急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义.docx

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急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义

急性白血病细胞凋亡抑制基因Livin表达及临床意义

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___________单位:

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【摘要】目的观察Livin基因在急性白血病（AL）病人白血病细胞中的表达及其临床意义。

方法采用半定量逆转录聚合酶链反应（RTPCR）方法检测41例不同时期AL病人白血病细胞LivinmRNA的表达水平，以10例健康人作为正常对照。

结果AL病人白血病细胞LivinmRNA阳性表达率为53.7%。

其中急性淋巴细胞白血病（ALL）和急性非淋巴细胞白血病（ANLL）病人LivinmRNA阳性表达率分别为53.8%、53.6%，二者比较差异无显著性，但均高于正常对照组（10.0%）（P=0.035、0.017）。

初治和复发AL病人白血病细胞LivinmRNA阳性表达率分别为52.4%、85.7%，明显高于对照组（P=0.025、0.004）。

缓解组病人LivinmRNA阳性表达率为15.4%，明显低于初治组和复发组（P=0.004、0.030），而与对照组相比差异无统计学意义。

白细胞计数≥50×109/L的初治白血病病人LivinmRNA的阳性表达率（77.8%，7/9）明显高于白细胞计数50×109/L的初治病人（25.0%，3/12）（P=0.022），其表达水平也明显高于后者（T=6.50，P0.05）。

结论LivinmRNA过度表达参与了AL的发病，可作为AL的诊断、复发及预后判断的指标之一。

LivinmRNA表达在AL细胞的增殖分化和（或）抗凋亡过程中发挥了重要作用，可能是导致AL细胞对化疗药物不敏感的原因之一，可作为治疗的一个潜在靶点。

【关键词】Livin基因;白血病;逆转录聚合酶链反应[ABSTRACT]ObjectiveToexplorethecorrelationbetweentheexpressionofLivingeneinacuteleukemic（AL）cellsanditsclinicalsignificance.MethodsThelevelsofleukemiccellLivinmRNAin41ALpatientsand10healthycontrolsweremeasuredbysemiquantitativereversetranscriptasepolymerasechainreaction（RTPCR）technique.ResultsThepositiveexpressionrateofleukemiccellLivinmRNAinthepatientswas53.7%,andthatofLivinmRNAinALLcellsandANLLcellswere53.8%and53.6%,respectively,thedifferencebetweenthemwasnotsignificant,buthigherthanthatinnormalcontrols（10.0%）（P=0.035,0.017）.TheexpressionofLivinmRNAininitiallytreatedALpatientsandtherecurrentwas52.4%and85.7%,respectively,whichwassignificantlyhigherthanthatinnormalcontrols（P=0.025,0.004）.TheexpressionofLivinmRNAinpatientsatremissionwas15.4%,whichwaslowerthanthatininitiallytreatedandrecurrentpatients（P=0.004,0.030）,buttherewasnostatisticalsignificanceascomparedwithnormalcontrols.Besides,theinitiallytreatedALpatientswithaleukocytecountofatleast50×109/LhadasignificantlyhigherLivinmRNAexpressionrate（77.8%,7/9）thanthatwithaleukocytecountoflessthan50×109/L（25.0%,3/12）（P=0.022）.Inaddition,thelevelofLivinmRNAintheformerwassignificantlyhigherthanthatofthelatter（T=6.50,P0.05）.ConclusionOverexpressionofLivinmRNAinvolvesinthepathogenesisofacuteleukemia,whichcanbeusedasoneoftheparametersinthediagnosis,predictionofrecurrenceandprognosisofthedisease.TheexpressionofLivinmRNAplaysanimportanteffectontheproliferationanddifferentiationofALcells,whichmaybeoneofthereasonsleadingtoinsensitivetochemotherapyofALcellsandbeusedasapotentialtargetforthetreatmentofthedisease.　　[KEYWORDS]Livingene;leukemia;reversetranscriptasepolymerasechainreaction　　凋亡抑制是肿瘤细胞的一个普遍特性。

近年发现的凋亡蛋白抑制因子（IAP）是一类重要的抗细胞凋亡因子，与肿瘤的发生发展关系密切。

目前，人类IAPs家族中已发现有NIAP、XIAP、clAP1、clAP2、survivin、apollon、ILP2和Livin共8个成员，其抗凋亡功能远强于Bc12家族，在肿瘤的发病机制中起着重要作用。

其中clAP1、clAP2、survivin等多个IAP家族成员在白血病细胞中高表达，且与预后相关[13]。

Livin是IAPs家族中的一个新成员，有2种异构体（Livinα和Livinβ），特异性表达于人的胚胎组织及大多数人类实体瘤组织，在分化成熟的正常组织中无表达或低表达[46]，在肿瘤组织中表达明显增高，与肿瘤的发生密切相关，可能成为肿瘤基因诊断和治疗的新靶点[7]。

本研究旨在观察Livin基因在各类急性白血病（AL）病人中表达水平的变化，并探讨其临床应用价值。

　　1对象与方法　　1.1研究对象　　AL病人41例，男16例，女25例;年龄19～80岁，中位年龄52岁。

其中急性非淋巴细胞白血病（ANLL）28例（M2者10例，M3者4例，M4者6例，M5者8例），急性淋巴细胞白血病（ALL）13例（L1型5例,L2型8例）。

初治病人21例，复发7例，缓解13例。

缓解病人中2例系由初诊病人转化而来。

所有初诊ALL病人采用VDP（长春新碱、柔红霉素、泼尼松）或VDCP（长春新碱、柔红霉素、环磷酰胺、泼尼松）化疗方案诱导治疗;ANLL病人采用HA（高三尖杉酯碱、阿糖胞苷）或DA（柔红霉素、阿糖胞苷）化疗方案治疗，M3病人采用全反式维甲酸（atRA）或atRA与三氧化二砷（As2O3）合用，或以atRA为主，联合应用小剂量DA或HA方案诱导分化治疗。

以上所有病人的诊断及治疗均参照张之南等[8]主编的《血液病诊断及疗效标准》。

选择10例健康人作为正常对照，男4例，女6例;年龄21～57岁，中位年龄41.5岁。

　　1.2标本处理　　无菌操作取EDTA抗凝的骨髓液2mL，Ficol液（相对密度1.077）分离单个核细胞，细胞比例大于80%，锥虫蓝拒染率大于99%，取约6×106个细胞，用PBS液洗涤2次，加Trizol液1mL，混匀后-20℃保存，待提取RNA。

　　1.3细胞总RNA提取　　按Invitrogen公司试剂盒说明书的步骤操作。

紫外线分光光度计测定RNA纯度（A260/A2801.6），同时进行RNA定量测定。

在15g/L琼脂糖凝胶上电泳可见3条清晰亮带，说明所提取RNA完整。

　　1.4cDNA合成　　取RNA5μg，OLigo（dT）primer（0.5g/L）1μL，用DEPC处理水补至12μL，于70℃下放置5min。

冰上骤冷后，加5×缓冲液4μL，RNA酶抑制剂20U，10mmoL/LdNTPs2μL，37℃5min后加入RevertAidMMuLV逆转录酶200U，反应体系20μL，42℃反应1h，70℃下放置10min终止反应。

　　1.5PCR扩增　　1.5.1引物设计实验中所用引物根据GenBank提供的LivinmRNA序列（LivinαNM_139317.1;LivinβNM_022161.2），由上海生工公司设计合成。

Livinα正义链：

5′TGTCAGTTCCTGCTCCGGTCAA3′，反义链：

5′CGCACGGCACAAAGACGATG3′，其目的基因的长度为298bp。

Livinβ正义链：

5′TGGGAAGAACCGGAAGAC3′，反义链：

5′CACGGCACAAAGACGATG3′，其目的基因的长度为263bp。

βactin正义链：

5′CTGGGACGACATGGAGAAAA3′，反义链：

5′AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC3′，目的基因长度为500bp。

　　1.5.2PCR反应PCR反应体系包括：

20μmol/L的Livin正、反义链引物各0.5μL，10mmol/L的dNTPs1.6μL，10×缓冲液2μL，TaqDNA聚合酶1U，RT产物1μL，其余以DEPC水补足至20μL。

预实验确定产物与循环之间呈线性关系。

PCR条件：

95℃预变性5min，1个循环;然后94℃变性30s，59℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环;最后72℃延伸10min。

同时行βactin测定作为内参照。

　　1.6PCR产物分析　　取PCR产物10μL与LoadingBuffer2μL混合，在15g/L琼脂糖凝胶中电泳，80V、25min。

阳性结果可见500、298和263bp处各有一条亮带，分别为βactin、Livinα和Livinβ。

紫外线透射仪观察并照相，照片经MetamorphImagingSight软件进行分析并读取吸光度值，取Livin/βactin吸光度比值进行半定量，代表mRNA表达水平。

各标本重复2次，取平均值。

　　1.7统计学处理　　用SPSS11.5和PPMS1.5[9]统计软件进行统计学处理。

实验数据以率和中位数（四分位数间距）表示，组间比较采用χ2检验、Fisher’s精确概率检验或秩和检验。

　　2结果　　2.1AL细胞中LivinmRNA的表达　　41例AL病人白血病细胞LivinmRNA阳性表达率为53.7%（22/41）。

其中ALL病人的阳性表达率为53.8%（7/13），ANLL病人阳性表达率为53.6%（15/28），二者均高于对照组的10%（1/10），差异有统计学意义（P=0.035、0.017）。

但ALL与ANLL比较无统计学差异。

ALL、ANLL病人及对照组Livin/βactin的半定量结果分别为0.171　（0.102）、0.087（0.117）、0.010（0.007），ALL与ANLL病人LivinmRNA表达水平均高于对照组（H=20.22，d=14.25、14.61，P0.05）。

图1为部分病人的电泳结果。

　　M：

Marker;①、②同一初治病人Livinα、β;③、④同一缓解病人Livinα、β;⑤、⑥同一复发病人Livinα、β;⑦、⑧正常对照。

　　图1不同阶段白血病病人LivinmRNA的表达　　2.2AL病人不同时期LivinmRNA的表达　　初治组和复发组病人Livin阳性表达率分别为52.4%（11/21）、85.7%（6/7），均高于对照组（P=0.025、0.004）。

缓解组病人Livin阳性表达率为15.4%（2/13），明显低于初治组和复发组病人（P=0.004、0.030），缓解组与对照组相比差异无统计学意义。

　　2.3LivinmRNA表达与外周血白细胞计数关系　　将初治白血病病人按白细胞计数分为两组，白细胞计数≥50×109/L的白血病病人LivinmRNA阳性表达率（77.8%，7/9），明显高于白细胞计数50×109/L的病人（25.0%，3/12）（P=0.022）;两组Livin/βactin半定量结果分别为0.086（0.389）、0.038（0.298），前者表达水平也明显高于后者（T=6.50，P0.05）。

　　3讨论　　IAPs家族已发现8个成员，是独立于Bcl2的抗凋亡蛋白。

IAPs的抗凋亡作用主要通过抑制凋亡蛋白酶的活性而实现。

　　Livin是LIN等[6]根据IAPs同源序列，采用含有BIR序列的EST克隆，在人胚肾cDNA文库中发现的一个IAPs家族的新成员。

2001年ASHHAB等[5]明确了Livin存在2个不同的异构体Livinα和Livinβ，分别由298和280个氨基酸组成。

基因定位于染色体20q13.3。

Livin主要存在于细胞质中[56]。

Livin抑制细胞凋亡作用主要通过其BIR区与半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases）结合，抑制Caspases3/7和Caspases9的活性，达到阻断凋亡受体及以线粒体为基础的凋亡途径而起作用[6]。

有研究报道Livin还可能通过分解Smac，阻止其对XIAP的拮抗作用，从而间接抑制Caspase来调控凋亡[10]。

由于Livinα和Livinβ两种亚型结构上的差异，体外研究发现它们表现出不同的抗凋亡活性，虽然两者都能阻断TNFα与抗CD95抗体所诱导的细胞凋亡，但在阻断依托泊甙等降解DNA的抗癌药物所诱导的细胞凋亡中，Livinβ比Livinα有更强的阻断能力[1113]。

　　Livin在胎儿发育过程中的多种组织高表达，在正常成人的大多数终末组织中（除胎盘）低表达或不表达[45]，而在如黑色素瘤、乳癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤组织中高表达[1112]。

　　ABE等[13]的研究显示，Livin在骨髓增生异常综合征（MDS）及初治急性髓系白血病（AML）中表达均明显高于正常对照组，提示Livin在初治白血病中可抑制凋亡。

本文结果表明，大部分AL病人表达LivinmRNA，而且LivinmRNA表达阳性率和表达水平在AL病人中均明显高于正常对照组，认为Livin的异常高表达与AL的发病有密切关系，与有关文献报道一致[13]。

本研究还对不同类型AL进行分析，结果显示ALL和ANLL中LivinmRNA的表达均高于正常对照组，各个亚型之间并无明显差异，推测LivinmRNA的过表达有可能是各类AL的共同发病机制。

本文结果还显示，初治及复发白血病病人LivinmRNA表达率高于对照组，而缓解组与对照组无差别，说明Livin表达在AL细胞的增殖分化和（或）抗凋亡过程中发挥了重要作用。

本研究还显示，Livin的表达水平在外周血白细胞数≥50×109/L的病人中高表达，而外周血白细胞数升高是AL预后不良的重要因素。

因此，Livin可以作为判断预后的重要指标之一。

Livin的高表达是造成白血病细胞耐药的又一重要因素，具体作用机制有待于进一步研究。

　　有研究结果显示，Livin过表达是白血病细胞耐药的根本原因[14]。

本文结果也显示，LivinmRNA在初治AL病人表达率明显高于正常对照组，治疗缓解后其表达率明显下降，复发后表达率又再次升高，其原因可能与Livin高表达后造成白血病细胞对化疗药物的敏感性下降有关。

目前已有研究结果显示，采用RNA干扰技术对Livin基因表达进行干预后，细胞对诱导凋亡的药物和射线的敏感性增加[11]。

由此可见，Livin基因有可能成为白血病治疗的一个潜在靶点。

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