心肌梗死患者外周血单个核细胞基质金属蛋白酶9mRNA的表达.docx
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心肌梗死患者外周血单个核细胞基质金属蛋白酶9mRNA的表达
心肌梗死患者外周血单个核细胞基质金属蛋白酶9mRNA的表达
(作者:
___________单位:
___________邮编:
___________)
【摘要】目的:
探讨单个核细胞(PBMC)中基质金属蛋白酶9(MMP9)在心肌梗死(AMI)病理生理机制中的作用。
方法:
用电化学发光法检测30例AMI患者与对照组30例血浆肌钙蛋白T(cTnT)的含量;用ELISA法测定血浆MMP9的含量及RTPCR检测单个核细胞中MMP9mRNA的表达水平。
结果:
AMI患者在6h及1周内MMP9的含量分别为(697±143)ng/mL,(597±102)ng/mL较对照组的(342±165)ng/mL显著增高(P0.05),与cTnT的变化差异无统计学意义(P0.05),且呈正相关(r=0.82,P0.05)。
AMI患者单个核细胞MMP9mRNA表达显著增强。
结论:
AMI患者PBMC处于炎性状态,MMP9mRNA表达增强,并可能由此导致血浆MMP9水平增高。
监测血浆MMP9的水平有可能成为了解AMI发生发展的一个重要诊断指标,为AMI的治疗和预后提供临床依据。
【关键词】心肌梗死;基质金属蛋白酶9;单个核细胞;肌钙蛋白TMatrixmetalloproteinase9mRNAexpressionofperipheralbloodmononuclearcellinpatientswithacutemyocardialinfarctionRONGHong1,SANGShenggang2(1.DepartmentofStomatology;2.ClinicalLaboraryDepartment,AffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China)[ABSTRACT]Objective:
Toinvestigatetheroleofmatrixmetalloproteinase9(MMP9)inthedevelopmentofacutemyocardialinfarction(AMI).Methods:
TheplasmatroponinTofboth30acutemyocardialinfarctionsand30controlcasesweremeasuredbyautomaticelectrochemiluminescenceanalysis;plasmaMMP9levelswerequantifiedwithenzymeimmunoassaymethod(ELISA);andmRNAexpressionofMMP9extractedfrommononuclearcellweredetectedbyRTPCRmethod.Results:
MMP9levelsoftheAMIgroupwithin6handduringthefirstweekwere(697±143)ng/mLand(597±102)ng/mLseparately,bothofwhichweresignificanthigherthan(342±165)ng/mLofthecontrolgroup(P0.05).TherewasapositivecorrelationbetweenthelevelsofMMP9andcTnT(r=0.82,P0.05)thoughnosignificantdifferencewasfound.TheMMP9mRNAexpressionswereobviouslyamplifiedinperipheralbloodmononuclearcells.Conclusion:
ThestudydemonstratsthattheconcentrationandexpressionofMMP9mRNAaresignificanthigherinpatientswithmyocardialinfarctionthanthatincontrolgroup.TheactivatedperipheralbloodmononuclearcellsandenhancedMMP9mRNAexpressionmayresultintheincreaseoftheMMP9concentrationinplasmaofthepatient.Thereby,theMMP9levelofplasmacanbevaluedasanimportantindexforthediagnosis,treatmentandprognosisofacutemyocardialinfarction. [KEYWORDS]Matrixmetalloproteinase9;Acutemyocardialinfarction;Mononuclearcell;TroponinT 心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)是严重危害人类健康的疾病,冠状动脉粥样硬化斑块破裂与触发血栓形成是导致AMI的一个重要机制[1]。
基质金属蛋白酶9(matrixmetalOproteinase9,MMP9)是引起斑块破裂的主要内在因素之一。
AMI患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)处于炎性状态,PBMC在病灶组织内皮下的浸润、聚集,是动脉粥样硬化及AMI等疾病发生的早期重要环节。
有研究表明[2],在粥样硬化斑块及AMI组织,浸润的PBMC大量表达MMP9,MMP9能特异性地与细胞外基质相结合、降解细胞外基质,导致斑块不稳定,易形成血栓,发生AMI,并加重继发性心肌损害。
本文采用细胞培养及分子生物学技术,检测2007年10月~2008年12月海南医学院附属医院心内科AMI30例患者单个核细胞MMP9表达水平的变化,探讨单个核细胞MMP9在AMI病理生理机制中的临床意义。
1材料与方法 1.1仪器与试剂 全自动电发光分析仪(HITACHIElecsys2010),cTnT(Roche),MMP9(上海森雄科技实业有限公司),自动酶标仪(美国宝特ELx800型),自动洗板机(芬兰LabsystemsDragon),pUCMixMarker(上海生物工程公司),MMP9引物、βactin引物(大连宝生物有限公司),GeneAmPPCRSystem2400(美国PERKINELMER),TGL16WS台式高速离心机(长沙湘仪礼离心机仪器有限公司),电泳仪(北京市六一仪器厂DYY7B型),凝胶成像系统(德国HerolabUVT28)。
1.2资料来源 本组AMI患者30例,男性18例,女性12例,平均年龄(58.6±7.5)岁,全部符合临床诊断标准[3]。
心肌梗死部位包括前壁梗死13例,间壁梗死10例,下壁梗死5例,侧壁梗死2例。
对照组来自同期海南医学院附属医院体检中心体检者30例,男性19例,女性11例,平均年龄(56.4±5.2)岁。
所有对象应排除急慢性感染性疾病、肝病、脑血管疾病、高血压、高脂血症、肾病、糖尿病及其他自身免疫性疾病。
AMI患者分别在6h内、治疗1周内、临出院时静脉采血,正常对照组采空腹血1次,均分2管,1管用于PBMC分离培养,1管用于cTnT、MMP9的测定。
1.3实验方法
(1)PBMC的分离(Ficoll法):
无菌抽取静脉血2ml,去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀,先作白细胞计数,然后加入2mLHanks(或PBS)溶液进行对倍稀释,混匀。
用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2mL淋巴细胞分离液的试管中[血液∶Hanks(PBS)液∶淋巴细胞分离液的比例为1∶1∶1],沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上,并与分离液形成明显的界面。
经水平式离心2000r/min×20min,小心取出试管。
用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层,用Hanks(PBS)溶液洗涤两次,每次离心1500r/min×10min。
弃上清,加RPMI1640培养液1mL混匀,取少许进行细胞计数及活力测定。
将淋巴细胞悬液用RPMI1640培养液配成相应的细胞浓度备用。
(2)PBMC培养:
细胞均置于含有10%FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的含5%小牛血清的RPMI1640培养液中于37℃,5%CO2培养箱中培养7d,收集PBMC进行RTPCR,测定MMP9mRNA的表达。
1.4单个核细胞MMP9mRNA逆转录聚合酶链反应测定(RTPCR)
(1)MMP9引物设计:
上游5’AGACCTGAGAACCAATCTCAC3’,下游5’GGCACTGAGGAATGATCTAA3’;βactin引物设计:
上游5’ATCTGGCACCACACCTTCTACAATGAGCTGCG3’,下游5’CGTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTGC3’。
(2)MMP9RNA提取及RTPCR操作严格按照试剂操作说明进行。
(3)RTPCR鉴定及电泳分析:
取MMP9RTPCR扩增产物10μL,溴酚蓝上样缓冲液2μL,于1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.5mg/L溴化乙锭),紫外灯下观察,凝胶成像分析系统分析结果、摄像。
1.5统计学处理 数据用SPSS11.5统计软件处理,采用(±s)表示,两组间计量资料均数差异显著性比较用studentt检验,以P0.05为差异有统计学意义,有关指标作直线相关分析。
2.结果 2.1AMI患者肌钙蛋白、MMP9含量变化 AMI患者在6h内肌钙蛋白、MMP9的含量均显著增高,随着治疗好转而下降;与对照组相比,血浆肌钙蛋白、MMP9在6h内、1周内均显著增高,差异均有统计学意义(P0.05);而在恢复期则显著降低,与正常对照组相比无统计学意义(P0.05)。
MMP9的含量变化与肌钙蛋白相比无显著性差异(P0.05)并呈现正相关关系(r=0.82,P0.05)(表1)。
表1AMI组及对照组间肌钙蛋白、MMP9比较注:
▲、★VS对照组P0.05,▲VS★P0.05。
2.2AMI患者血清MMP9mRNA的表达 用RTPCR测定AMI患者及对照组MMP9mRNA的表达。
经凝胶成像系统分析,MMP9mRNA在6h的A值为4759,1周内A值为4258,恢复期A值为2846,对照组A值2651,βactin的A值为3468。
AMI患者单个核细胞MMP9mRNA的表达在6h内MMP9/βactin及1周内比值均显著增强,分别达1.37(4759/3468)和1.23(4258/3468),与对照组0.76(2651/3468)相比差异有统计学意义(P0.05)。
恢复期则显著降低0.82(2846/3468),与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)。
3讨论 基质金属蛋白酶(MMPs)是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族,目前已发现的MMPs家族成员有20多种,根据其底物的特异性和结构的差异分为四大类:
胶原酶,明胶酶,基质水解酶,膜型MMPs。
MMP9是明胶酶中的一种,是MMPs中最常见的酶之一,参与了血管的再生、炎症反应等病理过程[4]。
近年研究表明,MMP9的表达及活性增强参与了AMI的发生及左室重塑[5]。
本实验研究了AMI发生发展过程中MMP9含量变化及MMP9mRNA表达情况。
循环血液中的PBMC与内皮细胞黏附,在血管壁中迁移、吞噬脂质衍化为巨噬泡沫细胞的过程中可分泌大量的MMP9。
病理研究显示MMP9是一种影响粥样斑块不稳定的主要的基质金属蛋白酶[6],在AMI中6h内MMP9即有显著增高,1周内虽有所下降,但仍高于对照组,表明MMP9在AMI早期就有大量释放,并随病情的好转而降低,与Etoh[7]的报道相一致。
本研究显示MMP9在AMI的发生、发展中的变化规律与cTnT相一致,呈良好的正相关关系。
目前cTnT是公认的诊断AMI的酶学指标,进一步说明MMP9在AMI的发生发展中起着极其重要的作用。
Kalela等[8]观察血浆MMP9水平与冠状动脉造影结果,提出MMP9与病情呈正相关,MMP9水平越高,狭窄越严重,提示血浆MMP9可以作为动脉粥样硬化及AMI等病情活跃的标志物,并可作为随访指标。
动脉粥样硬化是全身性的系统疾病,不是局部孤立的病灶,血浆MMP9可来源于粥样斑块内的合成分泌,亦可能来源于循环血液中的PBMC[9],结合本研究结果,AMI患者PBMC表达MMP9mRNA,并可由此导致血浆MMP9水平增高。
MMP9参与动脉粥样硬化及AMI的病理过程,使粥样斑块易脱落,形成血栓,并在AMI发生后,使炎性细胞由血循环浸入缺血心肌组织,加重了继发性心肌损伤及之后的心肌重塑。
在AMI患者,血浆MMP9可来源于PBMC。
因此,在AMI预防和治疗中,抑制MMP9mRNA的表达,应该成为新的靶点及重要的有效途径。
快速检测血浆中MMP9的含量有可能成为AMI诊断的指标之一。
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