生物工程论文 白背三七叶组织培养研究.docx
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生物工程论文白背三七叶组织培养研究
中国网络大学
ChineseNetworkUniversity
本科毕业设计(论文)
白背三七叶组织培养研究
院系名称:
网络学院
专业:
生物工程
学生姓名:
学号:
123456789
指导老师:
中国网络大学教务处制
2018年03月22日
目录
摘要2
Abstract3
综述4
前言5
1.材料与方法6
1.1实验器材6
1.2实验方法6
2.结果与分析9
2.1实验结果9
2.2结果分析11
参考文献12
致谢13
附图14
白背三七叶组织培养研究
摘要
以白背三七叶为外植体诱导愈伤组织并增殖、诱导芽分化,通过不同浓度的激素配比,建立白背三七组织培养体系。
结果表明,白背三七叶最佳的愈伤组织诱导培养基是MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,最佳的增殖培养基是MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,最佳的芽诱导培养基是MS培养基+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA。
关键词:
白背三七;叶;愈伤组织;芽分化
StudyontissuecultureofGynuradivaricatawithleaf
ABSTRAT
TheleafofGynuradivaricatawasusedasexplanttoestablishitstissueculturesystem.Thecallusinductionandproliferationaswellasbuddifferentiationwasstudied,throughtheratioofdifferentconcentrationsofhormone.TheresultsshowedthatthebestcallusinductionmediumforleafofGynuradivaricataisMSculturemedium+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,thebestproliferationmediumisMSculturemedium+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA,andthebestbudinductionmediumisMSculturemedium+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA.
KeyWords:
Gynuradivaricata;leaf;tissueculture
综述
白背三七[Gynuradivaricata(L)Dc]别名白子草、富贵菜、白子菜、鸡毛菜、大肥牛、又花土三七、菊三七、白背菜等,中药名为白背土三七,为菊科三七草属多年生宿根草本植物。
国内外医学专家研究结果表明,白背三七是一种神奇的保健蔬菜,其根、茎、叶均可人药。
根味甘、凉,主治支气管炎、肺结核、崩漏、痈肿、烫伤、跌打损伤等;其茎、叶性味咸、微辛、寒、有毒,具有清热、舒筋、止血、驱痰的功效。
其茎叶中含有大量的藻胶素、甘露醇、维生素B、磷、钾及多种氨基酸等营养元素,因而具有极强的降血压,降血脂,抑制糖尿病的功效.室内摆放还能起到杀菌净化空气的效果。
白背三七既是药品,又是食品,是极具开发潜力的资源之一。
日益受到人们的关注。
随着人们对白背三七药用价值和食用价值认识的提高,对其采摘数量逐年增加,但其普通扦插繁殖长势缓慢和数量有限,难以满足迅速培育优良种苗的要求。
通过组织培养技术,可以提高各种观赏和药用植物的繁殖速度,满足对种苗的需求。
前言
目前,白背三七叶组织培养研究较少,郭紫娟选用的是带芽嫩叶及茎段;冯李选用的是幼苗;黄余磊研究的是不同外植体对愈伤组织和不定芽诱导的影响,没有研究外植体诱导愈伤组织的最佳培养基;朱小虎以叶为外植体发现叶片多褐化。
本文拟以白背三七叶为外植体建立其组织培养体系,并筛选愈伤组织增殖培养基,为研究愈伤组织中有效成分的含量提供基础。
1.材料与方法
1.1实验器材
1.1.1材料:
白背三七盆栽苗。
1.1.2试剂:
无水酒精,0.1%升汞,营养液,蔗糖,琼脂,硝酸钾,硝酸铵,硫酸镁,氯化钙,碘化钾,硼酸,硫酸镁,硫酸锌,钼酸钠,硫酸铜,氯化钴,乙二胺四乙酸二钠,硫酸亚铁,6-BA,NAA。
1.1.3耗材:
锥形瓶,镊子,小刀,平皿(装滤纸),报纸,烧杯,试剂瓶,玻璃棒,标签纸,灭菌锅等。
1.2实验方法
1.2.1MS培养基的配制
配制1L培养基依次加入50mL20×大量元素、1mL1000×微量元素、10mL100×铁盐、10mL100×有机成分、30g3﹪蔗糖、0.75﹪琼脂和相应激素。
1.2.2白背三七组织培养
1.2.2.1材料的准备
挑选健康幼嫩的当年生叶,先用大量的自来水冲洗,然后用无菌水冲洗3次。
在超净工作台上分离白背三七叶,将分离的材料置于烧杯中。
然后用75%的酒精消毒10s,随后立即用无菌水冲洗两次,再用0.1%的升汞浸泡5-10min,期间用无菌镊子轻轻搅动数次,以达到赶走气泡和充分灭菌的目的。
用无菌水冲洗3-5次以除去残余的升汞,置于无菌滤纸上晾干。
1.2.2.2材料的接种
将消毒好的叶片切成0.6×0.6cm的小块,置于无菌滤纸上吸干水分,然后转接到愈伤组织诱导培养基上(见表1),每个处理3瓶,每瓶接种4个外植体。
其中,基本培养基为MS+3.0%蔗糖+0.75%琼脂,pH5.8-6.0。
1.2.2.3培养条件
于(24土2)℃的培养室中培养,光照强度1800—2000Ix,14h光照培养。
每周观察一次并详细记录叶片变化情况。
表1白背三七叶愈伤组织诱导培养基
编号
6-BAmg/L
NAAmg/L
A1
0.5
0.1
A2
0.5
0.3
A3
0.5
0.5
A4
1.0
0.1
A5
1.0
0.3
A6
1.0
0.5
1.2.3愈伤组织的增殖
将生长出少量愈伤组织的材料转接到增殖培养基中(表2)进行增殖培养。
每个处理4瓶,每瓶接种3个外植体。
其中,基本培养基为MS+3.0%蔗糖+0.75%琼脂,pH5.8-6.0。
培养物于(24土2)℃,光照强度1800—2000Ix,14h光照培养。
表2白背三七愈伤组织增殖培养基
编号
6-BAmg/L
NAAmg/L
A1
0.5
0.1
A2
0.5
0.3
A3
0.5
0.5
A4
1.0
0.1
A5
1.0
0.3
A6
1.0
0.5
1.2.4不定芽的诱导
将长势最好的愈伤组织在超净工作台上转接到诱导芽分化的培养基中(表3)。
每个处理3瓶,每瓶接种2个外植体。
其中,基本培养基为MS+3.0%蔗糖+0.75%琼脂,pH5.8-6.0。
鉴于愈伤组织增殖时6-BA浓度为0.5mg/mL时生长最好,以6-BA浓度0.5mg/mL为参照设置芽分化培养基。
培养物于(24土2)℃,光照强度1800—2000Ix,14h光照培养。
表3白背三七不定芽的诱导培养基
编号
6-BAmg/L
NAAmg/L
C1
0.5
0.1
C2
0.5
0.3
C3
0.5
0.5
C4
1.0
0.1
2结果与分析
2.1实验结果
2.1.1愈伤组织的诱导
外植体转接到愈伤组织诱导培养基一周后,外植体体积增大,有部分外植体出现卷曲,少量外植体四周出现白色冰晶状愈伤组织,其中A1培养基有6个没有卷曲,A2培养基3个,A3培养基1个,A4培养基3个,A5培养基2个,A6培养基1个,表明A1培养基开始愈伤化很慢。
外植体转接到愈伤组织诱导培养基二周后,大部分外植体卷曲,部分卷曲外植体从叶缘开始愈伤化形成绿色透明无定型状态的薄壁细胞,其中A1培养基有1个外植体形成愈伤组织,A2培养基3个,A3培养基2个,A4培养基1个,A5培养基1个,A6培养基无愈伤组织形成,表明A6培养基愈伤组织诱导启动较慢。
外植体转接到愈伤组织诱导培养基三周后,叶片卷曲如筒装,外植体逐渐愈伤化,且愈伤逐渐变大。
其中A1培养基有6个外植体形成愈伤组织,A2培养基6个,A3培养基8个,A4培养基1个,A5培养基6个,A6培养基10个,表明A4培养基不太适合愈伤组织诱导,A6培养基愈伤化效果挺好的。
外植体转接到愈伤组织诱导培养基四周后,外植体进一步愈伤化,少部分外植体从叶片开始褐化。
A1和A4褐化率高达44.4%、58.4%,可得出0.1mg/LNAA易引起褐化,或者激素配比比例不可相差太大。
愈伤组织的具体分化情况见表4和图1-3。
表4白背三七愈伤组织的诱导
序号
接种外植体数(个)
褐化外植体数(个)
褐化率
(100%)
产生愈伤组织外植体数(个)
诱导率(100%)
愈伤组织状态
A1
13
4
30.8
7
53.8
白色冰晶状,体积较小
A2
12
0
0
9
75.0
黄色带绿透明,体积较大
A3
13
1
7.7
11
84.6
黄色蓬松透明,体积相对很大
A4
12
7
58.3
3
25.0
较少愈伤,叶片湿润褐化
A5
12
4
33.3
10
83.3
黄色带绿透明,体积相对较小
A6
14
1
7.14
12
85.7
黄色带绿透明,体积一般
2.1.2愈伤的增殖
愈伤转接到新的增殖诱导培养基5天后,部分愈伤偏黄并有褐化趋势。
其中B1培养基有5个愈伤偏黄,B2培养基8个,B3培养基7个,B4培养基4个,B5培养基7个,B6培养基3个,表明B2、B3、B5培养基激素配比不太适合愈伤增殖。
愈伤转接到新的增殖诱导培养基10天后,部分叶片褐化,愈伤整体偏黄,有极少部分褐化。
其中B2培养基有愈伤冒绿点,有出芽趋势。
B1培养基愈伤褐化有4个,B2培养基2个,B3培养基2个,B4培养基0个,B5培养基2个,B6培养基0个;记录>1c㎡愈伤数中,B1培养基有1个,B2培养基7个,B3培养基5个,B4培养基0个,B5培养基2个,B6培养基7个,表明B6培养基激素配比最适合愈伤增殖。
具体结果见表5和图4-6。
表5白背三七愈伤组织增殖结果
序号
接种愈伤数(个)
愈伤褐化(个)
褐化率
(100%)
>1c㎡愈伤数(个)
增殖诱导率(100%)
愈伤组织状态
B1
5
4
80
1
20
水化偏黄,体积较小
B2
14
2
14.3
7
50
偏黄有点带褐化,体积较大
B3
15
2
13.3
5
33.3
黄色蓬松透明,体积相对很大
B4
8
0
0
0
0
大小没什么变化
B5
13
2
15.4
2
15.4
偏黄水化,体积相对较小
B6
15
0
0
7
46.7
黄色蓬松透明,体积相对很大
2.1.2不定芽的诱导
将增殖后的愈伤组织转入芽诱导培养基中三周后,一些愈伤组织上产生了不定芽,其中C2分化的芽数最多,且有3个芽长的很大,C4也形成了1个不定芽。
其他培养基上无不定芽产生,说明C2是不定芽诱导的最适培养基。
2.2结果分析
2.2.1愈伤组织的诱导
叶外植体形成愈伤组织的最适激素配比为A6(MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)其次为A3(MS培养基+0.5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA);A4(MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.1mg/LNAA)的激素配比不适宜愈伤生长,且容易引起叶片褐化。
外植体培养后期很多出现褐化情况,A1和A4褐化率高达44.4%、58.4%,可得出低浓度的NAA易引起褐化或激素配比不可相差太大。
2.1.2愈伤的增殖
根据愈伤增殖数目及大小,可得B6(MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA)是最适增殖培养基。
转接培养基后,愈伤组织整体有变黄、玻璃化趋势,由于叶片褐化严重,导致愈伤组织基本也褐化。
由B2出现芽点推测愈伤组织分化时有过度水化现象。
褐化的原因可能是随着培养时间延长,培养基的pH和营养物质发生变化,也有可能是培养基激素浓度不适合。
2.1.3不定芽的诱导
C2(MS培养基+0.5mg/L6-BA+0.3mg/LNAA)的激素配比适合不定芽分化,出芽时间为转接分化培养基15天后。
参考文献
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12.朱小虎,马兰菊,神仙草组织培养快繁技术的研究[J].中国林副特产,2010(5):
108
致谢
四年的读书生活在这个季节即将划上一个句号,而于我的人生却只是一个逗号,我将面对又一次征程的开始。
四年的求学生涯在师长、亲友的大力支持下,走得辛苦却也收获满囊,在论文即将付梓之际,思绪万千,心情久久不能平静。
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授人以鱼不如授人以渔,置身其间,耳濡目染,潜移默化,使我不仅接受了全新的思想观念,树立了宏伟的学术目标,领会了基本的思考方式,从论文题目的选定到论文写作的指导,以及论文最终的定稿,都是经由您悉心的点拨,再经思考后的领悟,常常让我有“山重水复疑无路,柳暗花明又一村”的感觉。
感谢生科院所有的老师,感谢郜金荣,杨艺华,雷湘,吴业颖,张国彬老师,没有你们悉心的教育和指导,也不会有我扎实的专业知识和清晰正确的前行方向。
感谢和我一起做实验的邢平同学,因为你的帮助和共同讨论,这篇论文才最终得以成行。
感谢大学四年的同学,我们一起经历的大学四年将是我丰富人生重重一抹风采。
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