RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法.docx
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RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
RNA的提取和cDNA合成原理和实验方法
第一节.概述
从真核生物的组织或细胞中提取mRNA,通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链,将双链cDNA和载体连接,然后转化扩增,即可获得cDNA文库,构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。
总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。
自70年代中叶首例cDNA克隆问世以来,已发展了许多种提高cDNA合成效率的方法,并大大改进了载体系统,目前cDNA合成试剂已商品化。
cDNA合成及克隆的基本步骤包括用反转录酶合成cDNA第一链,聚合酶合成cDNA第二链,加入合成接头以及将双链DNA克隆到于适当载体(噬菌体或质粒)。
一.RNA制备
模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。
由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止
及对DNA:
RNA杂交体的RNA部分进行内切降解(RNA酶H活性)。
MLV反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性,但降解RNADNA杂交体中的RNA的能力较弱,且对热的稳定性较AMV反转录酶差。
MLV反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。
AMV反转录酶和MLV反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。
AMV反转录酶和MLV反转录酶都必须有引物来起始DNA的合成。
cDNA合成最常用的引物是与真核细胞mRNA分子3'端poly(A)结合的12-18核苷酸长的oligo(dT)。
三.cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成方法有以下几种:
1.自身引导法合成的单链cDNA3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:
RNA杂交链变性后利用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反转录酶合成cDNA第二链,最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环,即可进一步克隆。
但自身引导合成法较难控制反应,而且用S1核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。
2.置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:
mRNA杂交链不用碱变性,而是在dNTP存在下,利用RNA酶H在杂交链的mRNA链上造成切口和缺口。
从而产生一系列RNA引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。
该反应有3个主要优点:
(1)非常有效;
(2)直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化;(3)不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。
目前合成cDNA常采用该方法。
四.cDNA的分子克隆
已经制备好的双链cDNA和一般DNA一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG和dC或dT和dA尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。
合成的cDNA也可以经PCR扩增后再克隆入适当载体。
第二节.动植物组织mRNA的提取
一、材料
水稻叶片或小鼠肝组织。
二、设备
研钵,冷冻台式高速离心机,低温冰箱,冷冻真空干燥器,紫外检测仪,电泳仪,电泳槽。
三、试剂
1、无RNA酶灭菌水:
用将高温烘烤的玻璃瓶(180℃2小时)装蒸馏水,然后加入0.01%的DEPC(体积/体积),处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇:
用DEPC处理水配制75%乙醇,(用高温灭菌器皿配制),然后装入高温烘烤的玻璃瓶中,存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液;20mmol/LTris·Cl(pH7.6),0.5mol/LNaCl,1mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%SDS。
4、洗脱缓冲液:
10mmol/LTris·Cl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.05%SDS。
四、操作步骤
(一)动植物总RNA提取-Trizol法
Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌,样品量从几十毫克至几克。
用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。
RNA可直接用于Northern斑点分析,斑点杂交,Poly(A)+分离,体外翻译,RNase封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N中磨成粉末后,再以50-100mg组织加入1mlTrizol液研磨,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温放置5分钟,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒。
3、取上层水相于一新的离心管,按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇,室温放置10分钟,12000g离心10分钟。
4、弃去上清液,按每mlTrizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,涡旋混匀,4℃下7500g离心5分钟。
5、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5-10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于水中,必要时可55℃-60℃水溶10分钟。
RNA可进行mRNA分离,或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意]1、整个操作要带口罩及一次性手套,并尽可能在低温下操作。
2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。
(二)mRNA提取
由于mRNA末端含有多poly(A)+,当总RNA流径oligo(dT)纤维素时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上,在低盐浓度或蒸馏水中,mRNA可被洗下,经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。
1、用0.1mol/LNaOH悬浮0.5-1.0goligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床体积为0.5-1.0ml,用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床,直到流出液的pH值小于8.0。
4、将
(一)中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温,加入等体积2x柱层析缓冲液,上样,立即用灭菌试管收集洗出液,当所有RNA溶液进入柱床后,加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260,当洗出液中OD为0时,加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液,以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260,合并含有RNA的洗脱组分。
7、加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
8、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
9、小心弃去上清液,沉淀空气干燥10分钟,或真空干燥10分钟。
10、用少量水溶解RNA液,即可用于cDNA合成(或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃)。
[注意]1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/lNaOH洗净,然后用层析柱加样缓冲液平衡,并加入0.02%叠氮钠(NaN3)冰箱保存,重复使用。
每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
第三节植物病毒RNA提取
大多植物病毒RNA为单链RNA,并且其极性与mRNA极性相同,植物病毒RNA提取较为简单,一般使用酚氯仿即可获得满意结果。
一、材料
提纯TMV病毒液(10mg/ml)。
二、设备
冷冻台式离心机,低温真空干燥仪,电泳仪,电泳槽。
三、试剂
TE-饱和酚:
氯仿(1:
1),氯仿,3MNaAc(pH5.2),乙醇(100%和70%),TE缓冲液,无RNA酶的双菌水。
四、操作步骤
1、取一eppendorf管加入提纯TMV(10mg/ml)400ml,再加入等体积酚/氯仿,盖紧管盖后用手充分振荡1分钟,4℃下12000g离心10分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf管,再用酚/氯仿抽提,直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
3、吸取水相于新eppendorf心管,加入等体积氯仿,用手倒置离心管数十秒,4℃下12000g离心10分钟。
4、取水相,加入1/10倍体积的3mol/LNaAc(pH5.2),2.5倍体积的冰冷乙醇,混匀,-20℃30分钟。
5、4℃下12000g离心15分钟,小心弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀,4℃下12000g离心5分钟。
6、小心弃去上清液,沉淀真空干燥5分钟或空气干燥10分钟,并溶于无RNA酶的双菌水或TE缓冲液中。
7、取10ml进行电泳分析,另10ml用于cDNA合成。
[注意]1、整个操作应尽可能在低温下进行。
2、由于病毒RNA镶嵌于外壳蛋白里面,因此要充分剥去病毒外壳蛋白,一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。
第四节cDNA合成技术
一、RibocloneM-MLV(H-)cDNA合成技术
Promega公司的RibocloneRM-MLV(H-)cDNA合成系统采用M-MLV反转录酶的RNaseH缺失突变株取代AMV反转录酶,使合成的cDNA更长。
该系统的第一链合成使用M-MLV反转录酶,cDNA第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH和DNA聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4DNA聚合酶切去单链末端,方法简便易行。
该系统试剂包括:
20μg特异性引物
200μlM-MLV第一链缓冲液(5×),配方如下:
250mmol/LTris·ClpH8.3(37℃时);375mmol/lKCl;15mmol/LMgCl2;50mmol/LDTT;10mmol/LdATP,dCTP,dGTP,dTTP混合物(各2.5mmol/L)
2×625μrRNasinRRNA酶抑制剂
10,000μM-MLV反转录酶,RNaseH-
5μg对照RNA
400μlM-MLV第二链缓冲液(10×),配方如下:
400mmol/LTris·Cl,pH7.2;850mmol/LKCl;44mmol/LMgCl2;30mmol/LDTT;0.5mg/mlBSA。
500μRNaseH
500μDNA聚合酶Ⅰ
100μT4DNA聚合酶Ⅰ
2×1.25ml不含核酸酶的水
以上所有试剂除对照RNA需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μgmRNA。
(一)第一链合成
1.试剂
[α-32P]dCTP(>400Ci/mmol),EDTA(50mM和200mM),TE-饱和酚:
氯仿(1:
1),7.5MNH4Ac,乙醇(100%和70%),TE缓冲液。
2.操作步骤
(1)取一灭菌的无RNA酶的eppendorf管,加入RNA模板和适当引物,每μgRNA使用0.5μg引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2O调整体积至15μl,70℃处理5分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入
5×第一链缓冲液5μl
rRNasinRNA酶抑制剂25U
M-MLV(H-)反转录酶200U
H2O调至总体积25μl
(2)用手指轻弹管壁,吸取5μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32P]dCTP(>400Ci/mmol),用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
(3)37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1小时
(4)取出置于冰上
(5)掺入测定的eppendorf管加入95μl50mMEDTA终止反应,并使总体积为100μl。
可取90μl进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl进行同位素掺入放射性活性测定。
第一链合成eppendorf管可直接用于第二链合成
注:
以上25μl反应总体积中所用RNA量为1μg,如合成5μgRNA,则可按比例扩大反应体积,倒5μgRNA使用125μl总体积进行合成。
(二)第二链合成
1、取第一链反应液20μl,再依次加入
10×第二链缓冲液20μl
DNA聚合酶Ⅰ23μ
RNaseH0.8μ
H2O加至终体积为100μl
2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl至另一eppendorf管,加入2-5μCi[α-32P]dCTP。
3、14℃温浴2小时(如需合成长于3kb的cDNA,则需延长至3-4小时)。
4、掺入测定eppendorf管中加入90μl50mMEDTA,取10μl进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。
5、cDNA第二链合成离心管反应液70℃处理10分钟,低速离心后置冰上。
6、加入2μT4DNA聚合酶,37℃温浴10分钟。
7、加入10μl200mmol/LEDTA终止反应。
8、用等体积酚:
氯仿抽提cDNA反应液,离心2分钟。
9、水相移至另一eppendorf管,加入0.5倍体积的7.5M醋酸铵(或0.1倍体积的1.5M醋酸钠,pH5.2),混匀后再加入2.5倍体积的冰冷乙醇(-20℃),-20℃放置30分钟后离心5分钟。
10、小心丢去上清液,加入0.5ml冰冷的70%乙醇,离心2分钟。
11、小心移去上清液,干燥沉淀。
12、沉淀溶于10-20μlTE缓冲液。
(三)同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析
1.试剂
1mg/ml鲑鱼精DNA,三氯乙酸(TCA,5%和7%),碱性琼脂糖胶,碱性胶电泳缓冲液,(30mMNaOH,1mMEDTA),2×样品缓冲液,(20mMNaOH,20%甘油,0.025%溴酚蓝)。
2.操作步骤
(1)各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥,这些样品代表总放射性活性。
(2)同样各取3μl中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA中,混匀,加入0.5ml5%TCA,涡旋混合仪混合后置冰上5-30分钟。
(3)用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5%TCA洗三次,每次用5mlTCA,再用5ml丙酮或乙醇漂洗,这些样品代表掺入放射性活性。
(4)分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。
3.第一链产量测定
第一链掺入率(%)=掺入cpm/总cpm×100%
掺入dNTP(nmol)=2nmoldNTP/μl×反应体积(μl)×(第一链掺入率)
设330为每moldNTP的平均分子量
合成cDNA量(ng)=掺入dNTP(nmol)×330ng/nmol
mRNA向cDNA转变率=合成cDNA量(ng)/模板RNA量(ng)×100%
例如总放射性活性强度为254,000cpm,掺入放射性活性强度为3040cpm,所用RNA摸板量为1μg,反应体积为25μl,则:
掺入率=3040/254000×100%=1.2
掺入dNTP量=2nmoldNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA量=0.6nmoldNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA向cDNA转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ngRNA中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA合成量为0.8×198ng=158ng。
4.第二链产量计算
除需去除第一链掺入dNTP外,方法同第一链产量计算
第二链掺入率=掺入放射性活性/总放射性活性?
?
掺入dNTP量(nnol)=[0.4nmoldNTP/μl×反应体积(μl)-第一链掺入nmol]×第二链掺入率
第二链cDNA合成量(ng)=nmoldNTP×330ng/nmol
双链cDNA转变率=双链cDNA合成量(ng)/单链cDNA合成量(ng)
例:
第二链掺入放射性活性强度为2780cmp,总放射性活性强度为235000cpm.
第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%
第二链合成dNTP量=[(0.4nmol/μl×100μl)-0.48nm]×1.18%=0.47nmol
合成第二链cDNA量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol=155ng
双链cDNA转变率=155ng/158ng×100%=98%
一般cDNA第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。
(四)电泳分析
通常合成的cDNA第一链和第二链长度为350-6000碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。
将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀,方法见本章
(二)第二链合成中的9-12步,一般第一链和第二链上样量相同。
1.标准分子量DNA参照物的同位素标记
(1)通常使用λDNA/HindⅢ片段,用KlenowDNA聚合酶进行32P标记
10×HindⅢ缓冲液2.5μl
dATP0.2mmol/L
dGTP0.2mmol/L
[α-32P]dCTP(400Ci/mmol)2μCi
λDNA/HindⅢ标准DNA1μg
KlenowDNA聚合酶1μ
加H2O到总体积25μl
(2)室温放置10分钟,加2.5μl200mMEDTA终止反应,加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。
2.电泳分析
(1)用50mMNaCl,1mMEDTA制备1.4%的碱性琼脂糖电泳,并置碱性电泳缓冲液中30分钟。
(2)取样品液,用TE调整体积,使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/LNaOH,20%甘油,0.025%溴粉兰)。
(3)加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3处,电泳缓冲液为30mmol/LNaOH,1mmol/LEDTA。
(4)将胶浸入7%TCA中,室温放置30分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。
(5)用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X光片(用增感屏时-70℃压片)。
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