最新植物生理学综合设计方案第四次实验.docx

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最新植物生理学综合设计方案第四次实验

Ⅰ、叶绿素含量的测定

实验目的

了解叶绿体的组成成分；掌握叶绿体含量测定的方法、原理。

实验原理

叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，叶绿素的含量是植物生理研究中的重要指标。

叶绿素吸收大部分的红光和紫光但反射绿光，所以叶绿素呈绿色，它在光合作用的光吸收中起核心作用。

叶绿素的测定方法主要有：

原子吸收光谱法、分光光度法、光声光谱法、基于机器视觉技术的叶绿素检测方法。

本实验采用分光光度法，即利用分光光度计测定叶绿素提取液在最大吸收波长下的吸光值，即可用郎伯—比尔定律计算出提取液中各色素的含量。

即当一束单色光通过溶液时，溶液的吸光度值与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

其数学表达式为：

A=Kbc其中A为吸光度值；K为吸光常数；b为溶液的厚度；c为溶液的浓度。

叶绿素a、b的丙酮溶液在可见光范围内的最大吸收峰分别位于663、645nm处。

而80%丙酮提取液中色素浓度计算公式：

Ca=12.7A663-2.59A645Cb=22.9A645-4.67A663

叶绿素含量（mg/g或mg/dm2）=（C×V×1000）/A

式中：

C为叶绿素含量（mg/L或mg/dm2）；V为提取液总体积（ml）；

A为取样鲜重（g）或取样面积（dm2）。

实验用品

一、材料

新鲜的玉米叶片

二、试剂

80%丙酮、石英砂、碳酸钙

三、器材

分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管

实验步骤

1、取样。

取新鲜的玉米叶片，洗净，擦干，取出大的叶脉。

2、研磨。

称0.5g置于研钵中，加80%的丙酮溶液，石英砂研磨。

3、匀浆过滤。

用80%的丙酮洗研钵及残渣，合并滤液。

4、定容。

把滤液用80%的丙酮定容至25mL。

5、测定。

适当稀释后测定A645、A663。

结果计算

叶绿素含量（mg/g或mg/dm2）=（C×V×1000）/A

式中：

C为叶绿素含量（mg/L或mg/dm2）；V为提取液总体积（ml）；

A为取样鲜重（g）或取样面积（dm2）。

注意事项

1、注意叶绿素一定要提取干净，以免测定误差。

2、叶绿素初提取液体积不要太多，以免浪费试剂，如果浓度太高还可以进行稀释。

3、注意分光光度计的规范使用。

Ⅱ、植物光合速率的测定

实验目的

掌握改良半叶法测定叶片净光合速率、总光合速率的原理和方法。

实验原理

叶片中脉两侧的对称部位,其生长发育基本一致,功能接近。

如果让一侧的叶片照光,另一侧不照光,一定时间后,照光的半叶与未照光的半叶在相对部位的单位面积干重之差值,就是该时间内照光半叶光合作用所生成的干物质量。

在进行光合作用时,同时会有部分光合产物输出,所以有必要阻止光合产物的运出。

由于光合产物是靠韧皮部运输,而水分等是靠木质部运输的,因此如果破坏其韧皮部运输,但仍使叶片有足够的水分供应,就可以较准确地用干重法测定叶片的光合强度。

实验用品

材料

新鲜的玉米叶片

试剂

5%三氯乙酸、90℃以上的开水

器材

打孔器、分析天平、称量皿、烘箱、脱脂棉、锡纸、毛巾、剪刀、纸牌

实验步骤

1、选择测定样品在田间选定有代表性的叶片若干,用小纸牌编号。

选择时应注意叶片着生的部位、受光条件、叶片发青是否对称等。

2、叶子基部处理棉花等双子叶植物的叶片,可用5%三氯乙酸涂于叶柄周围;小麦、水稻等单子叶植物,可用在90℃以上开水浸过的棉花夹烫叶片下部的一大段叶鞘20s。

如玉米等叶片中脉较粗壮,开水烫不彻底的,可用毛笔蘸烧至110～120℃的石蜡烫其叶基部。

为使烫伤后的叶片不致下垂,可用锡纸或塑料包围之,使叶片保持原来着生的角度。

3、剪取样品叶子基部处理完毕后,即可剪取样品,一般按编号次序分别剪下叶片的一半（不要伤及主脉）,包在湿润毛巾里,贮于暗处,也可用黑纸包住半边叶片,待测定前再剪下。

过4～5小时，再按原来次序依次剪下照光另半边叶，也按编号包在湿润的毛巾中。

4、称重比较用打孔器在两组同号的半叶的对称部位打若干圆片（有叶面积仪的,也可直接测出两半叶的叶面积）,分别放人两个称量皿中,在110℃下杀青15min,再置于70℃烘箱至恒重,冷却后用分析天平称重。

结果计算

两组叶圆片干重之差值,除以叶面积及照光时间,得到光合强度

（实验式13－1）,即:

光合速率=（W2－W1）/S×T（mg·dm-2·h-1）

W2—照光圆片干重（mg）;

W1—未照光圆片干重（mg）;

S—圆片总面积（dm）

t—照光时间（h）

注意事项

1.选择外观对称的植物叶片,以免两侧叶生长不一致,导致误差。

2.选择的叶片应光照充足,防止因太阳高度角的变化而造成叶片遮阳。

3.涂抹三氯乙酸的量或开水烫叶柄的时间应适度,过轻达不到阻止同化物运转的目的,过重则会导致叶片萎焉降低光合。

4.应有若干张叶片为一组进行重复。

Ⅲ、植物丙二醛含量的测定

实验目的

1．掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；

2．深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA含量测定的意义；

3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA形成的关系；

4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA含量；

5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

实验原理

植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。

活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。

其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。

因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

MDA在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet—nine），又名三甲川，该物质在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收。

由于TBA也可与其它物质反应，并在532nm处有吸收，为消除硫代巴比妥酸与其它物质反应的影响，同时测定600nm下的吸光度，利用532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的浓度。

即：

A532－A600＝ε·C·L

式中，A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值，C是MDA浓度，L为比色杯厚度，ε=155L·mmol-1·cm-1。

TBAMDA3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮

需要指出的是，植物组织中糖类物质可能对MDA-TBA反应有干扰作用。

可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

C（μmol·L-1）=6.45×（A532－A600）－0.56×A450

材料与设备

一、材料：

四种玉米叶样品，即绿色和黄色叶片的高温处理和室温对照。

二、仪器：

分光光度计冷冻离心机；水浴锅；天平；研钵；剪刀；5ml刻度离心管；刻度试管（10ml）；镊子；移液管（5ml、2ml、1ml）

三、药品

0.05mol/LpH7.8磷酸钠缓冲液；

5％三氯乙酸溶液：

称取5g三氯乙酸，先用少量蒸馏水溶解，然后定容到100ml；

0.5％的TBA溶液：

称取0.5g硫代巴比妥酸，用5％三氯乙酸溶解，定容至100ml。

实验步骤

1、MDA的提取：

取样品0.5g（W），加入2ml预冷的0.05mol/LpH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨成匀浆，转移到5ml刻度离心试管，将研钵用缓冲液洗净，清洗液也移入离心管中，最后用缓冲液定容至5ml。

4500rpm，4度，离心10min，上清液即为MDA提取液，测量提取液的体积（V）。

2、MDA含量测定：

吸2ml（V2）的提取液于刻度试管中（空白为2ml缓冲液），加入3ml0.5％的TBA溶液，将试管放入沸水浴中煮沸10min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）。

到时间后，立即将试管取出并放入冰浴中。

4500r/m，4℃，离心10min，取上清液并量其体积（V1）。

上清液于532nm、600nm波长下测定吸光度。

结果计算

MDA（nmol·g-1）＝6.452×（A532－A600）×

式中，V1为反应液总量（ml）；V2为反应液中的提取液数量（ml）；V为提取液总量（ml）；W为植物样品重量（g）。

注意事项

1．可溶性糖与TBA显色反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。

2．低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5nmol·L-1）。

3．如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间。

结果处理

样品

处理

重复

A532

A600

MDA含量（nmol·g-1）

绿叶

高温处理

1

2

3

平均

标准差

室温对照

1

2

3

平均

标准差

黄叶

高温处理

1

2

3

平均

标准差

室温对照

1

2

3

平均

标准差

Ⅴ、植物根系活力的测定（甲稀蓝法）

实验目的

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。

本实验学习测定根系活力的甲烯蓝法。

实验原理

根据沙比宁等的理论，植物对溶质的吸收具有表面吸附的特性，并假定被吸附物质在根系表面形成一层均匀的单分子层；当根系对溶质的吸附达到饱和后，根系的活跃部分能将吸附着的物质进一步转移到细胞中去，并继续产生吸附作用。

在测定根系活力时常用甲烯蓝作为吸附物质，其被吸附量可以根据吸附前后甲烯蓝浓度的改变算出，甲烯蓝浓度可用比色法测定。

已知1mg甲烯蓝形成单分子层时覆盖的面积为1.1m2，据此可算出根系的总吸收面积。

从吸附饱和后再吸附的甲烯蓝的量，可算出根系的活跃吸收表面积，作为根系吸收活力的指标。

材料与设备

一、材料

植物根系

二、仪器及用具

分光光度计；移液管；烧杯；比色管

三、试剂：

0.01mg•mL-1甲烯蓝溶液；0.0002mol•L-1（0.075mg•mL-1）甲烯蓝溶液

实验步骤

1、甲烯蓝标准曲线的制作按表2－1用0.01mg•mL-1甲烯蓝溶液配制系列标准溶液，于660nm处测定吸光度，以甲烯蓝浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

甲烯蓝系列标准溶液的配制：

试剂/mL

管号

0

1

2

3

4

5

7

0.01mg•mL-1甲烯蓝/mL

0

1

2

3

4

5

6

蒸馏水/mL

10

9

8

7

6

5

4

甲烯蓝浓度/µg•mL-1

0

1

2

3

4

5

6

2、将待测的植物根系洗净沥干，浸在装有一定量水的量筒中，用排水法测定根系的体积（或用体积计测定）。

3、将0.0002mol•L-1的甲烯蓝溶液（每毫升溶液中应含0.075mg甲烯蓝，为消除溶液配制和比色误差，其含量需要重新进行比色，查标准曲线确定）分别倒入3个小烧杯中，编号，每个烧杯中溶液体积约10倍于根系的体积。

准确记下每个烧杯中的溶液量。

4、将洗净的待测根系，用吸水纸小心吸干，然后依次浸入盛有甲烯蓝溶液的烧杯中，每杯中浸1.5min，注意每次取出时，都要使根上的甲烯蓝溶液流回到原杯中去。

5、从3个小烧杯中各吸取甲烯蓝溶液1mL，用去离子水稀释10倍后，于660nm处测定吸光度，根据标准曲线，查得各杯浸根后甲烯蓝的浓度。

结果计算

（1）总吸收面积（m2）=[（c1—c1’）×v1+（c2—c2’）×v2]×1.1

（2）活跃吸收面积（m2）=[（c3—c3’）×v3]×1.1

（3）活跃吸收面积%=根系活跃吸收面积（m2）/根系总吸收面积（m2）×100%

（4）比表面积（cm2·cm-3）=根系总吸收面积（cm2）/根体积（cm3）

式中　c：

各杯未浸泡根系前的甲烯蓝浓度（mg•mL-1）；

c’：

各杯浸泡根系后的甲烯蓝浓度（mg•mL-1）；

v：

各杯中的溶液量（mL）。

Ⅵ、植物细胞膜透性的测定

实验目的

植物细胞质膜是细胞与外界环境的一道分界面，对维持细胞的微环境和正常的代谢起着重要作用。

但植物常受到外界不良因子的影响，而不同植物种类其抗逆性则不同。

用电导仪率法测定植物质膜透性的变化，可作为植物抗逆性的生理指标之一。

本实验主要测定低温对细胞质膜透性的影响，并掌握用电导仪法测定植物细胞质膜透性的原理及方法。

实验原理

将植物组织放入一系列不同浓度的蔗糖溶液中，经过一段时间，植物细胞与蔗糖溶液间将达到渗透平衡状态。

如果在某一溶液中细胞脱水达到一平衡时刚好处于临界质壁分离状态，则细胞的压力势ψs等与外液的渗透势ψso,即ψs=ψso，此溶液称为该组织的等渗溶度，其溶度称为该组织的等渗浓度，即可计算出细胞也渗透度（ψs0）。

实际测定时，由于临界质壁分离状态难以在显微镜下直接观察到，所以一般均以初始质壁分离作为判断等渗浓度的标准。

处于初始质壁分离状态的细胞体积，比吸水饱和时略少，故细胞也浓缩而渗透势略低于吸水饱和时的渗透度，此种状态下的渗透势称基态渗透势。

材料与设备

一、材料

新鲜的玉米叶片

二、设备

显微镜1台；载玻片与盖玻片各若干；温度计1支；尖头镊子1把；刀片1片；100ml试剂瓶9套；500ml试剂瓶9套；烧杯、容量平、量筒、吸管等；吸水纸适量。

三、试剂

mol浓度的蔗糖溶液（1000ml水溶解342.3g蔗糖）：

称取预先在60～80℃下烘干的蔗糖34.2g，溶于100ml蒸馏水中，即为1摩尔浓度的蔗糖溶液。

0.03%中性红溶液。

蔗糖系列标准液：

取干燥洁净的小试剂瓶9号编号，用1摩尔浓度的蔗糖溶液依C1V1=C2V2公式配置0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.60、0.70摩尔浓度等一系列不同浓度的蔗糖溶液（具体范围可根据材料不同而加以调整），贮于试剂瓶中，瓶口加塞以防蒸发浓缩。

实验步骤

1、用玉米叶表皮作实验材料。

2、取干燥洁净的培养皿9套编号，将配好的不同浓度的蔗糖溶液按顺序加入个培养皿中使成一薄层，盖好盖备用。

3、用镊子剥取供试材料表皮，大小以0.5cm2为宜，立即浸入不同浓度的蔗糖溶液中，每一浓度4～5片。

（如观察细胞无色，为便于观察，可将切片于0.03%中性红内染色5min左右，吸去水分，再浸入蔗糖溶液中，但如不加染色即能区别质壁分离时，仍以不染色为宜。

）

4、切片在蔗糖溶液中浸泡20～30min，同时记录室温，取出放在载玻片上，滴一滴相同浓度的糖液，盖以盖玻片，在显微镜下观察，确定引起50%以上发生初始质壁分离（即原生质刚从细胞壁的角隅分离）的浓度，每1制片观察的细胞不应少于100个。

如果在两个相邻浓度的切片中，一个没有发生质壁分离，另一个发生质壁分离的细胞数超过50%，则这两个浓度的平均值为其等渗浓度。

检查时可先从中间浓度开始。

5、根据所的得到的等渗浓度和测定的室温，计算细胞液的渗透势（ψs）。

ψs=－iCRT

ψs：

细胞的渗透势；

R：

摩尔气体常数，R=0.083×105L·Pa/（mol·K）；

T:

热力学温度，K=273+t,单位为0C；

I:

为解离系数，蔗糖为1；

C：

为等渗溶液浓度，单位为mol/L；

Ψs=-0.083×105×（273+t）×1×C

6、试比较不同植物材料的渗透势，把结果列于下表：

测定植物组织渗透势记载表

植物材料

质壁分离

不同浓度下的质壁分离（1L水中含mol溶质量）

等渗浓度

细胞液渗透势ψs（-Mpa）

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70