枸杞提取物的抗氧化作用.docx
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枸杞提取物的抗氧化作用
枸杞提取物的抗氧化作用
【摘要】目的:
探讨枸杞醇提物和水提物的抗氧化作用.方法:
钙沉淀法提取雄性SD大鼠肝微粒体.采用・OH和O2-・两种化学发光体系观察枸杞醇提物和水提物对发光强度的抑制作用,采用VC/Fe2+和过氧基异丙苯作为微粒体脂质过氧化激发剂模型,比色法测定丙二醛含量变化,观察枸杞醇提物和水提物对MDA的抑制作用.结果:
在两种化学发光体系中,枸杞两种提取物对・OH和O2-・的抑制率均显着高于对照组,呈明显剂量效应关系;枸杞水提物的IC50为和;醇提物为和在VC/Fe2+和CHP模型中,枸杞醇提物和水提物各浓度组MDA含量均显着低于对照组,对MDA的抑制率也呈现较好的剂量效应关系.结论:
枸杞的两种提取物都具有较强的抗氧化作用,存在一定的剂量效应关系.枸杞醇提物清除自由基的能力要强于水提物.
【关键词】枸杞;化学发光测定法;抗氧化作用;脂质过氧化作用
0引言
近年来的研究证实,人体内自由基增多导致的脂质过氧化作用与多种疾病有关.因此,对抗氧化药物的研究已成为自由基医学研究领域中的一个重要课题.枸杞属于常用的补益类中药,其活性成分单体如枸杞多糖,β胡萝卜素均具有抗氧化作用.由于枸杞所含的活性成分较多,故对单体的研究不足以反映枸杞的抗氧化性.而通过回流法和煎煮法提取的枸杞醇提物和水提物具有多种有效成分[1].本实验我们应用两种化学发光体系和两种微粒体抗氧化剂筛选模型,探讨枸杞醇提物和水提物的抗氧化作用,旨在为枸杞的食用和药用提供实验依据.
1材料和方法
材料二级雄性SD大鼠20只,体质量240~260g,由第四军医大学实验动物中心提供;枸杞提取物由第四军医大学军事预防医学系毒理学教研室提供;鲁米诺,硫代巴比妥酸,黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶(xanthinoxidase,XO),过氧基异丙苯(cumenehydroperoxide,CHP),3K30型台式高速冷冻离心机均为美国Sigma公司产品;MDA标准品为德国Merck公司产品;牛血清白蛋白为江苏华美试剂公司产品;过氧化氢,三羟甲基氨基甲烷,三氯乙酸,乙酸,乙醇,蔗糖,抗坏血酸,硫酸亚铁,CCl4,KCl和CoCl2等均为国产分析纯;722型光栅分光光度计为山东高密分析仪器厂产品,IFFME型流动注射化学发光分析仪为西安瑞迈分析仪器有限责任公司产品.
方法
微粒体的制备[2]大鼠禁食24h,颈椎脱臼处死,迅速取出肝脏,用预冷的生理盐水洗去血污,按5mL/g肝湿质量的比例加入pH的250mmol/L蔗糖Tris/HCl缓冲液,用电动匀浆器制成匀浆.操作全过程在0~4℃下进行.采用钙沉淀法提取肝微粒体,-20℃保存.用前按1mL/g肝湿质量比例用预冷的mol/LKCl悬浮.蛋白含量采用Lowrys法测定[3].
・OH化学发光体系的建立根据文献[4]的方法并略加改动进行实验.将枸杞醇提物和水提物分别用乙醇和双蒸水溶解,分为,,,,和 g/L6个剂量组.每组设3个平行样.双蒸水配制mol/L的硼酸缓冲液,内含1g/L的乙二胺四乙酸,g/L的CoCl2・6H2O,用1mol/LNaOH调pH为9;取配好的溶液1mL,加×10-4mol/L的鲁米诺100μL,mol/L过氧化氢25μL,不同浓度的样本25μL,充分混匀后,立即启动化学发光,记录60s内化学发光动力学曲线.重复3次测定平行样本.
・化学发光体系的建立根据文献[5]的方法并略加改动进行实验.取mL鲁米诺(1mmol/L)碳酸缓冲液(pH),mL黄嘌呤(150μmol/L)碳酸缓冲液(pH),mLXO(4×103U/L)磷酸缓冲液(pH),25μL不同浓度的样本,混匀后,立即启动化学发光,记录60s内化学发光动力学曲线.重复3次测定平行样本.
微粒体VC/Fe2+脂质过氧化(lipidperoxidation,LPO)激发模型的建立采用文献[6]的方法.将枸杞醇提物和水提物分别用乙醇和双蒸水溶解,分为,,,和g/L5个剂量组.每组设3个平行样.同时设1个空白对照,1个阴性对照及3个阳性对照.反应体系中含缓冲液mL,50μmol/LFeSO4 mL,5mmol/LVC mL,微粒体悬液和不同浓度的枸杞提取物各mL.比色法测各组的MDA含量;并计算抑制率.
微粒体CHPLPO激发模型的建立采用文献[6]的方法.在反应体系中含缓冲液1mL,1mmol/LCHP mL,微粒体悬液mL和不同浓度的枸杞提取物mL.比色法测各组的MDA含量;并计算抑制率.
统计学处理:
实验数据采用SPSS forwindows统计分析软件进行线性回归分析和方差分析,应用Dunnett检验进行组与组的两两比较,结果采用x±s表示.
2结果
枸杞两种提取物对・OH和O2-・激发体系的影响在不同实验浓度范围内,与对照组相比,枸杞两种提取物・OH和O2-・的抑制率均显着增高,且随枸杞提取物浓度增加,抑制率逐渐升高.同时计算得到枸杞水提物和醇提物对・OH的半数抑制浓度分别为和;枸杞水提物和醇提物对O2-・的半数抑制浓度分别为和
枸杞两种提取物对VC/Fe2+激发的LPO模型的影响与阳性对照组相比,两种提取物在各给药浓度下MDA含量均有显着下降.其中枸杞水提物随浓度升高,MDA含量相应降低,量效关系显着;醇提物浓度在~10g/L范围内,随浓度升高,MDA含量相应降低,但在20g/L浓度时,MDA含量升高,但仍然低于阳性对照组.两种提取物相比较,醇提物的抑制率要高于水提物.
表1枸杞提取物对VC/Fe2+激发的脂质过氧化(LPO)模型影响(略)
枸杞两种提取物对CHP激发的LPO模型的影响与阳性对照组相比,两种提取物在各给药浓度下MDA含量均有显着下降.且随枸杞提取物浓度降低,MDA含量相应升高,但醇提物在低浓度(g/L)时MDA含量略有降低.两种提取物相比较,除浓度g/L外,醇提物的抑制率要高于水提物.
表2枸杞提取物对过氧基异丙苯(CHP)激发的脂质过氧化(LPO)模型影响(略)
3讨论
目前针对枸杞抗氧化作用的研究主要集中在枸杞多糖,β胡萝卜素等单体.但是,由于自由基反应具有链式反应的特性,所以单一的抗氧化剂在体内体外实验中都无法达到预期的效果[7].因此,针对含有多种有效成分的枸杞醇提物和水提物进行抗氧化研究具有重要意义.
本研究我们在建立的・OH和O2-・化学发光体系中加入枸杞提取物,通过观察其发光值的变化,间接反映枸杞提取物的抗氧化作用.两种微粒体LPO模型分别代表了不同的激发体系,其中VC/Fe2+模型代表了无机物激发的非酶参与的过氧化反应链;而CHP代表有机物激发的非酶参与的过氧化自由基反应链[6].我们在每个浓度的3个平行管外还设立了一个本底管,即阴性对照管.用平行管吸光度值减去本底管值,即排除了药物本身色素对值的影响.
从实验结果中可以看出,在两种化学发光体系中,枸杞醇提物和水提物对・OH和O2-・都有明显的抑制作用,且剂量效应关系显着.其中水提物的IC50大于醇提物,说明枸杞醇提物对・OH和O2-・的清除能力要强与水提物.在VC/Fe2+激发的微粒体LPO模型中,枸杞醇提物和水提物对MDA有明显的抑制作用,且在一定浓度范围内,随枸杞浓度升高,MDA含量相应降低,但醇提物在20g/L浓度时,MDA含量升高,但仍然低于阳性对照组,提示高浓度时,枸杞醇提物存在一定的抗氧化作用,但其抗氧化能力可能随枸杞浓度增加而呈下降趋势.两种提取物相比较,醇提物的抑制率要高于水提物,提示在VC/Fe2+激发的微粒体LPO模型中枸杞醇提物的抗氧化能力要强于水提物.在CHP激发的微粒体LPO模型中,枸杞醇提物和水提物对MDA有明显的抑制作用,且在一定浓度范围内,随枸杞浓度降低,MDA含量相应升高,但醇提物在g/L浓度时,MDA含量突然降低,提示枸杞醇提物在较低浓度时,其抗氧化能力可能随枸杞浓度下降而呈上升趋势.两种提取物相比较,除浓度g/L外,醇提物的抑制率要高于水提物.提示除一定较低浓度范围外,枸杞醇提物的抗氧化能力要强于水提物.
综上,枸杞的两种提取物均具有良好的抗氧化作用,且具有一定的剂量效应关系.其中,枸杞醇提物的抗氧化作用要强于水提物.
【参考文献】
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