第六章 色谱分析法概述.docx

第六章 色谱分析法概述.docx

《第六章 色谱分析法概述.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章 色谱分析法概述.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

第六章色谱分析法概述

第六章　色谱分析法

第一节　色谱法的来源与特点

　　一、色谱法的来源

　　色谱法（chromatography）早在1903年由俄国植物学家茨维特最先发明并定义，他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。

他称之为色谱。

这种方法因此得名为色谱法，又称层析法。

以后此法逐渐应用于无色物质的分离。

　　二、色谱法的特点和优点

　　色谱分析法的特点：

　　具有高超的分离能力，而各种分析对象又大都是混合物，为了分析鉴定它们是由什么物质组成和含量是多少，必须进行分离，所以色谱法成为许多分析方法的先决条件和必需的步骤。

　　色谱法的优点：

（1）分离效率高。

（2）应用范围广。

　　它几乎可用于所有化合物的分离和测定，无论是有机物、无机物、低分子或高分子化合物，甚至有生物活性的生物大分子也可以进行分离和测定。

　　（3）分析速度快。

　　一般在几分钟到几十分钟就可以完成一次复杂样品的分离和分析。

　　（4）样品用量少。

　　用极少的样品就可以完成一次分离和测定。

　　（5）灵敏度高。

　　例如GC可以分析几纳克的样品。

第二节　色谱过程和基本原理

　　一、色谱过程

　　实现色谱操作的基本条件是必须具备相对运动的两相，固定相和流动相。

　　色谱过程是组分的分子在流动相和固定相间多次“分配”的过程。

　　组分的结构和性质微小差异

与固定相作用差异

随流动相移动的速度不等

差速迁移

色谱分离。

　　二、色谱流出曲线和有关概念

　　1.色谱流出曲线

　　是由检测器输出的电信号强度对时间作图所绘制的曲线，又称为色谱图。

　　2.基线

　　是在操作条件下，没有组分流出时的流出曲线。

基线反映仪器（主要是检测器）的噪音随时间的变化。

　　3.色谱峰

　　是流出曲线上的突起部分。

　　正常色谱峰、拖尾峰和前延峰。

　　对称因子fs（symmetryfactor）：

衡量色谱峰的对称性。

　　4.定性参数

（1）保留时间（tR）：

从进样开始到某个组分色谱峰顶点的时间间隔称为该组分的保留时间。

（2）死时间（t0）：

分配系数为零的组分的保留时间称为死时间，是流动相充满输液系统管路、色谱柱空隙及检测池所需的时间。

　　（3）调整保留时间（

）：

组分在固定相中停留的时间称为调整保留时间。

　　调整保留时间与保留时间和死时间有如下关系：

=tR-t0

　　（4）相对保留值（r）两组分的调整保留值之比称为相对保留值，又称选择性因子。

即：

　　r2,1=

／

=k2／k1

　　5.定量参数

（1）峰高（peakheight；h）：

组分在柱后出现浓度极大时的检测信号，即色谱峰顶至基线的距离。

（2）峰面积（peakarea；A）：

色谱曲线与基线间包围的面积。

　　6.柱效参数

（1）标准差（standarddeviation；σ）：

正态色谱流出曲线上两拐点间距离之半，即0.607倍峰高处的峰宽之半。

　　σ的大小表示组分被带出色谱柱的分散程度。

　　σ越大，组分越分散；反之越集中。

（2）半峰宽（W1/2）：

峰高一半处的峰宽。

　　W1/2=2.355σ

　　（3）峰宽（peakwidth；W）：

色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。

　　W=4σ或W=1.699W1/2

　　7.总分离效能指标

　　分离度（resolution；R）：

又称分辨率，是相邻两色谱峰保留时间之差与两色谱峰峰宽均值之比。

　　三、分配系数与色谱分离

（一）分配系数和容量因子

　　分配系数（distributioncoefficient；K）：

是在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相（s）与流动相（m）中的浓度（C）之比。

　　分配系数仅与组分、固定相和流动相的性质及温度（和压力）有关。

是组分的特征常数。

　　容量因子（capacityfactor；k）：

在一定温度和压力下，达到分配平衡时，组分在固定相和流动相中的质量（m）之比。

　　又称为质量分配系数或分配比。

　　还与固定相和流动相的体积有关。

　　容量因子与分配系数的关系：

（二）色谱分离的前提

　　KA≠KB或kA≠kB是色谱分离的前提。

第三节　色谱方法基本类型及其分离机制

　　分配色谱法

　　吸附色谱法

　　离子交换色谱法

　　空间排阻色谱法

　　一、分配色谱法

　　分离原理：

利用被分离组分在固定相或流动相中的溶解度差别而实现分离。

　　溶质分子在固定相中溶解度越大，或在流动相中溶解度越小，则K越大。

　　固定相：

　　又称固定液（涂渍在惰性载体颗粒上的一薄层液体）；化学键合相（通过化学反应将各种有机基团键合到载体上形成的固定相）。

　　流动相：

　　气液分配色谱法：

气体，常为氢气或氮气。

　　液液分配色谱法：

与固定相不相溶的液体。

　　正相液液分配色谱：

流动相的极性弱于固定相的极性。

　　反相液液分配色谱：

流动相的极性强于固定相的极性。

　　二、吸附色谱法

　　分离原理：

利用被分离组分对固定相表面吸附中心吸附能力的差别而实现分离。

　　吸附过程是试样中组分的分子（X）与流动相分子（Y）争夺吸附剂表面活性中心的过程，即为竞争吸附过程。

　　固定相：

　　多为吸附剂，如硅胶、氧化铝。

硅胶表面硅醇基为吸附中心。

　　经典液相柱色谱和薄层色谱：

一般硅胶

　　高效液相色谱：

球型或无定型全多孔硅胶和堆积硅珠。

　　气相色谱：

高分子多孔微球。

　　流动相：

有机溶剂

　　洗脱能力：

主要由其极性决定，强极性流动相占据吸附中心的能力强，洗脱能力强，使k值小，保留时间短。

　　三、离子交换色谱法

　　分离原理：

利用被分离组分离子交换能力的差别而实现分离。

分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。

　　四、空间排阻色谱法

　　分离原理：

根据被分离组分分子的大小进行分离。

　　也称为分子排阻色谱法。

第四节　薄层色谱法

　　薄层色谱法（thinlayerchromatography，TLC）系将供试品溶液点样于涂布有固定相的薄层板上，经展开、检视后所得的色谱图，与适宜的对照物按同法操作所得的色谱图进行比较，主要用于药品的鉴别或杂质检查。

　　薄层色谱法属于平面色谱法的一种，按分离原理薄层色谱法主要有吸附、分配和分子排阻色谱法，以及胶束薄层色谱法等。

　　主要讨论在药品的鉴别和杂质检查中最为常用的吸附薄层色谱法。

　　一、基本原理

　　将A、B两组分的混合物溶液点样于薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的流动相（展开剂）展开。

此时A、B不断地被吸附剂所吸附，又被展开剂所溶解（解吸附），且随展开剂向前移动。

由于吸附剂对A和B两组分具有不同的吸附能力，展开剂也对A和B具有不同的解吸附能力，即KA≠KB。

因此，当展开剂不断展开时，A、B在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附和解吸附，从而产生差速迁移得到分离，组分的K值越大随展开剂移动的速度越慢。

　　二、常用的固定相

　　吸附薄层色谱法的固定相为吸附剂，最常用的吸附剂是硅胶，其次有硅藻土、氧化铝、微晶纤维素等。

其颗粒大小，一般要求粒径为5～40μm。

　　1.硅胶

　　是薄层色谱法中应用最多的固定相，

　　通常用Si02·χH20表示，是具有硅氧交联结构、表面有许多硅醇基的多孔性微粒。

　　硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团，水能与硅胶表面的硅醇基结合而使其失去活性。

　　硅胶的含水量越高，其活性越低，吸附力则越弱。

　　在105℃～110℃加热30分钟，使硅胶吸附力增强，这一过程称为“活化”。

　　薄层色谱法常用的硅胶有：

　　硅胶G：

系指含有黏合剂（煅石膏，12%～14%）的硅胶；

　　硅胶H：

系指不含黏合剂的硅胶；

　　硅胶HF254。

：

系指不含黏合剂但有荧光剂的硅胶，

　　硅胶GF254。

：

则是同时含有黏合剂和荧光剂的硅胶，荧光剂在254nm的紫外光下呈强烈的黄绿色荧光背景。

　　2.氧化铝

　　色谱用氧化铝有碱性、中性和酸性三种。

其中，中性氧化铝使用最多。

　　氧化铝的活性也与含水量有关，含水量高，活性低，吸附力弱。

　　氧化铝和硅胶类似，有氧化铝和氧化铝G等。

　　3.聚酰胺

　　三、操作方法

（一）薄层板的制备

　　1.基片

　　根据需要，选用5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm规格的玻板，要求表面光滑、平整，洗净后不附水珠，晾干。

　　2.薄层板

　　一般可分为无黏合剂和含黏合剂两种。

　　后者系在固定相中加入一定量的黏合剂，常用10%～15%煅石膏（CaS04·2H20在140℃加热4小时），混匀后加水适量使用，或用羧甲基纤维素钠水溶液（0.2%-0.5%）适量调成糊状，均匀涂布于玻板上。

　　除另有规定外，将1份固定相和3份水在研钵中向同一方向研磨混合，去除表面的气泡后，在玻板上平稳地移动涂布器进行涂布（厚度为0.2～0.3mm），置水平台上于室温下晾干后，再在110℃活化30分钟，即置有干燥剂的干燥箱中备用。

（二）点样与展开

　　1.点样

　　除另有规定外，用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为2～4mm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜，一般为1.0～2.0cm。

点样时必须注意勿损伤薄层板表面。

　　2.展开

　　将点好样品的薄层板放入层析缸，浸入展开剂的深度为距薄层底边0.5～1.0cm（切勿将样品点浸入展开剂中），密封顶盖，待展开至规定距离（一般为10～15cm）后，取出薄层板，标记好前沿，晾干。

　　（三）检视

　　1.荧光薄层板

　　可用荧光淬灭法，即在紫外光（254nm）灯下检视暗斑的位置与强度。

　　2.普通薄层板

　　有色物质，可在日光下直接检视。

　　无色物质可用物理或化学方法检视，物理方法是在紫外光（254nm或365nm）灯下或用其他检测仪器检出斑点的荧光颜色及强度；化学方法一般用化学试剂显色后，立即覆盖同样大小的玻板，在日光或紫外光灯下检视。

　　显色方法有直接喷雾法、浸渍法和压板法等。

　　（四）比移值的计算

　　Rf=ι／ι0

　　Rf值是薄层色谱法的基本定性参数。

可用供试品溶液主斑点与对照溶液主斑点的Rf值进行比较，或用Rf值来说明主斑点或杂质斑点的位置。

　　Rf值的最佳范围是0.3～0.5，可用范围是0.2～0.8。

影响Rf值

　　四、定性和定量分析

（一）在鉴别中的应用

　　1.与对照品比较Rf值

　　将同浓度的供试品溶液与对照品溶液在同一块薄层板上点样、展开与检视，供试品溶液所显示主斑点的位置（Rf）应与对照溶液的主斑点一致，而且两主斑点的大小与颜色（或荧光）的深浅也应大致相同；或将两溶液等体积混合后，点样、展开与检视，应显示单一、紧密的斑点。

　　2.与结构相似的物质比较Rf值

　　选用与供试品化学结构相似的药物对照品与供试品的主斑点比较，两者的Rf应不同，或将上述两种溶液等体积混合应显示两个清晰分离的斑点。

（二）在杂质检查中的应用

　　1.杂质对照品法

　　制备一定浓度的供试品溶液和相应的（浓度符合限度规定的）杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液，点样、展开、检测并比较。

　　供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点（杂质斑点）与相应的杂质对照品溶液或系列杂质对照品溶液色谱图中的主斑点比较，颜色不得更深。

　　2.自身稀释对照法

　　制备一定浓度的供试品溶液；

　　取供试品溶液一定量，按照限度规定，稀释制成另一低浓度溶液或系列溶液，作为对照溶液，点样、展开、检测并比较。

　　供试品溶液色谱图中除主斑点外的其他斑点（杂质斑点）与相应的自身稀释对照溶液或系列自身稀释对照溶液色谱图中的主斑点比较，颜色不得更深。

　　如盐酸氯丙嗪中有关物质的检查：

取供试品，加甲醇制成每1ml中含1Omg的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加甲醇稀释成每1ml中含0.1mg的溶液，作为对照溶液。

照薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以环己烷-丙酮-二乙胺（80:

10:

10）为展开剂，展开、晾干，置紫外光灯（254nm）下检视。

供试品溶液如显杂质斑点，与对照溶液所显的主斑点比较，不得更深。

　　3.其他方法

　　除上述两种方法外，也可将杂质对照品法与供试品溶液自身稀释对照法并用。

即特定杂质限度采用杂质对照品法，其他杂质限度采用供试品溶液自身稀释对照法控制。

第五节　气相色谱法

　　一、基本原理

　　气相色谱法（gaschromatography，GC）系采用气体流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

　　待测组分或其衍生物气化后，被载气带人色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

　　气相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、样品用量少、分析速度快等优点，但受样品蒸气压限制，不适用于难挥发和热稳定性差的物质的分析。

　　样品中各组分在固定相与载气（流动相）之间进行分配，由于各组分的分配系数不等，它们将按分配系数大小的顺序依次被载气带出色谱柱。

分配系数小的组分先流出，分配系数大的后流出。

　　二、定性与定量分析

（一）定性分析方法

　　已知物对照法

　　利用相对保留值定性

（二）定量分析方法

　　定量分析的依据：

　　在恒定的实验条件下，峰面积（或峰高）与组分的（含）量成正比。

但，同一检测器对不同物质具有不同的响应灵敏度。

　　定量校正因子

　　1.归一化法

　　样品所有组分都产生色谱峰

　　校正因子相等时，直接用峰面积。

　　优点：

简便、定量结果与进样量无关、受操作条件变化影响较小。

　　缺点：

必须所有组分在一个分析周期内都能流出色谱柱，检测器对它们都产生信号。

不适用于微量杂质的测定。

　　2.外标法：

　　外标一点法：

用同一种浓度对照溶液

　　优点：

简便，不用校正因子，不必加内标物，只需待测组分出峰。

　　缺点：

结果的准确度与进样量的重复性和操作条件的稳定性有关。

　　3.内标法：

　　以一定量的纯物质（内标物），加入到准确称定的试样中，根据试样和内标物的重量及其峰面积比，求出某组分的含量。

　　优点：

只需内标物及欲测组分出峰，操作条件变化而引起的误差小。

　　缺点：

内标物选择难

　　内标物的选择：

应是试样中不存在的纯物质；色谱峰位于被测组分色谱峰附近，或几个被测组分色谱峰中间，并完全分离。

第六节　高效液相色谱法

　　高效液相色谱法（HPLC），系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。

　　注入的供试品由流动相带入色谱柱，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色谱信号。

　　高效液相色谱法是在经典的液相色谱法基础上发展起来的一种分离分析方法，具有分离效能高、分析速度快、应用范围广等特点，是在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。

　　一、基本原理

　　样品中各组分在固定相与流动相之间分配，由于各组分的分配系数不等，它们将按分配系数大小的顺序依次被流动相带出色谱柱。

分配系数小的组分先流出，分配系数大的后流出。

　　二、高效液相色谱仪

　　三、定性、定量方法：

同GC

　　定性分析方法

　　定量分析方法：

外标法、内标法