Y2H操作方法HXY整理.docx

Y2H操作方法HXY整理.docx

《Y2H操作方法HXY整理.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Y2H操作方法HXY整理.docx（12页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

Y2H操作方法HXY整理

实验步骤说明**：

¡1.诱饵质粒pGBKT7-bait的构建

¡2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测【重要的前期准备】

¡3.人胰腺cDNA文库的滴定和扩增【不用做了，直接用质粒】

¡4.转化AH109酵母后转化子（阳性克隆）的筛选【顺序转化或共转化】

¡5.蛋白质相互作用的验证【一对一验证】

**

2.诱饵融合蛋白BD-bait对AH109酵母的自激活作用及毒性的检测

2.1LacZ自激活的检测.

2.2HIS3自激活的检测

2.3融合蛋白对酵母菌的毒性检测

4.文库转化AH109酵母后转化子的筛选

¡4.1文库质粒转化pGBKT7-bait/AH109酵母

l使用标准的PEG/LiAc转化法将文库质粒转化入已含有pGBKT7-bait质粒的AH109酵母，涂布在SD-Ade-His-Leu-Trp平板上进行重组子筛选

¡4.2报告基因ADE2、HIS3和lacZ激活的验证

lADE2、HIS3的激活：

酵母能够在SD-Ade-His-Leu-Trp平板生长

lLacZ的激活：

β-半乳糖苷酶显色反应呈蓝色

¡4.3pACT2-cDNA质粒的获取：

l①从酵母中抽提质粒，得到pGBKT7-bait和pACT2-cDNA的混合物

l②转化E.coli，涂布在含Amp的LB平板上，由于质粒不相容性，转化子中便只含有pACT2-cDNA质粒

l③从转化成功的E.coli中抽提出pACT2-cDNA质粒

5.蛋白质相互作用的验证【一对一验证】

5.1由于酵母双杂交的假阳性很普遍，所以筛选得到相互作用蛋白的cDNA序列之后，还应将分离出的各种pACT2-cDNA再次单独转化pGBKT7-bait/AH109酵母，即一对一验证，再次检测它们对报告基因的激活情况，排除假阳性

5.2将pACT2-cDNA质粒送测序，得到cDNA片段的序列，在NCBI数据库Blast查出其对应的蛋白质

5.3另外，还必须分析这些pACT2-cDNA质粒的构建情况。

由于商品文库构建的特殊性，要特别关注这些插入的cDNA片段是否发生了frameshift

5.4在上述验证都通过的情况下，仍然需要用诸如免疫共沉淀、GST-pulldown、细胞共定位等实验来对这些相互作用来进行验证

具体的操作步骤请仔细参看clontech公司的这三个操作手册：

相关质粒载体【更多详细信息见质粒图谱】

酵母双杂交系统3的质粒信息

Fusion

表位

酵母筛选标记

细菌筛选标记

Cloningvectors

pGBKT7

DNA/bait

c-Myc

TRP1

kanamycin

Controlvectors

pCL1

GAL4

LEU2

ampicillin

图2.3pGBKT7的限制性酶切图谱

pGBKT7的多克隆位点图谱

pCL1质粒图谱

另外附上：

文库质粒的载体pACT2和AD-prey构建的载体pGADT7的信息：

实验所用菌株基因型及其用途

菌株

基因型

用途

EcoliDH5α

F-ф80dlacZ△M15recAlendAlgurA96thi-1hsdR17（rk-mk+）supE44relA1deoR

△（lacZYA-argF）U169

用于质粒的扩增与转化

AH109

MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4,gal80LYS2:

:

GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,

GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,

URA3:

:

MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ

用于酵母双杂交中的诱饵融合蛋白的宿主菌及酵母双杂交筛选

AH109酵母菌的报告基因：

AH109酵母菌的表型：

培养液和固体培养基

●大肠杆菌培养基及相关试剂

LB培养基：

蛋白胨

10g

酵母提取物

5g

氯化钠

10g

加蒸馏水至1000mL，调整pH到7.0，高温高压灭菌。

固体LB培养基：

在液体LB培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5-2.0％。

配制抗生素培养基时，氨苄青霉素的最终浓度为60μg/mL，卡那霉素的最终浓度为50μg/mL。

●酵母培养基及相关试剂【注意：

含有葡萄糖，灭菌时间不要超过20min，一般15min，过长时间导致碳化变黑】

无氨基酸酵母氮源（YNB）为Difco产品；L-ArginineHCl、L-HistidineHClmonohydrate、L-LysineHCl、L-Uracill购自Sigma；腺嘌呤半硫酸盐（Adeninehemisulfatesalt）购自Amresco；其它各种氨基酸均为国产分析纯。

YPD培养液：

蛋白胨20g

酵母提取物10g

葡萄糖20g

加水至1000mL，调pH5.8，高温高压灭菌。

YPDA培养液：

在1LYPD培养基中加入15ml0.2％腺嘌呤半硫酸盐至终浓度为0.003％，调pH5.8，灭菌

0.2%腺嘌呤半硫酸盐配方：

0.4387gAdeminSulfate溶于200mlddH2O过滤灭菌，4℃保存

固体YPDA培养基：

YPDA培养液中加入琼脂粉至浓度为2.0％。

10×省却成分培养基（简称10×DO培养基）：

按照下表的配方分别配制：

一缺10×DO：

10×DO/-Trp，10×DO/-Leu

二缺10×DO：

10×DO/-Trp/-His，10×DO/-Leu/-Trp

三缺10×DO：

10×DO/-Trp/-Leu/-His

四缺10×DO：

10×DO/-Trp/-Leu/-His/-Ade

各种氨基酸在10×DO溶液中的浓度（按需要省去部分氨基酸）

氨基酸

10×浓度

L-Adeninehemisulfatesalt

200mg/L

L-ArginineHCl

200mg/L

L-HistidineHClmonohydrate

200mg/L

L-Isoleucine

300mg/L

L-Leucine

1000mg/L

L-LysineHCl

300mg/L

L-Methionine

200mg/L

L-Phenylalanine

500mg/L

L-Threonine

2000mg/L

L-Tryptophan

200mg/L

L-Tyrosine

300mg/L

L-Uracil

200mg/L

L-Valine

1500mg/L

完全极限培养基（亦称缺陷型培养基、选择性压力培养基）：

YNB6.7g

10×DO100ML

Glucose20g

加水至1000mL，

调pH5.8，灭菌。

固体培养基：

上述液体培养基加入琼脂粉至浓度2%。

酵母转化试剂【化学法转化】

10×TE缓冲液：

0.1MTris-HCl，10mMEDTA（pH7.5），高压灭菌。

50%（w/v）PEG3350：

PEG335050g,用灭菌的去离子水溶解，至体积达100mL。

10×LiAc：

1.0MLiAc，用稀释的醋酸调至pH7.5，高压灭菌。

PEG/LiAc溶液（现用现配）：

4/5体积的50%PEG3350,1/10体积的10×TE缓冲液和1/10体积的10×LiAc混匀，备用。

1×TE/1×LiAc溶液（现用现配）：

1/10体积的10×TE缓冲液，1/10体积的10×LiAc，4/5体积的灭菌的去离子水，混匀，备用。

担体DNA10mg/ml：

0.5g鲱鱼精DNA溶于50mlTE中，磁力搅拌3h，分装于1.5mlEP管，-20℃保存。

用时超声或沸水浴10min

β-半乳糖苷酶滤纸显色分析试剂

X-gal储备液：

X-gal溶于二甲基甲酰胺中，浓度20mg/mL，-20℃避光保存。

ZBuffer：

Na2HPO4·7H2O

16.1g/L

NaH2PO4·H2O

5.50g/L

KCl

0.75g/L

MgSO4·7H2O

0.246g/L

调pH值至7.0，高压灭菌。

ZBuffer/X-β-gal混合液（现用现配）：

Z缓冲液

100mL

β-巯基乙醇

0.27mL

X-gal储备液

1.67mL

感受态酵母菌的制备

①将酵母菌AH109菌株划线接种于YPDA平板上，30℃培养3-5d后，平板上长出白色或粉红色克隆；

②以灭菌的牙签挑取1个直径在2-3mm的克隆接种于装有1mLYPDA液体培养基的Eppendorf管中（若克隆直径小于2mm，应挑取数个克隆），剧烈震荡5min以打散菌团；

③将之转入含50mLYPDA培养基的三角瓶中，于30℃250rpm摇动培养16-18h，至酵母菌繁殖的稳定期（OD600>1.5）；

④取30mL上述过夜培养物转入含300mLYPDA的三角瓶中，检查稀释培养物的OD600值，若必要，加入更多的过夜培养物直至OD600=0.2-0.3；

⑤于30℃230rpm继续摇培养3h，此时OD600应为0.4-0.6；

⑥收集培养菌液于50mL离心管中，1000×g，室温离心5min，弃上清；

⑦以25-50mL灭菌TE或蒸馏水重悬细菌沉淀，1000×g，室温离心5min，弃上清；

⑧用1.5mL新鲜制备的、灭菌的1×TE/1×LiAc重悬沉淀，即为感受态酵母菌。

质粒转化酵母

转化实验分组

组别质粒

培养基

预期LacZ表型

阳性对照pCLl

SD/-Leu

蓝色

阴性对照pGBKT7

SD/-Trp

白色

实验组pGBKT7-bait

SD/-Trp

白色

10.1μg诱饵质粒pGBKT7-bait、阴性对照质粒pGBKT7和阳性对照质粒pCLl分别与0.1mg鲱鱼精DNA于一新的1.5mL离心管中，混匀；

②加入100μL酵母感受态细胞，震摇充分混匀；

③加入600μL无菌的PEG/LiAc溶液，高速震摇以混匀；

④30℃200rpm摇动30min；

⑤加入70μLDMSO，轻轻颠倒混匀，切勿震摇；

⑥42℃水浴中热激（热休克）15min，冰浴1-2min；

⑦室温14000rpm离心5sec，移去上清，以500μL无菌的1×TE缓冲液重悬细胞；

⑧取100μL涂布于相应的营养缺陷平板上，平放几分钟，至液体渗入琼脂中为止；

⑨于30℃倒置培养，进行营养缺陷型筛选，直至克隆出现，一般需要2-4天。

β-半乳糖苷酶滤膜分析

①用新鲜（如30℃生长2-4d）的，直径在1-3mm的酵母克隆进行β-半乳糖苷酶分析；

②加入2-2.5mL新鲜配制的ZBuffer/X-gal溶液到干净的100mm的培养皿中；

③将一张直径大小合适的滤纸放入上述盛有ZBuffer/X-gal混合液的培养皿中浸湿；

④用镊子将一灭菌的干滤纸覆盖于培养基的表面，与克隆紧密接触。

轻轻用镊子摩擦滤纸尽量使克隆粘至滤纸上；

⑤用针头经滤纸刺3个或更多不对称的洞至琼脂以定位；

⑥用镊子小心地将滤纸揭起。

将滤纸的克隆面朝上浸入液氮中15-30sec，使克隆固化于滤纸上；

⑦将滤纸移出液氮，在室温下融解约5min（冻/融处理可快速、有效地裂解细胞）；

⑧小心将滤纸（克隆面朝上）放在培养皿中预浸湿的滤纸上，滤纸下面及二层滤纸间避免气泡；

⑨30℃孵育滤纸并定时观察蓝色克隆出现的时间（<8h）