可降解蛎菜多糖细菌的筛选及发酵工艺研究.docx
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可降解蛎菜多糖细菌的筛选及发酵工艺研究
可降解蛎菜多糖细菌的筛选及发酵工艺研究
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可降解蛎菜多糖细菌的筛选及发酵工艺研究
摘要
蛎菜多糖是一种由木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸组成并且含有硫酸基的聚阴离子糖链。
这些年,因为它的特殊结构、很好的生物活性和广泛的生物来源,受到了越来越多人的关注。
近年来,在能源危机日趋严重的大环境下,海洋资源的开发,蓝色经济的发展成为各国实现可持续发展的战略选择,尤其以海藻多糖及其降解产物——特异性海藻低聚寡糖为原料的海洋药源和食药同用的保健原料的开发和功能研究近年来受到广泛关注。
蛎菜多糖降解酶是指可以将蛎菜多糖降解为小分子寡糖的一种酶,该酶产生菌的首次发现是对现有海藻工具酶种类的丰富和完善。
本论文对蛎菜多糖降解酶产生菌的筛选、鉴定、发酵条件优化等做了系统的研究。
(1)通过初筛,从24株细菌种筛选出可降解蛎菜多糖的细菌。
(2)进行复筛,采用DNS测酶活的方法筛选出高产蛎菜多糖降解酶的菌株。
(3)对高产蛎菜多糖裂解酶菌株进行形态学、分子生物学分析。
(4)研究接种量、发酵时间等对发酵液中菌量、还原糖含量的影响。
该酶在研究蛎菜多糖的构效关系和实现蛎菜的高值化利用有广泛前景,并且该酶可用于制备低分子量蛎菜寡糖。
因此,获得高活力产酶菌株并完成酶地性质研究具有重要的理论和现实意义。
利用海洋微生物代谢降解海藻生产海藻低聚糖已成为继化学降解后更为有效的研究手段,且酶法降解具有专一性强、寡糖得率高且条件温和等优点。
关键词:
蛎菜多糖,酶活,筛选,鉴定
ulvaconglobatakjellmpolysaccharidedegradation
bacteria
Abstract
UlvaconglobatakjellmpolysaccharideiscomposedofaratmodelofLiTang,xylose,glucuronicacidandpolyanioncontainingsulfatesugarchain.Inrecentyears,moreandmorepeoplepayattentiontoitbecauseofitsspecialstructure,goodbiologicalactivityandawiderangeofbiologicalsources.UlvaconglobataKjellmpolysaccharidedegradingenzymesthatcanbeUlvaconglobataKjellmpolysaccharidedegradationforsmalloligosaccharidemoleculesofanenzyme,theenzymeproducingbacteriawasfirstdiscoveredistheenrichmentandperfectionofexistingseaweedtoolenzymespecies.Thescreeningofthestrains,identification,optimizationoffermentationconditionsofulvaconglobatakjellmpolysaccharidedegradingenzymeswerestudied.
(1)byscreening,24strainsofbacteriawerescreenedfromabiodegradableulvaconglobatakjellmbacterialpolysaccharide.
(2)screeningtestmethod,enzymeactivityscreeninghigh-yieldulvaconglobatakjellmpolysaccharidedegradingenzymestrainsbyDNS.
(3)Analysisofmorphologyandmolecularbiologyofhigh-yieldulvaconglobatakjellmpolysaccharidelyasestrains.
(4)Effectsofinoculationamountandfermentationtimeontheamountofbacteriaandreducingsugarinfermentedbrothwerestudied.
TheenzymeinthestudyofUlvaconglobataKjellmpolysaccharidestructureeffectrelationshipandUlvaconglobataKjellmhighvalueutilizationhasbroadprospects,andtheenzymecanbeusedforthepreparationoflowmolecularweightoligosaccharidesUlvaconglobataKjellm.Comparedwiththecurrentphysicaldegradationandchemicaldegradationmethod,enzymatichydrolysismethoddoesnotrequirecomplexexperimentalequipment,anditwillnotcausepollutiontotheenvironment.Therefore,itisofpracticalsignificancetoobtainhighactivityenzymeproducingstrainsandtostudythepropertiesoftheenzyme.
Keywords:
ulvaconglobatakjellmpolysaccharide,enzymeactivity,screening,identification
目录
第1章绪论1
1.1海藻寡糖的生理活性1
1.2海藻多糖的酵解方法2
1.2.1海藻多糖降解酶高产菌株的选育3
1.2.2海藻多糖降解酶的发酵生产3
第2章可降解蛎菜多糖材料与方法5
2.1实验材料5
2.1.1样品采集5
2.1.2主要试剂5
2.1.3主要仪器和设备5
2.1.4蛎菜多糖的制备6
2.1.5培养基6
2.1.6分离自海藻表面的细菌24株6
2.2实验方法7
2.2.1可降解蛎菜多糖细菌的初筛7
2.2.2可降解蛎菜多糖细菌的复筛7
2.2.3酶活测定方法7
2.2.4菌落鉴定7
2.2.5蛎菜工艺的研究8
第3章结果与讨论9
3.1可降解蛎菜多糖的初筛9
3.2可降解蛎菜多糖的复筛9
3.3菌株鉴定与命名11
3.3.1形态学鉴定11
3.3.2分子生物学鉴定11
3.4蛎菜发酵工艺的研究12
3.4.1料液比及发酵时间对发酵上清液中还原糖含量之菌量的影响12
3.4.2不同均质时间对发酵上清液中还原糖和菌量的影响13
参考文献15
谢辞16
第1章绪论
蛎菜(Ulvaconglobatakjellm)属绿藻门石莼目石莼科植物,俗名猪母菜,主要生长在中潮带和高潮带的岩石上或小石沼中[1]。
藻体为绿色的片状,膜质为两层细胞,细胞长方形下部随着藻体增厚,细胞呈棱柱形,长为宽的1.5到2倍。
主要产于海礁、浪岗、普陀山、象山港,是福建沿海地区产量最高的藻类。
蛎菜中有丰富的优质蛋白,还含有丰富的维生素、矿物质,和大量的多糖类成分,在民间长期作为食药用藻类。
石莼糖主要作用是防治胆固醇升高、防止血脂升高、防止病毒入侵、防止血液凝固以及抵抗肿瘤。
近年来,能源危机越来越严重,在这样的环境,海洋资源的开发,各国为实现可持续发展的战略选择蓝色经济发展,尤其以海藻多糖及其降解产物——特异性海藻低聚寡糖为原料的海洋药源和食药同用的保健原料的开发和功能研究近年来受到广泛关海藻胶低聚寡糖的生物功能很多,我们要学会利用海洋微生物代谢降解,海藻生产和海藻低聚糖已成为更为有效的研究手段,酶法降解的优点是寡糖得率高、专一性强、且条件温和。
1.1海藻寡糖的生理活性
寡糖的构成主要是五碳糖或六碳糖,其味甜,有效能值低,它的热稳定性受酸碱度影响比较大,中性条件的时候,120℃条件下仍然处于稳定状态,在酸性条件下印H=3)当温度达到70℃以上即易分解[2]。
一般在农业生产中称为寡糖的聚合度在2到30,由于寡糖的单糖组成不同,可分为均寡糖(Botholigosaccharides)和杂寡糖(Miscellaneousoligosaccharides)两类,均寡糖(Botholigosaccharides)是由一种单糖聚合而成,如环糊精、麦芽糖等,杂寡糖(Miscellaneousoligosaccharide)是由两种或两种以上单糖聚合而成,如蔗糖,棉籽糖等[3]。
寡糖可分为普通寡糖和功能性寡糖两类,普通寡糖,动物吃了之后可以消化并且吸收,对肠道有益菌的作用。
蔗糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精和麦芽寡糖等是功能性寡糖,动物吃了之后消化不了[4]。
延缓衰老、防治龋齿、有利于降低胆固醇、抑制肥胖等作用是功能性寡糖独特的生理特性,在植物上可以进行特殊的代谢调节,可以让相关基因进行表达。
现在功能性寡糖在我们生活中是一种新型物质,在我们的生活,医学,生物、养殖等各种方面的应用都受到大家的关注,对基因工程(geneengineering)、蛋白质工程(proteinengineering)、糖工程(sugarengineering)等的利用可以实现现代生物技术手段,并涉及了各种学科,已经在国际上发展了,而且应用于食品、医药、饲料、肥料各领域。
在农业上,寡糖可以从很多地方得到、他可以调节植物在生活中的发展并且可以诱导他们长得更好、可以增强植物的生长能力,因为这些独特的功能,它引起了越来越多的人关注,日前常应用在生活中的寡糖种类有壳寡糖、葡聚寡糖、寡聚半乳糖醛酸等[5]。
从研究中我们知道如果寡糖的聚合度不一样,那么他们生理活性和功能就会不一样,所以我们知道海藻胶的活性和它的聚合度的联系非常紧密,如果我们想要了解海藻酸钠寡糖的生理活性,就一定要先得到它的单糖,此外,如果我们想要进一步了解海藻胶寡糖的生理活性,就必须对它进行分离分析。
近年来对低分子海藻胶寡糖的研究引起了越来越多人的关注,2001年,宫晓黎等报道了一些低分子海藻胶寡糖对外周血细胞的影响很好,对人的身体很有益处[6]。
在化疗的过程中的肿瘤病人,就算肿瘤细胞被杀死了,可是他的机体正常的细胞也会受到损伤,尤其骨髓造血细胞,骨髓造血细胞如果减少了,就会直接让外周血细胞减少,但是海藻胶寡糖不一样,尤其是寡聚甘露糖醛酸可以让骨髓造血细胞明显减少,这样会让外周血细胞的数量更加明显增加,因此我们可以看出海藻胶寡糖对抗肿瘤是非常有帮助的,可以利用它作为抗肿瘤的辅助药,它在抗肿瘤上有重要的意义。
2002年Iwamoto等报道海藻胶经酶解获得的寡糖对人单核细胞产生细胞毒素的影响,经过研究发现经过降解得到的海藻胶寡糖相比没有经过降解的海藻胶寡糖对人的白血病细胞抑制效果更好,对病菌的抵抗能力也大大加强了。
海藻胶寡糖可以让人白血病U一937细胞慢慢的发生凋亡变化,这可以说明酶解后海藻胶寡糖具有类似casPase一3活性。
这些都是海藻胶寡糖对抗肿瘤作用的研究,为了能让它成抗肿瘤的辅助药奠定了基础,抗肿瘤作用机理的研究,对相关药物的开发将具有十分重要的意义。
海藻胶寡糖(Alginateoligosaccharades)能很好的促进生长,Iwasaki等对海藻胶寡糖(Alginateoligosaccharades)对葛芭的促根生长活性作了研究,研究表明二糖(disaccharide)到八糖(octasaccharide)的混合物能明显的促进葛芭根生长,各种聚合度寡糖(Polymericoligosaccharides)由分离得到,发现三糖、四糖、五糖及六糖(M或G)具有更高的促根生长活性。
Kawada等研究了酶解海藻胶寡糖对角质细胞生长的影响,海藻胶寡糖可以让角质细胞长得很快,它与牛垂体提取物(BPE)效果感觉是差不多的。
Natsume报道海藻胶寡糖对很多植物的生长时间都有延迟作用,可以让植物生活得更长一些时间,进一步研究发现酶解产物中分离得到的三糖(M或G)促大麦根生长的活性卧是最显著的[7]。
1.2海藻多糖的降解方法
海藻多糖拥有优越的生物活性,在应用过程中,较高的分子量和较大的粘度和较低的溶解能力是海藻多糖自身拥有的,它会导致机体对活性糖链吸收性较差,也会大大降低了它的应有生理功能[8]。
因此,寻找既可以降低多糖的分子量,又能最大程度上保持糖链结构完整性的方法受到广泛关注。
目前,海藻多糖降解的研究方法主要是
(1)酸法降解:
采用在水解条件为90C、70min、5%硫酸、4.5%料水比时,糖的转化率为30%,降解产物主要是用于制备乙醇的单糖。
(2)微波辅助酸解法:
采用这种方法制备了低分子量的海藻糖链(糖链都表现出了较强的抗氧化活性,同时研究还发现分子量越小的糖链的抗氧化活性越高。
(3)抗坏血酸结合过氧化氢法:
10mg/ml的海藻多糖中加入10mM抗坏血酸、10mM过氧化氢搅拌两个小时可得到低分子量的海藻多糖链,虽然酸法降解简单易行,但研究表明降解后的寡糖。
相对于化学法和物理法,工具酶法制备功能寡糖有其潜在优势:
(1)高效、稳定的反应过程,底物专一性,反应速率快是酶解法所具有的,定向可控的产物聚合度,利用酶制剂的酶学性质特点定点水解糖苷键,可以定向制备不同寡糖片
(2)酶解产物回收的东西比较多、均一度也是非常好的、可以在下游分离和纯化(3)它的工艺非常简单、条件也很好,因为较好的环境特性是酶解过程所具有的,而且还把海藻糖链(trehalosechain)的活性基团较好的片段给保留下来了[9]。
1.2.1海藻多糖降解酶高产菌株的选育
海藻多糖降解酶(Algalpolysaccharidedegradingenzyme)高产菌株的获取方法[10]
(1)利用物理因素(physicalfactor),化学因素(chemicalfactor)或者物理化学(physicalchemistry)复合诱变方法,然后在通过高效筛选方法来获得遗传特性稳定的酶活力比较高的变异菌株,常用的诱变剂有紫外线诱变,甲基磺酸乙酯等化学(chemical)诱变,先在平面皿水解圈和变色圈进行初筛(preliminaryscreening),经过摇瓶发酵测酶活力的进行复筛(secondaryscreening),近年来,很多国内外的国家的实验室都采用化学(chemical)诱变的办法,获得分泌酶活力较高的酶活力(alginase)产生菌和褐藻胶霉(agarase)产生菌,它的酶活力和野生型菌株比起来有很大幅度的提高[11]。
(2)海藻多糖降解酶(Algalpolysaccharidedegradingenzyme)的产酶条件的优化,可以把产酶稳定性和酶活的能力给提高了,为工业化发酵实验的扩大打下坚实的基础[12]。
(3)分子生物学技术(Biotechnology)的利用,我们可以把海藻多糖降解酶的基因进行copy,把它转化到大肠杆菌、酵母等寄主中进行复制(convey),可以促进海藻多糖降解酶的大量生产。
1.2.2海藻多糖降解酶的发酵生产
怎么把海藻多糖降解酶的实验室摇瓶发酵水平提高是我们值得考虑的,再这样的基础上,把发酵实验进行扩大研究,目前需要解决的问题是海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)发酵生产及海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)酶制剂产品的开发,解决这个问题的办法是[13]
(1)提高发酵酶活的主要途径是选育海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)的高产菌株,这样可以效降低海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)和产品的成本,并且可以提高产品质量。
(2)为了使海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)高产菌株的产酶能力得到充分的表达,我们要把培养基的成分和产酶条件进行优化[14]。
(3)开展海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)产生菌发酵动力学的研究,建立起不同菌株或者酶种的发酵动力学模型根据海藻多糖降解酶(algalpolysaccharidedegradingenzyme)产生菌的发酵动力学模型,对该菌株发酵产酶过程进行控制,使发酵产酶能力得到进一步的提高[15]。
第2章材料与方法
2.1实验材料
2.1.1样品采集
蛎菜的主要成分为碳水化合物,蛎菜表面富集的微生物有可能利用这些大分子物质。
2015年7月份从福清海边采集新鲜蛎菜。
2.1.2主要试剂
酵母提取物,K2HP04,NaN03,MgS04,CaCl2,NaCl,琼脂均为国产分析纯;16SrDNA细菌通用引物,dNTPMix,10×TaqBuffer(各2mM),5U/μlTaqDNA聚合酶,25mMMgCl2,TAE电泳缓冲液,琼脂糖均由上海生工提供;PCR试剂盒2×PowerTaqPCRMasterMix购自BioTeke公司;10×TBE电泳缓冲液贮存液:
108gTris碱、55g硼酸、40mL0.5mol/LEDTA(pH8.0),加超纯水定容至1L;EB工作液(10mg/mL):
在20mL超纯水中溶解0.2g溴化乙锭,混匀后于4℃避光保存。
2.1.3主要仪器和设备
表2-1主要仪器和设备说明表
名称
型号
厂家
冰箱
BCD-227e
海信(北京)电器有限公司
电子天平
TE601-L
德国泰多利斯公司
电热鼓风干燥箱
DHG-9123A
上海精宏实验设备有限公司
KA迷你振荡器
THZ-82
上海人和科学仪器有限公司
移液枪
0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、100-1000μL
上海大龙医疗设备有限公司
超净台
SW-CJ-IFD型
上海博讯实业有限公司
手提式压力蒸汽灭菌锅
YXOSG41280型
上海医用核子仪器厂
微波炉
MZ-2070MGZ
青岛海尔微波制品有限公司
小型高速离心机
THL-16L
上海安亭科学仪器厂制造
高速离心机
CF16RXⅡ
日立公司
梯度热循环仪
TC-512型
杭州博日科技有限公司
续表2-1
名称
型号
厂家
垂直板电泳仪
凝胶成像分析仪
纯水机
DYCZ-24D
JS-380C型
QYSW-10B
北京市六一仪器厂
上海美谱达仪器有限公司
重庆前沿水处理设备有限公司
2.1.4蛎菜多糖的制备
蛎菜粉
(80g,蛎菜洗净,烘干,粉碎机粉碎过60目筛)
热水浸提(6L,90℃,7h)
离心取上清(6000r/min,10min)
真空浓缩(45~55℃)
95%乙醇沉淀
沉淀物溶于水(粗多糖)
2.1.5培养基
初筛培养基:
蛎菜多糖6g,氯化钠10g,硝酸钠1g,硫酸镁0.5g,磷酸氢二钾1g,氯化钙0.1g,琼脂15g,pH自然,水1000ml。
复筛培养基:
蛎菜多糖6g,氯化钠10g,硝酸钠1g,硫酸镁0.5g,磷酸氢二钾1g,氯化钙0.1g,pH自然,水1000ml。
LB培养基:
酵母提取物5g/L,细菌学蛋白胨10g/L,NaCl10g/L,pH7.4,水1000ml。
蛎菜半固体培养基:
蛎菜粉(蛎菜晒干,研磨粉碎,过60目筛),适当比例的蒸馏水。
2.1.6分离自海藻表面的细菌24株
表2-2
菌种编号
种属
1.1/1
Bacillussp.
1.1/6
Bacillussp.
1.1/2--1.1/3
Roseobactersp.
1.1/4
Microbulbifervariabilisstrain
1.1/5
UnculturedbacteriumcloneS251644
1.0/1--1.0/3
Vibrio
3.0/1--3.0/4
Vibrio
3.1/2--3.1/3
Vibrio
3.1/6--3.1/9
Vibrio
3.1/1
Alteomonassp.
续表2-2
菌种编号
种属
3.1/4
Alteomonassp.
3.3/2
3.3/1
3.3/3
3.1/5
3.2/1--3.2/4
Enterobacter
UnculturedKlebsiellasp.
Stenotrophomonasmaltophiliastrain
Enterobacter
Enterobacter
2.2实验方法
2.2.1可降解蛎菜多糖细菌的初筛
采用以蛎菜多糖为唯一碳源的选择性培养基,从实验室保存的24株海洋细菌中筛选可降解蛎菜多糖的细菌。
2.2.2可降解蛎菜多糖细菌的复筛
将2.2.1中筛选获得的细菌接种到蛎菜多糖发酵培养基,采用DNS测定酶活的方法筛选获得高产蛎菜多糖降解酶的菌株。
2.2.3酶活测定方法
在10ml比色管中加入1ml5‰(w/v)的蛎菜多糖,40℃水浴预热5min。
加入1ml酶液混匀,在40℃下恒温反应30min,以灭活的酶液加底物为空白对照组。
还原糖的测定采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法:
加入1mlDNS摇匀终止反应,沸水浴5min后流水冷却,定容至10ml,在波长540nm下测吸光度。
酶活的定义:
每分钟催化的蛎菜多糖产生1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个酶活力的单位
2.2.4菌种鉴定
菌落形态观察:
在培养基平板上仔细察看菌株的形态。
细菌染色:
利用革兰氏染色(制片→初染→媒染→脱色→复染),在光镜下观察菌体形态。
分子生物学鉴定——16SrDNA法
(1)DNA提取
将分离纯化的菌株接到液体培养基中,在28℃培养24小时,取过夜培养基的菌液1ml于PCR反应管,离心(1000r/min,1min),
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