骨细胞活性增强,则ALP和BALP分泌增加[1]。
OC和UcOC也是评价骨形成和骨转换率的特异性指标[16]。
PICP、PINP是骨形成的特异和敏感指标[1,2,8,18]。
本实验中,ALP水平,HG组在去卵巢升高的基础上,更进一步的升高,而仙灵骨葆组降低。
HG的结果与中药骨疏灵对OVX大鼠骨代谢的影响的结果一致[15],以及与中药增骨丸对OVX所致骨质疏松大鼠血、尿生化的结果相似[19],也在OVX升高ALP的基础上更进一步增加。
而高剂量的HG的BALP水平在OVX基础上显著升高。
究其原因,可能为这几个中药复方中都含有淫羊藿、骨碎补等成分,具有成骨刺激作用所致。
现代医学发现淫羊藿、骨碎补等补肾中药具有植物异黄酮抗骨质疏松活性,具有骨细胞双向调节作用及雌激素样作用[4,12],且已有大量研究表明黄酮类化合物对成骨有明显促进作用[7];BALP水平在低、中剂量的HG组降低,仙灵骨葆组也降低,上述结果显示HG能降低OVX所致的BALP水平的升高,但HG对BALP有剂量依赖。
HG能降低OVX所致的UcOC和PINP水平的增加,与仙灵骨葆一致,本文结果与卢建华等[20]、刘菊等[21]、张瑶和刘菊等[22]的补肾方降低骨形成指标如PINP水平的结果一致。
3.2骨吸收指标分析
NTX和CTX是目前国际公认的代表骨吸收的生化指标[16]。
本实验中,大鼠去卵巢后CTX水平显著升高,HG和仙灵骨葆给药组均能显著降低CTX水平,提示护骨胶囊和仙灵骨葆均能降低OVX所致的CTX的增加,可能具有降低骨吸收的作用。
本实验的结果与倪天庆[14]关于仙珠胶囊对OVX大鼠血生化指标的影响的研究结果一致。
TRACP是骨吸收的重要指标[3],主要由破骨细胞释放,因而血清中的TRACP水平反映破骨细胞活性和骨吸收的状态,TRACP分成5a和5b两个亚型[6,23]。
本实验中,OVX组TRAP5a和TRAP5b水平较假手术组明显降低,此结果与崔省珍等[10]和李宝芬等[5]将大鼠OVX14w后,TRAP5a和TRAP5b水平均升高的结果不一致。
但与方玲娜、戴如春等[
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