现代医学实验仪器及实验技术.docx
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现代医学实验仪器及实验技术
《现代医学实验仪器与实验技术》
一、简述高效毛细管电泳仪(HPCE)的组成及技术上的重要改进
四大系统组成:
进样系统;
分离系统;
检测系统;
数据处理系统
两项重要改进:
细内径毛细管;
高电压
二.试述高效毛细管电泳技术在医药学领域中的应用
蛋白质分离、DNA测序、糖分析、手性分离、无机离子分离、单细胞分析等。
检测多种样品,如血清、血浆、尿样、脑脊液、红细胞、体液及
临床疾病诊断,临床药物监测,滥用药物分析及临床微生物检测等。
药物中主药成分分析,药物中相关杂质的检测,中药中活性成分的分析,中药指纹图谱分析,手性药物分析等
三、简述显微镜在生物领域常用的观察方式及其用途
◆明场观察
◆暗场观察
◆相差观察
◆偏光观察
◆微分干涉
◆浮雕相称观察
◆荧光观察
四、电镜样品取材时需注意什么?
常规使用的固定剂是什么?
浓度是多少?
1.对任何组织,包括活检组织或培养细胞,取材时因注意以下几点:
●快
●小
●准
●低温操作
●避免损伤
2.常规透射、扫描样品多采用2.5%-3%的戊二醛固定液
五、何谓生物样品的反差?
如何提高生物样品反差?
●反差为所观察样品的像与其背景在亮度上的差别
●生物样品的反差可通过以下途径来调节
(1)电子染色
(2)在上机操作时调节物镜光阑的孔径大小
(3)调节加速电压的数值
六、常见的电子显微镜种类及其特点?
举例说明透射电镜在临床病理诊断的优缺点?
如何弥补缺点?
透射电子显微镜、扫描电子显微镜、分析电子显微镜
优点:
分辨能力高,可观察小于0.1um的细胞微细结构和各种特殊物质以及病原体。
由于其所观察切片厚度为100nm范围,视野小,观察范围局限是其最大缺点
“三片会诊”:
即光镜,半薄切片,电镜检查
七、简述定量PCR引物设计通常遵循哪些原则?
A、引物与模板的序列要紧密互补。
B、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
C、引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
D、引物长度通常在20-25bp,Tm值在55-65℃,GC含量在40%-60%,产物大小在100-250bp之间。
E、引物的3’端避免使用碱基A,同时避免出现3个以上连续相同的碱基。
F、为避免基因组的扩增,引物设计最好能跨两个外显子
八.为什么要用定量PCR而不用普通PCR?
单纯定性PCR所提供的只是阳性或阴性结果,在阐述许多问题的本质时,基因及其表达的量起着至关重要的作用。
定量PCR常用估计病毒的负荷量、基因表达的上调或下调等监测临床治疗进展或用于诊断遗传缺陷等。
通过对靶基因量的检测,将其与疾病的临床表现、临床分型以及各种标志酶的值联系起来,为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。
在一定程度上消除了单纯定性PCR过于敏感、假阳性率高的缺点。
九、Westernblot的目的是什么?
目的蛋白是否存在在样品当中;
蛋白质的分子大小;
蛋白质量的改变;
蛋白质的表达情况:
上调或下调?
患者和正常人群样品之间的表达差异性
十.免疫印迹(Westernblot)的基本原理
WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是一抗,“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的一抗起免疫反应,再与酶、同位素或红外荧光标记的二抗反应,经过底物显色、放射自显影或红外荧光扫描仪检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
十一.何谓流式细胞术?
简述其分析用途?
(1)流式细胞术是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。
它借鉴了荧光显微镜技术与血球计数原理,同时利用荧光染料、激光技术、单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。
(2)分析用途:
①细胞表面分子或抗原分析;②细胞内分子或抗原分析;③体液中可溶性分子的分析
十二.流式细胞仪利用传统PI染色检测细胞周期的样品制备步骤
1)制备单细胞悬液于200ul的PBS中
2)加2ml预冷的70%的酒精中,边加边振动保证细胞不粘连(一般不能用PBS配)
3)置于4摄氏度冰箱过夜
4)2000转离心5分钟,去上清
5)重悬细胞沉淀于PBS中,2000转离心,去上清
6)重悬细胞沉淀于PBS中,轻轻吹打,过300目滤网过滤,调整细胞浓度为106/ul
7)加入100ulPI染液,避光孵育30分钟上机检测。
十三.简述生物芯片的类型
生物芯片技术:
包括基因芯片、蛋白芯片及芯片实验室
基因芯片(Genechip)又称DNA芯片,它是在基因探针的基础上研制出的,所谓基因探针只是一段人工合成的碱基序列,在探针上连接一些可检测的物质,根据碱基互补的原理,利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。
它将大量探针分子固定于支持物上,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。
蛋白质芯片:
利用的不是碱基配对而是抗体与抗原结合的特异性即免疫反应来检测。
蛋白质芯片构建的简化模型为:
选择一种固相载体能够牢固地结合蛋白质分子(抗原或抗体),这样形成蛋白质的微阵列,即蛋白质芯片。
芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统,它最终的目的是实现生化分析全过程全部集成在一片芯片上完成,从而使现有的许多烦琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化,属未来生物芯片的发展方向。
十四.为什么一提到基因芯片总会首先想到DNA芯片?
(1)与DNA的性质有关。
DNA很稳定不容易降解,保存时间长;
(2)强大的类比性。
使得以往需多次处理的遗传分析在同一时间和条件下快速完成;
(3)巨大的信息产出率;
(4)高度敏感性和专一性;
(5)高度重复性;
(6)微型化和自动化。
十五.解释下列染色体的表达式的意思
45,XY,-14,-21,+rob(14;21)(q11;p11)
45条染色体,男性,少一条14号和一条21号染色体,多一条罗氏易位染色体,该染色体为14号长臂1区1带与21号短臂1区1带连接
十六.FISH技术与G显带技术如何结合?
有什么优点?
已做过G显带的染色体片子用75%的乙醇或甲醇褪色后,可使FISH更清晰的辨认各条染色体及染色体结构异常(包括某些复杂的易位,插入,倒位等)
不仅可以用新近G带处理过的片子,而且还可用陈旧的G带片子。
因此,FISH技术可成功的帮助细胞遗传学家做出回顾性分析
十七、基因转导技术有哪几类?
各举一例说明
1.化学方法:
(磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖)
2.物理方法:
(脂质体介导的转染、电击转染法、基因枪技术、显微注射法)
3.生物学方法:
(逆转录病毒感染、腺病毒感染、慢病毒感染)
十八.测序的概念?
DNA一级结构的测定方法有哪些?
1.测序:
确定一条染色体/DNA片断上的碱基顺序。
2.
(1)经典方法:
Sanger双脱氧链终止法/末端终止法/酶法、Maxam-GilbertDNA化学降解法/化学断裂法。
(2)新技术方法:
杂交测序法、质谱法、单分子测序法、原子探针显微镜测序法、流式细胞仪测序法、大规模平行实测法、DNA芯片法。
十九、什么是实验室生物安全防护?
实验室安全的目的是什么?
实验室工作人员所处理的实验对象含有致病的微生物及其毒素时,通过在实验室设计建造、使用个体防护装置、严格遵从标准化的工作及操作程序和规程等方面采取综合措施,确保实验室工作人员不受实验对象侵染,确保周围环境不受其污染推行实验室安全规则,其目的在于防止实验室事故的发生:
①保护自己免于实验室的危害;②保护他人免于实验室的危害;③保护实验室财产和人身安全;④为了人性的尊严,生命和健康永远是无价的;⑤保护大家共同的环境,创建一个安全愉快的学习、研究环境
基因转导技术(14周)
基因转移技术
将外源基因转移到受体菌或细胞内,在细胞内实现转入基因的扩增或表达的技术。
它是重组DNA、基因功能研究、基因治疗的关键技术之一
方式:
转化感染转染
转化(Transformation):
将质粒或其它外源DNA导入处于感受态的宿主菌,并使其获得新的表型的过程
感染(Infection):
λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子,在体外包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,然后才能感染适当的细胞,并在细胞内扩增
转染(Transfection):
是转化和感染两个词构成的新词,指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的遗传表型的过程。
如电穿孔、磷酸钙共沉淀、脂质体等
基因敲除(knockoutofgene):
利用基因打靶技术,用无功能的外源基因转入细胞与基因组中同源序列进行同源重组,把具有功能的同源序列置换出来,造成功能基因的缺失或失活,这一技术叫基因敲除
基因敲进(knockinofgene):
利用基因同源重组,将外源有功能的基因转入基因组中不存在或已失活的细胞中与其基因组中同源序列进行同源重组,在细胞内获得表达,这一技术称为基因敲进
统称为基因打靶技术(Genetargeting)
常规转染技术可分为两大类:
瞬时转染:
外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析
稳定转染:
也称永久转染,外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也可能作为一种游离体(episome)存在。
外源DNA整合到染色体中概率很小,大约1/104转染细胞能整合,通常需要通过一些选择性标记,新霉素抗性基因,潮霉素B磷酸转移酶(HPH),胸苷激酶(TK)等反复筛选,得到稳定转染的同源细胞系。
基因转导技术的分类
化学方法:
磷酸钙沉淀法
DEAE-葡聚糖
1.磷酸钙沉淀法
目的基因与磷酸钙等物质混合,形成沉淀的DNA微细颗粒,吸附在细胞膜表面,由细胞内吞作用进入到靶细胞的细胞中,并整合到受体细胞基因组中,在适当条件下得以表达
方法简单,但转化效率低
Ca2(PO4)2+DNA→混合微细颗粒
2.DEAE-葡聚糖和聚季胺盐转染法
DEAE-葡聚糖或聚季胺盐均可同带负电的DNA分子聚合,形成复合物,与靶细胞作用而传递进入细胞内
DEAE-葡聚糖具有促进靶细胞摄取DNA的作用
物理方法:
脂质体介导的转染
电击转染法
基因枪技术
显微注射法
1.电穿孔法(electroporotion)
将细胞置于高压脉冲电场中,通过瞬间高压脉冲电压使细胞产生可逆性的穿孔(打孔),周围基质中的外源DNA可渗进细胞,进而表达
电击转染技术原理
电击转染技术是利用电转导仪在一定的电压、脉冲时间等参数下,将外源基因导入到细胞中的一种有效方法。
它是将细胞置于脉冲电场中,瞬间高压脉冲,这就有可能可逆性地在细胞膜上打出微孔(打孔)
具有操作简单,耗时少,节省成本等优点,但对细胞的损伤较大,对电压非常敏感,所以需要有一个合适的电压,既能使外源基因导入又尽可能让最少量细胞受损伤
影响电击转染的因素:
脉冲电压:
最适电压约在200伏左右
电导电路的电容:
电压脉冲等于电容量和缓冲液电阻的乘积。
缓冲液的盐度:
高盐度减小了电场的阻力,导致电脉冲的作用时间变短,产生的膜孔直径变小
DNA浓度:
DNA浓度上升,转导率上升
细胞数量:
合适电压与细胞的大小成反比
温度
2.脂质体介导的转染
脂质体是由双分子层组成的闭合囊泡,通过细胞的内吞或吞噬作用,将所携带的目的基因导入细胞中
脂质复合体没有免疫原性,组织毒性较小,而且转染脂质体也易于制备,因此脂质体转染已成为现今用于基因转移的最常用方法
阳离子脂质体介导转染的原理
将DNA或RNA包裹于脂质体内,然后经脂质体与细胞膜的融合或者细胞的内吞作用导入
阳离子脂质体的表面带有正电荷,其介导的转染是基于和阳离子脂质体之间的离子相互作用,DNA通过形成一个脂质体-DNA复合物再被细胞捕获并最后表达
脂质体复合物进入细胞的方式
吸附
细胞内吞作用介导的融合
直接与细胞质膜融合
两个关键性特点使得Lipofectamine2000的转染步骤快速简便
DNA-阳离子脂质体试剂的复合体可以直接加入到细胞培养基中
转染后不需要除去Lipofectamine2000试剂。
对于96孔板培养,不再需要提前一天进行细胞铺板,而可以直接在平板中制备复合物,然后将细胞悬浮液加入到复合物就可以了,这样进一步减少了转染时间
阳离子脂质体试剂转染注意事项
有血清时的转染在开始准备DNA和阳离子脂质体试剂稀释液时要使用无血清的培养基,因为血清会影响复合物的形成
培养基中的抗生素抗生素一般对于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。
降低了细胞的活性,导致转染效率低
脂质体介导转染与电穿孔技术合用
如果将脂质体-DNA复合物与电穿孔技术联用,将有助于提高基因传递的靶向性和肿瘤部位的基因摄取量
3.显微注射法(microinjection)
显微注射法(microinjection)是利用管尖极细(0.1至0.5μm)的玻璃微量注射针,将外源基因片段直接注射到原核期胚或培养的细胞中,然后藉由宿主基因组序列可能发生的重组、缺失、复制或易位等现象而使外源基因嵌入宿主的染色体内
体外利用打靶载体对ES细胞进行基因敲除或敲入,再将ES细胞显微注射入囊胚中,移植宿主
显微注射法转外源基因没有长度上的限制,目前已证明数百kb之DNA片段均可以成功产制出转基因动物。
其缺点是设备精密而昂贵、操作技术需要长时间的练习,以及每次只能注射有限的细胞。
4.“基因枪”技术
“基因枪”技术又称:
粒子轰击(particlebombardment),
高速粒子喷射技术(High-velocityparticlemicroprojection)
or基因枪轰击技术(genegunbombardment)
美国Comel大学生物化学系John.C.Santord等1983年研究成功,1987年应用
基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱动三类。
其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒(金粒或钨粒),将DNA吸附在表面,以一定的速度射进植物细胞(细胞、组织或器官),由于小颗粒穿透力强,故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组,实现稳定转化的
已在烟草、水稻、小麦、黑麦草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋葱、番木瓜、甜橙、葡萄等多种作物上成功;初步应用:
基因治疗和抗体制备
基因枪法(Biolistic-bombardment):
多用于植物细胞或体内直接转导
生物学方法:
逆转录病毒感染
腺病毒感染
慢病毒感染
是通过病毒为载体(vector),将外源基因通过重组技术与病毒重组,然后去感染受体细胞
目前最常用的病毒载体有:
逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等
用作载体的“病毒”都是经过人工改造的假病毒,需要在体外包装成具有感染性的完整病毒颗粒,才可感染宿主细胞
病毒感染细胞后,其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝,插入宿主染色体形成前病毒(provirus),前病毒转录产生的正链既是病毒RNA,再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒
完整的病毒颗粒具有插入宿主染色体必需的全套酶系统,适用于介导基因转移
目前应用最多的最成功的是逆转录病毒(retrovirus)
逆转录病毒载体优点
①高效感染宿主细胞,转染率可达100%
②病毒基因和所载的外源基因都可能表达
③宿主范围广,可同时感染大量细胞并长期存留
逆转录病毒载体缺点
①病毒基因容量有限,一般只能插入7kb左右片段
②病毒随机插入靶细胞基因组中,因病毒具有强大的启动子和增强子,能使插入点附近的基因过度表达或失活,插入外源基因可能不适当的表达
③逆转录病毒有潜在致病性,使受体细胞癌变
根据逆转录病毒的缺点,人们有目的地将其改造,保留其优点,除去癌基因和病毒基因,保留LTR和ψ包装信号
各转染方法与细胞相互作用的机制以及它们传递分子的类型
转染的方法
与细胞相互作用的机制
传递的分子
DNA
RNA
寡核苷酸
蛋白质
阳离子脂质体
通过电荷的相互作用与细胞吸附
√
√
√
√
磷酸钙共沉淀
共沉淀、细胞的吞噬作用
√
电穿孔
膜上打孔的形式
√
√
√
DEAE-葡聚糖
通过电荷的相互作用与细胞吸附
√
聚季铵盐
通过电荷的相互作用与细胞吸附
√
基因枪技术
膜穿刺
√
√
细胞核直接微注射
膜穿刺
√
√
√
√
基因转导技术在生物医学研究中的应用
研究基因功能
转基因动(植)物的制备
疾病的基因治疗
基因工程药物的生产
环境监测和环境净化
基因序列测定及序列分析(13周)
主要内容:
Ⅰ基因组、基因
Ⅱ核酸
Ⅲ核酸的结构与功能
Ⅳ核酸酶与限制性核酸内切酶
ⅤDNA序列分析(DNA一级结构测定)
Ⅵ基因组序列解析
Ⅶ基因组序列解析举例
ⅧRNA测序
Ⅰ基因组、基因
基因组就是一个物种中所有基因的整体组成。
任何一条染色体上都带有许多基因,一条高等生物的染色体上可能带有成千上万个基因,一个细胞中的全部基因序列及其间隔序列统称为基因组(genomes)。
基因组有两层意义:
遗传物质和遗传信息。
要揭开生命的奥秘,就需要从整体水平研究基因的存在、基因的结构与功能、基因之间的相互关系。
各物种基因组特点:
病毒基因组结构特点
1、基因组相对较小且大小相差较大。
2、不同病毒只含一种不同结构核酸。
3、由连续的或不连续的多核苷酸链组成。
4、基因重叠(包含型、交叉型)。
5、大部分用来编码蛋白质(相关基因簇、单倍体基因组、与寄主基因组结构特征相似)。
细菌基因组结构特点
1、染色体基因组通常只由一条环状双链DNA组成。
2、具有操纵子结构。
3、重复序列少。
4、内含子所占比例小。
5、具有编码同工酶的同基因。
6、基因不重叠。
7、具有多种功能的识别区域。
8、在基因或操纵子序列末端具有特殊终止序列。
真核生物基因组结构特点
1、体细胞的基因组是双份的
真核生物基因组DNA与蛋白质结合形成染色体,储存于细胞核内,除配子细胞外,体细胞内的基因组是双份的(即双倍体),即有两份同源的基因组。
2、转录产物是单顺反子
即一个结构基因转录、翻译成一个mRNA分子,一条多肽链。
3、存在大量重复序列
即在整个DNA中有许多重复出现的核苷酸顺序,重复序列长度可长可短,短的仅含2个核苷酸,长的多达数百、乃至上千。
重复频率也不尽相同。
高度重复序列:
长度:
几个~几千个bp;拷贝数:
几百个~上百万个首尾相连,串联排列,集中分布于染色体的特定区段(如端粒,着丝粒等),也称卫星DNA。
序列中G-C含量高于DNA的其它结构。
中度重复序列:
一般分散于整个基因组中;长度和拷贝数差别很大。
rRNA、tRNA、组蛋白等的基因,大多为中度重复序列。
在中度重复序列中,有一类可移动的片段,称为逆转座子。
单拷贝或低度重复序列:
在整个基因组中只出现一次或很少几次的核苷酸序列。
在真核细胞中,除组蛋白以外,其它所有蛋白质都是由DNA中这种单拷贝序列决定的。
该序列大小不等,每一个顺序决定一个蛋白质的结构,称之为结构基因。
动物中约占50%;植物中约占20%,因此所含信息量最大。
在人基因组中占约60~65%。
4、有很多不编码区域
5、基因是不连续的
在真核生物结构基因的内部存在许多不编码蛋白质的间隔序列(interveningsequences),称为内含子(intron),编码区则称为外显子(exon)。
内含子与外显子相间排列,转录时一起被转录下来,然后RNA中的内含子被切掉,外显子连接在一起成为成熟的mRNA,作为指导蛋白质合成的模板。
6、具有多个复制起点
基因
DNA上具有特定功能的一个片断,负责一种特定性状的表达。
一般来讲,一个基因只编码一个蛋白质。
是遗传信息的物理和功能单位,包含产生一条多肽链或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。
基因分类:
编码RNA的基因,如rRNA、snRNA基因等。
编码蛋白质的基因。
DNA:
两条互补链。
由ATCG4个碱基形成的字符串。
RNA:
单链结构。
由AUCG4个碱基形成的字符串。
蛋白质:
一条或多条肽链。
每个肽链是由20种氨基酸形成的长链,即20个字母形成的字符串。
翻译:
每3个碱基翻译成一个氨基酸。
Ⅱ核酸
一、核酸的概念和重要性
DNA是主要遗传物质:
存在细胞核(95%)和线粒体、叶绿体(5%)中
RNA的功能多样性:
存在胞质(90%)和细胞核(10%)中
核酸的概念:
核酸是酸性的大分子物质,在活细胞中与碱性蛋白结合,以核蛋白形式存在。
核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)两类,DNA所含核苷酸分子数比RNA大得多。
DNA为线性、双螺旋分子或闭合环状分子。
RNA分为三个类型,即核蛋白体RNA(rRNA,占总RNA80%)、信使RNA(mRNA,占总RNA5%)和转移RNA(tRNA,占总RNA15%)。
脱氧核糖核酸和核糖核酸异同的对比
RNA
DNA
组成
戊糖
核糖
脱氧核糖
碱
基
A、G、C
A、G、C
U
T
磷酸
Pi(磷酸二酯键)
Pi(磷酸二酯键)
结构
单链,部分碱基互补,局部双螺旋,三叶草形等
双链,碱基互补,
双螺旋形
分布
细胞核(核仁),细胞质(线粒体、核蛋白体、胞液)
细胞核(染色质)细胞质(线粒体)
生物功能
遗传信息表达,反转录,直接参与蛋白质的生物合成
遗传的物质基础,
负责遗传信息
贮存,发布,转录
核酸重要性:
DNA是遗传的物质基础,负责遗传信息的贮存和发布,遗传基因就是DNA链上的若干核苷酸所组成的片段。
RNA负责遗传信息的表达,直接参与蛋白质生物合成,转录DNA所发布的遗传信息,并将之翻译给蛋白质,使生命机体的生长、发育、繁殖和遗传得以继续进行。
核酸类物质RNA的重要功能:
RNA种类
功能
mRNA
将信息从基因传递到蛋白质
tRNA
携带活化氨基酸参与蛋白质生物合成
rRNA
构成核蛋白体(蛋白质合成场所)
SnRNA
参与mRNA前体剪接加工
M1RNA
RNaseP的催化单体
端粒酶RNA
端粒合成的模板
引物RNA
起始DNA复制
TsRNA
蛋白质分泌复合物中的一部分
二、核酸的化学组成及其基本结构单位核苷酸
元素组成:
C、H、O、N、P
P元素的含量较多并且恒定,约占9~11%。
因此可通过定磷法测定核酸含量。
碱基(嘌呤或嘧啶)、戊糖(核糖或脱氧核糖)
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