高效液相色谱实验技术.docx
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高效液相色谱实验技术
第九章高效液相色谱实验技术
一色谱柱
1.液相色谱柱的安装
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成,其中液相色谱柱的正确安装和使用,是液相色谱工作的关键;也是液相色谱工作者获得正确可靠的实验数据的关键所在。
(1)、液相色谱柱的结构:
a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。
柱接头采用低死体积结构,柱接头是两端螺纹组件,一端是为7/16英寸外螺纹,另一端是3/16英寸的内螺纹(国内外已规范化)。
7/16英寸外螺纹与1/4英寸柱管(Φ6.35mm)连接,中间放置压坏用于密封。
3/16英寸的内螺纹与1/16英寸(Φ1.57mm)的连接管连接,中间也放置压环用于柱接头的密封。
为了尽量减少柱外死体积,在安装色谱柱时,用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底,然后再拧紧空心螺钉。
压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上(连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2.5mm长或其他固定尺寸)。
在两端柱接头内,柱管两端各放置一片不锈钢滤片(或滤网),用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。
空柱各组件均为316#不锈钢材质,能耐受一般的溶剂作用。
但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性,故使用时要注意,柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂,以避免腐蚀。
b、柱填料:
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的,柱子的分类是依据填料类型而定。
正相柱:
多以硅胶为柱填料。
根据外型可分为无定型和球型两种,其颗粒直径在3—10µm的范围内。
另一类正相填料是硅胶表面键合—CN,-NH2等官能团即所谓的键合相硅胶。
反相柱:
主要是以硅胶为基质,在其表面键合十八烷基官能团(ODS)的非极性填料。
也有无定型和球型之分。
常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等,其颗粒粒径在3—10µm之间。
(2),色谱柱的安装:
a、拆开柱包装盒,确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。
b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。
c、按柱管上标示的流动相流向,将色谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接(如条件允许,建议在柱前使用保护柱);柱的出口与检测器连接。
连接管是外径为1.57mm、内径为0.1-0.3mm的不锈钢管。
连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。
在接管时一定要设法降低柱外死体积。
连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底,然后顺时针拧紧空心螺钉,直到拧不动为止,再用扳手继续顺时针拧1/4-1/2圈,切记不要用力过大。
如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象,请用扳手继续顺时针拧1/4圈,直至不漏液为止。
2、液相色谱柱的使用:
色谱柱在使用前,最好进行柱的性能测试,并将结果保存起来,作为今后评价柱性能变化的参考。
但要注意:
柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同;另外,在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件),只有这样,测得的结果才有可比性。
(1)、样品的前处理:
a、最好使用流动相溶解样品。
b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。
使用0.45µm的过滤膜过滤除去微粒杂质。
(2)、流动相的配制:
液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的,因此要求流动相具备以下的特点:
a、流动相对样品具有一定的溶解能力,保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。
b、流动相具有一定惰性,与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。
c、流动相的黏度要尽量小,以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果;同时降低柱压降,延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。
d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。
如使用UV检测器,最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。
e、流动相沸点不要太低,否则容易产生气泡,导致实验无法进行。
f、在流动相配制好后,一定要进行脱气。
除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测,还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。
(3)、流动相流速的选择:
因柱效是柱中流动相线性流速的函数,使用不同的流速可得到不同的柱效。
对于一根特定的色谱柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。
对内径为4.6mm的色谱柱,流速一般选择1ml/min,对于内径为4.0mm柱,流速0.8ml/min为佳。
当选用最佳流速时,分析时间可能延长。
可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时,可适当增加甲醇或乙腈的含量)。
(4)、从HPLC色谱柱上去除样品残余物
因为样品中经常会含有能够吸附在色谱柱固定相上的杂质化合物,所以应该经常对色谱柱进行清洗或冲洗。
当色谱柱在多次进样后显示出柱效降低时,有必要采用适当的流动相对色谱柱进行处理,冲洗除去吸附在固定相上的污染物和样品残余物。
方法如下:
将色谱柱从系统上取下,反向连接到输液泵上。
色谱柱出口不要连接到检测器上,以免污染检测器流动池。
大多数的硅胶基质色谱柱反相冲洗没有问题,但是聚合物基质色谱柱并不能如此操作,在反相冲洗色谱柱之前最后与色谱柱生产商确认,反向冲洗流动相流速不要太大。
冲洗溶剂的选择要考虑分析的样品和使用的流动相条件,一般清洗流动相强度应该比流动相更强,但是条件应该尽可能的温和。
A.用适当的溶剂冲洗色谱柱的盐和强添加剂。
B.用比分析流动相更强的溶剂冲洗,该溶剂与流动相组成相同但不含盐和酸。
C.如果认为B布骤没能完全清洗干净色谱柱,可用100%最强溶剂冲洗。
在清洗色谱柱时,最好用与流动相组成相同的溶剂,但是如果使用其他的溶剂,最重要的是要考虑到溶剂之间的互溶性,另外不要用强酸和强碱。
名称_____沸点_____挥发速度
二氯甲烷---------40---------2750
四氯化碳--------76.8---------1280
醋酸甲酯---------57.2---------1180
丙酮-------------56.2---------1120
正己烷---------65~69---------1000
二氯乙烷---------84-----------750
环已烷---------80.8------------720
醋酸乙酯--------77.1---------615
丁酮------------79.6----------572
四氢呋喃---------66----------501
苯---------------80----------500
正庚烷---------98.0----------386
甲醇-----------64.5-----------370
甲苯----------111.0---------240
异丙醇---------82.5---------205
乙醇-----------78.1---------203
醋酸丁酯--------26.5---------100
二甲苯---------135~145--------68
甲基溶纤剂------124.5---------55
丁醇------------117.1---------45
环已酮---------155~156-------25
三氯乙烯---------86~88---------快
二氧六环---------101~102-------中
二甲基甲酰胺----153-------------慢
醋酸戊酯---------130~150-------慢
3、色谱柱的保养
在正常情况下,色谱柱至少可以使用3—6个月,能完成数百次以上的分离。
但是,若操作不慎,将使色谱柱很易损坏而不能使用。
因此为了保持柱效、柱容量及渗透性,必须对色谱柱进行仔细地保养。
1.色谱柱极易被微小的颗粒杂质培塞,使操作压力速升高而无法使用,因此必须将流动相仔细地蒸馏或用0.45μm孔径的滤膜过滤。
在流动相组贮槽与色谱柱间,安装0.45μm孔径的过滤器。
在柱子上端接头处装上多孔过滤片,以防止固体颗粒进入色谱柱中。
在水溶液流动相中,细菌容易生长,可能堵塞筛板加入0.01%NoHa能防止能防止细菌生长。
2.最好使用进祥阀进样,以防止注射器进样时、注射隔膜碎屑堵塞柱子入口。
3.对硅胶基键合相填科,水溶液流动相的PH值不得超出2—8.5的范围,使温度不宜过高。
柱子在酸性或碱性条件下使用之后,。
应依次用水、甲醇清洗,对暂时不用而需要较长时间保存的柱子,要用纯甲清洗,柱子两端用金属螺帽封闭,保存于干净的有机溶剂中。
4.要防止色谱柱被振动或撞击,否则柱内填料床层产生裂缝和空隙,会使色谱峰出现“驼峰”或“对峰”。
5.要防止流动相逆向流动,否则将使固定相层位移,柱效下降。
6.使用保护柱。
连续注射含有未被洗脱样品时,会使柱效下降,保留值改变。
为了延长柱寿命,在进样阀和分析柱间加上保护柱,其长度一般为3—5cm,填充与分析柱性质相似的表面多孔型固定相,因此可干法填装。
而且价廉、更换容易。
实验表明,使用保护柱后,除了使扩为零的组分的塔板数减少外,其柱效下降很少。
4、色谱柱的再生
一般情况下,硅胶和ODS等化学键合固定相再生是困难的。
有时,采用下述方法可能提高校效。
1.由于杂质微粒等因素,使柱上端固定相变色,柱效下降。
这时,可仔细地将变色部分除去(约3mm左右),再补充新的固定香。
2.当色谱柱吸附未被洗脱成分时,柱效将明显下降,可选择合适的溶剂进行洗净。
3.对离子交换树脂柱,先经1mol/LHCI相1molNaOH溶液洗净,再以1—2mol/LNaCl水溶液平衡,以超声波发生器进行清洗,通常可获良好的效果。
4.当采用梯度洗脱时,柱在重复使用前,用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子,以重新建立起始的平衡来得到再生。
二.流动相
1.脱气
基线的各种问题
L、基线漂移
原因解决方法
1、柱温波动。
(即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。
通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。
)
1、控制好柱子和流动相的温度,在检测器之前使用热交换器图
2、流动相不均匀。
(流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。
)
2、使用HPLC级的溶剂,高纯度的盐和添加剂。
流动相在使用前进行脱气,使用中使用氦气。
3、流通池被污染或有气体
3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。
如有需要,可以用1N的硝酸。
(不要用盐酸)
4、检测器出口阻塞。
(高压造成流通池窗口破裂,产生噪音基线)
4、取出阻塞物或更换管子。
参考检测器手册更换流通池窗。
5、流动相配比不当或流速变化
5、更改配比或流速。
为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。
6、柱平衡慢,特别是流动相发生变化时
6、用中等强度的溶剂进行冲洗,更改流动相时,在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
7、检查流动相的组成。
使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂
8、样品中有强保留的物质(高K’值)以馒头峰样被洗脱出,从而表现出一个逐步升高的基线。
8、使用保护柱,如有必要,在进样之间或在分析过程中,定期用强溶剂冲洗柱子。
9、使用循环溶剂,但检测器未调整。
9、重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时,使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处
M、基线噪音(规则的)
原因解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气
1、流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液图2、见第三部分。
检查管路接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要,更换泵密封。
3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响(柱温过高,检测器未加热)
4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
5、断开LC、检测器和记录仪,检查干扰是否来自于外部,加以更正。
6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器
N、基线噪音(不规则的)
原因解决方法
1、漏液图1、见第三部分。
检查接头是否松动,泵是否漏液,是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要,更换密封。
检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
2、检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
4、断开检测器和记录仪的电源,检查并更正。
5、系统内有气泡5、用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡6、清洗检测器,在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染(即使是极少的污染物也会产生噪音。
)
7、用1N的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池
8、检测器灯能量不足8、更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞9、更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
10、维修或更换混合器,在流动相不走梯度时,建议不使用泵的混合装置
O、宽峰
原因解决方法
1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相
2、流动相流速太低2、调节流速
3、漏液(特别是在柱子和检测器之间)
3、见section3。
检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。
如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确4、调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
5、a、小体积进样(例如:
10ul而不是100ul)以1:
10或1:
100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低6、增加浓度
7、保护柱污染或失效7、更换保护柱
8、更换同样类型的色谱柱。
如果新柱子可以提供对称的色谱峰,则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷9、打开柱入口,填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低11、提高柱温。
除非特殊情况,温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大12、使用较小的时间常数
P、分离度降低
原因解决方法
1、流动相污染或变质(引起保留时间变化)
1、重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞图
2、去掉保护柱进行分析。
如果必要则更换保护柱。
如果分析柱阻塞,可进行反冲。
如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏,建议使用恰当的再生程序。
如果问题仍然存在,进口可能阻塞了,更换入口处的筛板或更换色谱柱。
Q、所有的峰面积都太小
原因解决方法
1、检测器衰减设定过高1、减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
2、设定较小的时间常数
3、进样量太少3、增大进样量
4、记录仪连接不当4、使用正确的连接
R、所有的峰面积都太大
原因解决方法
1、检测器衰减设定过低1、采取较大的衰减
2、进样过多2、减少进样量
3、记录仪连接不正确3、正确连接记录仪
HPLC日常维护办法之四:
进样阀的问题
以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
A、手动进样阀,转动不灵
原因解决方法
1、转子密封损坏1、更换或调整转子密封
2、转子太紧2、调整转子的松紧度
B、手动进样阀,载样困难
原因解决方法
1、进样阀安装不当1、重新安装
2、定量环阻塞2、清洗或更换定量环
3、进样器污染3、清洗或更换进样器
4、管路阻塞4、清洗或更换管路
C、自动进样阀,不能转动
原因解决方法
1、无压力(或电源)1、提供恰当的压力(电源)
2、转子太紧2、调整转子的松紧度
3、进样阀安装不当3、重新安装
D、自动进样阀,其它问题
原因解决方法
1、阻塞1、清洗或更换阻塞部件
2、机械故障2、见随机维修手册
3、控制器故障3、维修或更换控制器
来源:
分析化学网
1.流动相溶剂的处理:
(1)水将一般的蒸馏水,加入少许高锰酸钾,在pH9—10的条件蒸馏,可用于常规洗脱。
用于梯度洗脱的水,应进行二次蒸馏。
(2)有机溶剂的提纯通常用蒸馏法可除掉大部分有紫外吸收的杂质。
将溶剂通过氧化铝或硅胶柱可除去极性化合物。
氯仿中含有的少量甲醇,可先经水洗再经蒸馏提纯。
试剂级的四氢呋喃由于含抗氧剂丁基甲苯酚而强烈吸收紫外线,可经蒸馏除去难挥发的丁基甲苯酚。
为了防止爆炸,蒸馏终止时,在蒸馏瓶中必须剩余一定量的液体。
(3)溶剂的过滤和脱气流动相溶剂在使用前必须先用0.45ym孔径的滤膜过滤,以除去微小颗粒,防止色谱柱堵塞。
同时要进行脱气处理,因为溶解在溶剂中的气体会在管道、输液泵或检测池中以气泡形式逸出,影响正常操作的进行。
1)溶剂中的CO2使得电导检测器的背景增大。
2)检油池中的气泡,使得信号不稳定,常出现系列假峰(特别是当柱子加温使用时)。
3)色谱柱内的气泡,使柱效降低。
4)输液泵内的气泡,使活塞动作不稳定,流量变动,严重时法输液。
溶剂脱气的方法很多,常用的方法有:
用惰性气相(如氦气)驱除溶剂中的气体;加热回流;真空脱气和超声波脱气。
其中,以超声波脱气最为方便、安全、效果良好,只需将溶剂瓶放入加有水的超声波发生器槽中,处理10一15min即可。
2.试样溶液的制备配制分析试液的溶剂应当使用色谱分离的流动相或可与其混溶的溶剂,配制好的试液需经0.45μm孔径的滤膜过滤,以除去固体微粒物质。
三、样品处理技术
在某些试样中,常含有多量的蛋白质、脂肪及糖类等物质。
它们的存在,将影响组分的分离测定,同时容易堵塞和污染色谱柱,使柱效降低,所以常需对试样预处理。
样品的预处理方法很多,如溶剂萃取、吸附、超速离心及超过滤等。
1.溶剂萃取溶剂萃取适用于待测组件为非极性物质。
在试样中加入缓冲溶液调节pH,然后用乙醚或氯仿萃取待测组分。
但如果待测组分和蛋白质结合,在大多数情况下;难以用萃取操作来进行分离。
2.吸附将吸附剂直接加到试样中,或将吸附剂填充于柱内进行吸附。
亲水性物质用硅胶吸附,而疏水性物质可用聚苯乙烯—二乙烯基苯等类树脂吸附。
3.除蛋白质向试样中加入三氯醋酸或丙酮、乙腈、甲醇,蛋白质被沉淀下来,然后经超速离心,吸取上层清液供分离测定用。
4.超过滤用孔径为l0×10-10一500×l0-10m的多孔膜过滤,可除去蛋白质等高分子物质。
四液相色谱常见故障及排除方法
色谱柱
1、柱压升高;
色谱柱入U滤片被流动相或样品中颗粒堵住。
样品组分在滤片上沉淀堵住滤片。
卸下入口接头的滤片,使用1:
1的硝酸溶液超声清洗5min,再用水、甲醇清洗除去水份。
样品及流动相使用0.45µm滤膜除去微量杂质。
使用流动相作溶剂配制样品。
2、新柱柱效低
柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好,影响传质过程。
更换连接管,重新连接色谱柱,降低死体积。
使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。
3、旧色谱柱柱效低,分离不好,柱入口床层塌陷。
填料被流动相溶蚀而流失。
用同型填料填补柱效可部分恢复。
对硅胶质填料,流动相PH值在2—7范围内,否则可能被溶蚀。
4、旧色谱柱柱效低分离不好,有时出现双峰。
入口填料被污染变质所致。
用强溶剂冲洗。
刮除被污染的床层,用同型的填料填补柱效可部分恢复。
污染严重,则废弃或重新填装。
5、新柱接到仪器上后,柱头漏液。
柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。
用扳手顺时针方向拧紧1/4圈直到不漏液为止。
6、新柱接到仪器上后,启动仪器没有柱压降。
柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。
继续开泵,用流动相将柱内气体置换掉。
7、新柱接到仪器上后,检测器出口不断有小气泡出现。
①同上。
②流动相脱气不彻底特别是MeOH/H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。
①同上。
②配好流动相后一定要进行脱气处理。
8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加,甚至超过仪器的耐压限。
柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。
更换或清洗柱入口滤片;用0.45µm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。
9、[b]进样次数增加柱压降逐渐增加。
①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。
②样品在流动相中析出微小结晶。
①用0.45µm过滤膜过滤样品。
②推荐使用流动相溶解样品。
6O{G
10、使用—段时间后,柱效下降,分离不好。
①柱填料被流动相溶解而流失。
②柱填料被样品杂质污染。
①推荐使用予柱。
如柱床层塌陷,用相同型号填料填补。
②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。
11、[b]柱使用一段时间后,柱效下降出现双峰。
柱入口床层被污染使柱填料变质。
用强溶剂冲洗除去杂质。
12、柱使用—段时间后,柱效下降,出现峰拖尾。
柱入口床层被污染。
用强溶剂冲洗20-30ml,若效果不明显应废弃。
13、进样量增大与峰面积增加不成正比.即进样量与峰面积不是线性关系。
样品在流动相中的溶解度小,只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。
①用流动相溶解样品。
②样品的浓度不宜太大。
④进样量不宜过大。
14、使用缓冲液作流动相时,柱压降升高很快。
霉菌生长所致。
①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。
②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。
15、用5µm颗粒填料柱时,以MeOH/H20作流动相时柱压较高。
MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。
可用乙腈/水体系使柱压降低,分离效率更好。
16、长时间放置的色谱柱,出现双峰。
柱床层出现干裂。
柱放置时,最好使用相应的溶剂充填好,防止受大的机械震动,如床层干裂应废弃掉。
17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。
强溶剂将弱溶剂洗不出的杂质冲出来。
不影响柱的性能。
18、柱使用一段时间后保留值逐渐缩短。
柱中固定相流失所致。
①更换色谱柱。
②检查所用的色谱条件是否合适。
19、在UV色谱图中,靠近死时间处出现负峰。
①进样时压力波动所致。
②样品溶剂比流动相的UV吸收值低。
①采用进样阀进样。
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