饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究.docx
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饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
植酸酶是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)的一类酶的总称,属磷酸单酯水解酶。
植酸酶具有特殊的空间结构,能够依次分离植酸分子中的磷,将植酸(盐)降解为肌醇和无机磷,同时释放出与植酸(盐)结合的其它营养物质。
由于植酸酶可将底物植酸钠水解,生成正磷酸和肌醇衍生物,并在酸性溶液中与钒钼酸铵生成黄色的复合物,因此,在波长415nm下进行比色,可测定植酸酶活性。
目前已形成国标GB/T18634—2009《饲用植酸酶活性的测定分光光度法》。
但是,饲料中植酸酶活性的测定却存在以下问题:
①由于植酸酶在饲料中的添加量较低,现有方法不能将饲料中的植酸酶完全浸提出来;②饲料中存在大量物质可在酸性条件下与钒钼酸铵发生显色反应,干扰415nm波长下的比色反应,从而影响酶活测定。
本实验旨在研究现有饲料中植酸酶测定方法的优势与缺陷,并寻找有效的检测途径。
1材料与方法
1.1主要试剂与仪器
1.1.1仪器
分析天平;恒温水浴锅;分光光度计;磁力搅拌
器;涡流式混合器;酸度计;离心机:
转速为
4000r/min
以上;超声波溶解器;回旋式振荡器;透析袋(截留分
子量1万、10万和30~100万);超滤离心柱(YM-30,
密理博公司生产)。
1.1.2试剂
植酸酶:
市售商品,酶活5000U/g,酶活定义参
照
GB-T18634—2009。
饲料:
市售商品蛋鸡料,原配方中不含植酸酶。
磷酸二氢钾(
KH
2
PO
4
)基准物
。
乙酸缓冲液(
1),c(CH
3
COONa)=0.25mol/l:
称取
20.52g无水乙酸钠于1000ml烧杯中,加入900ml
水搅拌溶解,用冰乙酸调节
pH值至(5.50±0.01),再转
移至1000ml容量瓶中,并用蒸馏水定容至刻度;室
温下存放2个月内有效。
乙酸缓冲液
(2),c(CH
3
COONa)=0.25mol/l:
称取
20.52g无水乙酸钠,0.5g曲拉通X-100(TritonX-
100),0.5g牛血清白蛋白(BSA)于1000ml烧杯中,
加入
900ml水搅拌溶解,用冰乙酸调节pH值至
(5.50±0.01),再转移至1000ml容量瓶中,并用蒸馏
水定容至刻度;室温下存放2个月内有效。
乙酸缓冲液(I),c(CH
3
COONa)=0.25mol/l:
称取
34.02g三水乙酸钠于1000ml烧杯中,加入900ml
水搅拌溶解,用冰乙酸调节pH值至(5.00±0.01),再转
移至1000ml容量瓶中,并用蒸馏水定容至刻度;室
温下存放2个月内有效。
乙酸缓冲液(
II),c(CH
3
COONa)=0.25mol/l:
称取
34.02g三水乙酸钠,0.5g牛血清白蛋白(BSA)于
1000ml烧杯中,加入900ml水搅拌溶解,用冰乙酸
调节
pH值至(5.00±0.01),再转移至1000ml容量瓶中,
并用蒸馏水定容至刻度;室温下存放2个月内有效。
植酸钠溶液(C
6
H
6
O
24
P
6
Na
12
)=7.5mmol/l:
称取
0.6929g植酸钠(C
6
H
6
O
24
P
6
Na
12
,相对分子质量为
923.8,纯度为95%),精确至0.1mg,置于100ml烧杯
中,用约80ml乙酸缓冲液([I)或
(1),按照实验操作
对照使用
]溶解,用冰乙酸调节pH值至(5.50±0.01)
[或(5.00±0.01)],按照实验操作对照使用,转移至
100ml容量瓶中,并用乙酸缓冲液([I)或
(1),按照实
验操作对照使用]定容至刻度,现用现配(实际反应液
中的最终浓度为
5.0mmol/l)。
硝酸溶液:
1份浓硝酸+2份水。
钼酸铵溶液,浓度为
100g/l:
称取10g钼酸铵
[(NH
4
)
6
Mo
7
O
24
·4H
2
O]于50ml烧杯中加水溶解,再转移
至100ml容量瓶中,加入1.0ml氨水(25%),用水定
容至刻度
。
偏钒酸铵溶液,
2.35g/l:
称取0.235g偏钒酸铵
(
NH
4
VO
3
)于
50ml烧杯中,加入2ml硝酸溶液及少
量水,并用玻璃棒研磨溶解,再转移至100ml棕色容
量瓶中,用水定容至刻度,避光条件下保存。
显色液(及终止液)
(1):
2份硝酸溶液,1份钼酸
铵溶液,1份泛酸铵溶液混合使用,现用现配。
0.2M乙酸钠缓冲液,pH值5.5。
1%(mM)植酸钠,溶解于0.2M乙酸钠缓冲液中,
《饲料工业》·2010年第31卷第22期
检测技术
54pH
值
5.5。
15%
三氯乙酸;
显色液(及终止液)
(2):
3份硫酸,1份钼酸铵和1
份维生素
C
,混匀,现配现用
。
1.2
实验方法
1.2.1GB-T18634—2009《饲用植酸酶活性测定的方
法分光光度法》
GB-T18634—2009为饲用植酸酶的检测方法,
一般用于纯品植酸酶的测定。
本实验借鉴该方法,评
估是否可测定商品饲料中的植酸酶。
实验按照GB-T
18634—2009
方法进行。
1.2.1.1磷酸二氢钾基准物绘制标曲
以无机磷的量为横坐标,吸光值为纵坐标,列回
归方程(y=a+bx)。
1.2.1.2加酶饲料预处理
称取加酶(100g/t)饲料于200ml刻度锥形瓶中,
加乙酸缓冲液
(2)100.0ml,在超声波溶解器上溶解
15min,再放入回旋式振荡器中振荡30min。
提取后
的试样在离心机上以
4000r/min离心10min,分取
不同体积上清液,用乙酸缓冲液
(2)稀释,使试样溶液
的浓度保持在
0.4U/ml左右,待反应。
1.2.1.3反应步骤及试剂、溶液用量(见表1)
表1反应步骤及试剂、溶液用量
反应顺序
1.加乙酸缓冲液
(1)
2.加入待反应液
3.混合
4.水浴37℃预热5min
5.依次加入植酸钠底物溶液
6.混合
7.水浴37℃水解30min
8.依次加入显色液(及终止液)
(1)
9.混合
总体积
样品、标准
1.8ml
0.2ml
√
√
4ml
√
√
4ml
√
10ml
样品空白
1.8ml
0.2ml
√
√
4ml(第二步)
√
√
4ml(第一步)
√
10ml
1.2.1.4样品测试
反应后的试样在室温下静置
10min,如出现混浊
需在离心机上以4000r/min离心10min,上清液以
标准曲线的空白调零,在分光光度计
415nm波长处
测定试样空白(A
0
)和试样溶液(A)的吸光值,A-A
0
为
实测吸光值。
用直线回归方程计算植酸酶的活性。
1.2.1.5结果与计算
植酸酶活性X按下式计算:
X=
y
m×t
×n
式中:
X———样品植酸酶活性(U/g);
y———样品溶液实测吸光值在标准曲线中对应
磷的浓度(
μmol/l
);
n———
样品溶液反应前的总稀释倍数;
m———
样品质量
(g)
;
t———
反应时间(
min
)
。
结果以两次平行测定的平均值表示,保留至
整数。
1.2.2透析法
饲料通过透析预处理可屏蔽部分背景干扰物质,
因此可提高饲料中植酸酶活性的检出率。
本实验采用
申请号200910009424.3《添加在饲料中植酸酶的微量
测定方法
》进行评估。
但由于该方法中存在两点遗漏,
本实验进行了弥补:
a.该方法采用透析袋对饲料样品
进行前处理,但并未标示透析袋的截留分子量,本实
验采用三梯度截留分子量的透析袋(
1万、10万和
30~100万)进行实验;b.该方法乙酸缓冲液(I)与乙酸
缓冲液(II)pH值均为(5.00±0.01),但实际反应中,加
入植酸酶底物等溶液后,并未将
pH值调回至(5.00±
0.01),从而造成反应条件偏离,酶活测定无效,本实验
在此步骤使用pH计测定,并用乙酸回调至(5.00±
0.01)。
实验步骤如下:
①磷酸二氢钾基准物绘制标曲线,以无机磷的量
为横坐标,吸光值为纵坐标,列回归方程(y=a+bx);
②加酶饲料预处理取有代表性样品预冷至4℃,
全部粉碎(采取间断式粉碎,防止粉碎时饲料发热)通
过0.45mm的标准筛,充分混匀后准确称取样品
50.00g,加入500ml乙酸缓冲液(II),在4℃环境下
磁力搅拌
45min,过滤(弃去初滤液50ml),取过滤液
100ml完全准确移入透析袋中,置于4℃预冷的透析
外液(乙酸缓冲液I)中,透析外液体积约为透析酶液
的
10倍,透析时间为20h(透析10h需换一次透析
外液);透析后准确量取体积并记录;
③已知酶液配制:
取植酸酶配制成酶活0.05U/
ml
的酶液,取
100ml,如②方法进行透析、测定;
④样品+已知酶:
准确称取待测饲料预冷至4℃,
全部粉碎并通过
0.45mm的标准筛,充分混匀后取样
50.00g
,量入上述步骤③所得的已知酶液500ml,在
4℃环境下磁力搅拌45min,过滤(弃去初滤液50ml),
取过滤液
100ml完全准确移入透析袋中,置于4℃
预冷的透析外液[乙酸缓冲液(I)]中,透析外液体积约
为透析酶液的
10倍,透析时间为20h(透析10h换
一次透析外液),透析后准确量取体积并记录,得加有
已知酶的样品透析液;
张英等:
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
检测技术
55⑤
反应步骤及试剂
、
溶液用量见表
2。
⑥
样品测试反应后的试样在室温下静置
10min
,
如出现混浊需在离心机上以4000r/min离心10min,
上清液以标准曲线的空白调零,在分光光度计415nm波
长处测定试样空白(
A
0
)和试样溶液(
A
)的吸光值,
A-A
0
为实测吸光值。
用直线回归方程计算植酸酶的活性。
表
2反应步骤及试剂、溶液用量
反应顺序
1.加乙酸缓冲液(I)
2.加入待反应液
3.混合
4.水浴37℃预热5min
5.依次加入植酸钠底物溶液
6.混合
7.水浴37℃水解30min
8.依次加入显色液(及终止液)
(1)
9.混合
总体积
样品、标准
1.0ml
1.0ml
√
√
4ml
√
√
4ml
√
10ml
样品空白
1.0ml(2.0ml)
1.0ml
√
√
4ml(第二步)
√
√
4ml(第一步)
√
10ml
⑦结果与计算
植酸酶活性(
U/g)=
c
m
×F
式中:
c———根据实际样液的吸光值由直线回归方程
计算出的酶活性;
F———样品溶液反应前的总稀释倍数;
m———样品质量。
结果以两次平行测定的平均值表示,保留至整数
。
1.2.3超滤离心法
饲料通过超滤离心预处理可屏蔽部分背景干扰
物质,因此可提高饲料中植酸酶活性的检出率。
本实
验采用康奈尔大学
Dr.X.G.Le(i2005)发表的《Animproved
methodforarapiddeterminationofphytaseactivityin
animalfeed》方法进行评估。
其实验步骤如下。
①植酸酶提取和过滤
室内温度4℃,将饲料样品在匀浆器中研磨到样
品均能通过1mm筛。
称取5g样品放入125ml烧瓶
中
。
在烧瓶中加入50ml、0.2M柠檬酸缓冲液(pH值
5.5)和植酸酶提取液,在室温下不断搅拌(磁力搅拌
器)30min。
将混合物转移到50ml离心管中,在4℃
条件下,15000×g离心20min。
将上清液转移到超滤
管中(用25ml的一次性移液管转移)。
用10ml的注
射器过滤上清液,滤液收集到另外1个试管中。
吸取
0.5ml滤液到超滤管中,然后按照说明书将收集的样
品分装到玻璃瓶中,然后在4℃14000×g离心(约
12~20min)。
用分析天平称取1个玻璃瓶,记录下最
接近1mg的重量。
颠倒摇动玻璃瓶中的样品,稍微旋
转下,将剩余物转移到玻璃瓶中。
将玻璃瓶放在平衡器
上,加入
0.2M
柠檬酸缓冲液,
pH
值
5.5
,通过称量保
证最后体积约为0.5m(l1ml柠檬酸缓冲液=1.0298g)。
将最后产物混合后留作植酸酶活性分析用
。
②
植酸酶活性测定
提取
0.2M柠檬酸冲液,
pH值5.5,室温下搅拌30min
离心
15000×g,20mim
直接法
超滤法
过滤
0.45μM膜
超滤浓缩
14000×g,20min
植酸酶水解
37℃,15min
颜色反应,显色液(及终
止液)②,37℃,15min
分光光度计检测415nm
图1直接法和超滤法测定饲料中植酸酶活性
2实验结果与分析
实验结果见表3,由表3可以看出:
①方法1:
GB-T18634测定饲料中的植酸酶CV为
65%,相对偏差为71%(大于该方法的适用性要求:
小
于
15%)。
此外,该方法检出率仅为29%。
因此,GB-T
18634不适用于饲料中植酸酶的检测。
②方法2:
透析法测定饲料中的植酸酶,当截留分子
量为
1万时,CV为146%,相对偏差为92%,平均检出
率为8%,因此可以推断,此时植酸酶并未浸提进入缓
冲体系,无法检测。
当截留分子量为10万和30~100
万时,CV为55%和39%,相对偏差为59%和60%,平
均检出率为
41%和40%,虽然好于方法1GB-T
18634,但仍不具有适用性。
③方法3:
超滤离心法测定饲料中植酸酶的CV为
24%,相对偏差为43%,平均检出率为57%,均优于方
张英等:
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
检测技术
56法1和方法2,但相对偏差仍高于测定饲料中植酸酶
活性的相对偏差要求(15%)。
3讨论
饲料中植酸酶活性的测定关键点在于浸提及背
景干扰除杂。
GB-T18634适用于植酸酶产品的检测,并未进
行浸提及背景干扰除杂方便的优化与改进,因此,无
法测定饲料中植酸酶的活性。
透析法在一定程度上改进了背景干扰除杂的问
题,但专利申请中并未标示截留分子量的关键指标。
本实验选用截留分子量从1万到100万范围的透析
袋,均未实现较好的相对偏差和酶活检出率,因此,无
法适用于饲料中植酸酶的活性测定。
超滤离心法可更准确的进行背景干扰除杂,但是
原文中酶活的测定是在820nm波长下进行,本实验
为了保持三种试验方法的一致性,改为415nm波长
下进行测定,因此存在一定的检测偏差。
另外,该方法
所用仪器要求较高,不一定完全适用于饲料厂或酶制
剂生产企业实际情况,因此,有待进一步完善与改进
。
(编辑:
高雁,snowyan78@)
方法2(透析法)
表3不同方法测定8个饲料样品中植酸酶活性结果
样品01
样品02
样品03
样品04
样品05
样品06
样品07
样品08
平均值*
CV
相对偏差
平均检出率**
方法1
(GB-T18634)
143
167
0
204
192
0
235
210
144
65%
71%
29%
截留分子量1万
0
27
0
168
0
0
96
43
42
146%
92%
8%
截留分子量10万
269
325
108
64
226
97
193
377
207
55%
59%
41%
截留分子量30~100万
162
126
230
372
165
187
147
210
200
39%
60%
40%
方法3
(超滤离心法)
374
386
287
206
208
265
257
279
283
24%
43%
57%
项目
注:
*以U/kg配合饲料计;**饲料样品中植酸酶活性为500U/kg配合饲料,因此,平均检出率以“平均值/500”计。
张英等:
饲料中植酸酶活性检测方法的比较与研究
检测技术
57
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