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PCR原理及其应用
PCR原理及其应用
姓名:
曹宇
学号:
20104032303
班级:
动物医学(3)班
摘要:
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是体外扩增DNA序列的技术。
它
与分子克隆和DNA序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。
在这
三种实验技术中,PCR方法理论上出现最早,实践中应用也最广泛。
PCR技术使微量的核
酸(DNA或RNA)操作变得简单易行,同时还可使核酸研究脱离于活体生物。
PCR技术
的发明是分子生物学的一项革命,极大地推动了分子生物学以及生物技术产业的发展。
关键词:
聚合酶链式反应
一PCR发展简史
核酸研究已有100多年的历史。
20世纪60年代末70年代初人们致力于研究基因的体
外分离技术,但由于核酸的含量较少,在一定程度上限制了DNA的体外操作。
Khorana于
1971年最早提出核酸体外扩增的设想:
“经过DNA变性,与合适的引物杂交,用DNA聚
合酶延伸引物,并不断重复该过程便可合成tRNA基因”。
但由于当时基因序列分析方法尚
未成熟,热稳定的DNA聚合酶尚未报道,以及寡聚核苷酸引物合成还处在手工及半自动合
成阶段,这种想法似乎没有实际意义。
1983年的一天,美国科学家KaryMullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶中,孕育出
了PCR技术的原型。
经过两年的努力,他在实验上证实了PCR的构想,并于1985年申请
了有关PCR的第一个专利,在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文。
从此PCR技
术得到了生命科学界的普遍认同,KaryMullis也因此获得了1993年的诺贝尔化学奖。
但
Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,这虽然较传统
的基因扩增具备许多突出的优点,但由于Klenow酶不耐热,在DNA模板进行热变性时,
会导致此酶钝化,每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期,给PCR技术操作程序添了不
少困难。
这使得PCR技术在当时成了一种笨拙的中看不中用的实验室方法。
1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶进行PCR,其扩增的DNA片段很均一,真
实性也较高,只有所期望的一种DNA片段。
但每循环一次,仍需加入新酶。
1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(Thermusaquaticus)中提取到一种
耐热DNA聚合酶。
此酶耐高温,在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,
从而极大地提高了PCR扩增的效率。
为与大肠杆菌聚合酶IKlenow片段区别,将此酶命
名为TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase)。
此酶的发现使PCR方法得到了广泛的应
用,也使PCR成为遗传与分子分析的根本性基石。
在以后的十多年里,PCR方法不断地被改进。
例如,应用具有3’一5’修复活性的热稳
定DNA聚合酶代替不具37—57修复活性的TaqDNA聚合酶,减少了在扩增过程中产生的
错误配对,大大提高了在复制过程中的真实性。
原来的PCR只能扩增两段已知序列之间的
DNA,现在可以扩增到已知序列两侧的未知序列[11,甚至可以扩增到序列未知的新基因[2l。
PCR的樟梅托从原桌兽用的DNA发展到直接用RNA作为模板,即反转录PCR,这就使得无目的基因存在,现在已经可以用来定量测定[3],即回答样品中原始模板的确切数目。
PCR扩增的片段也从原先只能扩增几个kb的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片
段[4|。
PCR也从单纯用来扩增基因到能将两个以上的基因连接起来,省去了限制性内切酶
消化和用连接酶连接的步骤,这就是所谓的克隆PCRE5]。
再加上PCR方法与其他方法联合
应用,到目前为止已报道的PCR方法有几十种之多。
总之,自PCR方法建立以来,在20多年的时间里发展很快,已有一系列PCR方法被
设计出来,并广泛应用于遗传学、微生物学乃至整个生命科学研究中。
PCR的建立大大地
推动了生命科学的发展。
由于PCR的实用性和极强的生命力,PCR方法还将会被不断完
善,进一步在生命科学研究中发挥更大的作用。
二PCR技术的基本原理和操作
1、PCR的基本原理
PCR的基本工作原理是以拟扩增的DNA分子为模板,以一对分别与模板互补的寡核苷
酸片段为引物,在DNA聚合酶的作用下,按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成
新的DNA合成。
不断重复这一过程,可使目的DNA片段得到扩增。
因为新合成的DNA
也可以作为模板,因而PCR可使DNA的合成量呈指数增长(图1—1)。
2、PCR的基本成分
PCR包括7种基本成分:
模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三
磷酸(dNTP)、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。
(1)模板DNA
模板DNA是待扩增序列的核酸。
基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的
DNA、cDNA和mRNA等几乎所有形式的DNA和RNA都能作为PCR反应的模板。
虽然
PCR反应对模板的纯度要求不是很高,经过标准分子生物学方法制备的样品并不需要另外
的纯化步骤,但样品中的有些成分(如菌种保护剂等)影响PCR反应。
尽管模板的长度不
是PCR扩增的关键因素,但小片段模板的PCR效率要高于大片段分子。
除了纯化的DNA
外,PCR反应还可以直接以细胞为模板。
(2)特异性引物
引物是与靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段,是决定PCR特异性的关键。
只有当每条引物都能特异性地与模板DNA中的靶序列复性形成稳定的结构,才能保证其特异性。
一般来说,引物越长,对于靶序列的特异性也越高。
以下公式可以计算一段寡核苷酸与一条线性的随机排列的DNA序列中的某一段完全配对的概率。
K=[g/2]G+c×[(1--g)/z]A+T
式中,K是该寡核苷酸出现在DNA序列中的频率;g是该DNA序列分子的G+C含
量;G、C、A、T是特定的寡核苷酸中相应的核苷酸的数目。
对于一个大小为N(N为核苷酸数)的双链基因组,它与特定的寡核苷酸互补的位点
数目咒可用公式咒=2NK计算。
由于密码子的偏爱性以及基因组中存在大量的重复序列和基因家族,上述计算并不完全
反映实际情况。
为了尽量减少非特异性复性问题,建议使用比计算得来的最短序列较长的寡
核苷酸引物。
在引物合成前最好在DNA数据库中进行扫描,以确保引物序列的特异性。
为了节省时间和减少PCR过程中的问题,可以使用计算机程序对引物进行设计、选择和优化。
(3)热稳定DNA聚合酶
热稳定DNA聚合酶是PCR技术实现自动化的关键。
热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离得到的:
一类是嗜热和高度嗜热的真细菌,它的大量DNA聚合酶类似于中温菌的DNA聚合酶工;另一类是嗜热古细菌,其主要的DNA聚合酶属于聚合酶。
家族。
丁aq(T.aquaticus)DNA聚合酶是从嗜热古细菌T.aquaticus中分离到的,也是最先被分离、了解最透彻和最常用的DNA聚合酶。
但对于要求更高保真度、扩增的片段超过几千个碱基对,或者进行反转录PCR(reversetranscription-PCR)时,最好选用其他的一些热稳定DNA聚合酶。
许多种热稳定DNA聚合酶已经商品化。
现在,也有几家制造商将几种热稳定DNA聚合酶混合而成的“鸡尾酒”,这种产品能把几种不同DNA聚合酶的特点组合起来。
(4)脱氧核苷三磷酸(dNTP)
标准PCR反应体系中包含4种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸,即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。
脱氧核苷三磷酸要有一定的浓度,在常规PCR反应液中,每种dNTP的浓度一般在200—250tzmol/L之间。
在50txl反应体系中,这种dNTP浓度能够合成6—6.5txg的靶基因DNA。
但高浓度的dNTP(~>4mmol/L)对扩增反应有抑制作用。
dNTP已经商品化,公司销售的dNTP原液中除去了可能抑制PCR反应的磷酸盐,并将pH调整到了8.1,以防止原液在冷冻与融化时损坏dNTP的分子结构。
尽管如此,对于买来的dNTP原液(100—200mmol/L)最好分装成小份于一20~C保存,以避免反复冻融。
(5)二价阳离子
所有的热稳定DNA聚合酶都要求有游离的二价阳离子。
常用的是Mg2+和Mn2+,一般来说前者优于后者。
由于dNTP和寡核苷酸都能结合MgZ+,因而反应体系中阳离子的浓度必须超过dNTP和引物来源的磷酸盐基团的摩尔浓度。
由于二价离子浓度的重要性,其最佳浓度必须结合不同的引物与模板用实验方法进行确定。
(6)缓冲液
要维持PCR反应体系的pH,必须用Tris-C[缓冲液。
标准PCR缓冲液中的浓度为10mmo[/L,在室温将PCR缓冲液的pH值调至8.3—8.8之间。
(7)一价阳离子
标准的PCR缓冲液中包含有50mmol/L的KCl,它对于扩增大于500bp长度的DNA片段是有益的,提高KCl浓度到?
0—100mmol/L,对改善扩增较短的DNA片段产物也是有益的。
3、PCR的基本操作
PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。
PCR的基本反应由三个步骤组成:
①变性,通过加热使模板DNA完全变性成为单链,同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除;②退火,将温度下降至适宜温度,使引物与模板DNA退火结合;③延伸,将温度升高,热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成新生DNA链延伸。
以上三步为一个循环,新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板,经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。
概括起来讲,PCR方法主要应用于以下几个领域
一、基础研究方面的应用目前从事分子生物学的实验室和研究人员,几乎每天都在使用PCR,可以说几乎没有一个分子生物学家没有使用过PCR。
因此,PCR与分子克隆一样是分子生物学实验室的常规方法,可用于达到以下几个方面的目的。
(一)扩增目的基因和检定重组子科研人员为了研究某一个基因的功能、生产基因工程药物或研制DNA疫苗等,都是先用PCR方法获得目的基因,然后将其克隆至合适的载体。
在进行转基因植物和转基因动物研究时,最后要检定被转入植物或动物是否获得了外源基因,也需用PCR进行检定。
(二)克隆基因常规的DNA克隆技术必须要用合适的限制性内切酶分别对目的基因和载体进行切割,然后用DNA连接酶进行连接。
但是在实际中发现有的待克隆基因找不到合适的酶切位点,面对这种情况,常规的DNA克隆法束手无策。
但克隆PCR就能解决这一难题,它无需用限制性内切酶和连接酶就能将待克隆的两个以上的DNA片段连接起来”。
(三)基因功能和表达调控研究譬如通过PCR对待研究基因进行致突变,就可得知待研究基因的功能,如它是否是毒力相关基因、保护性抗原基因等。
在基因表达调控研究中,用PCR构建突变体亦可用来研究待研究基因的表达受哪些基因调控。
快速反转录PCR用来在mRNA水平上快速检测基因表达。
(四)基因组测序在对某个生物体进行基因组测序时,在最后拼接时总是存在一些“缺口”(gap),现在常用来补缺口的方法是反向PCR。
(五)制备单链模板常规PCR扩增的产物是双链DNA,但用不对称PCR扩增出来的产物是单链DNA~S],可直接用作测序的模板。
(六)致突变PCR的首要用处是扩增基因,第二个用处算得上是构建基因的突变体。
最早的突变体都是自发突变体,后来用亚硝基胍处理或用紫外线照射获得突变体,这些突变体都是单碱基突变体,而且突变频率很低。
20世纪80年代发明了用单链丝状噬菌体M13进行定向突变技术,使DNA诱变向前迈进了一大步,但其诱变频率还是比较低。
现在常用PCR构建DNA的突变体。
通常,PCR扩增DNA的原则是忠实于模板,保持复制产物与原始模板的一致性,而用PCR方法构建突变体是反其道而行之。
用PCR引入突变有两种方法。
一种方法是由酶引起的随机诱变,因为用缺乏3+一5’修复活性的丁aqDNA聚合酶本身就会在扩增过程中产生错误配对而引起突变,再通过改变反应条件使反应朝错配频率增加的方向发展,从而可以增加突变频率,但这种方法引起的突变是随机突变,主要用来构建突变体库,从中筛选出具有特殊性质的个体。
第二种方法是定向突变[o],使突变发生在DNA模板上预先确定的位置,这种突变方法目前应用比较广泛,其诱变信息都包含在设计的PCR引物之中,该方法不仅可以引起点突变,而且可以引起嵌入或缺失突变。
PCR介导产生突变体可以使用双链DNA分子作模板,不必制备单链DNA,实验程序更简单,所需时间也更短。
目前致突变PCR主要应用于基因功能和表达调控、抗体工程、酶工程、疫苗工程和环境保护等领域。
二、PCR在临床上的应用
(一)在遗传学疾病上的应用人类的遗传性疾病是因为某一基因的碱基序列发生了突变,使之缺失或形成某一限制性内切酶的识别位点,通过PCR结合限制片段长度多态性分析(PCR-RFLP),就可以从基因水平对遗传性疾病进行分析。
血友病甲是一种常见的遗传性出血性疾病,患者体内缺乏一种血液凝固初期必需的凝血因子(FⅧ)。
这是由于基因第14个外显子的第336位氨基酸的编码基因发生了突变,产生了一个新的Pst工酶切位点,因此可以用PCR-RFLP对血友病进行诊断。
PCR还可用来检测遗传性耳聋Ilo]和Leber遗传性视神经病。
1988年ChamberlainCu]首次将多重PCR应用于杜氏肌营养不良症(Duchennemusculardystrophy,DMD)的检测,后来用于Becket型肌营养不良症的检测。
1969年Newton等最早提出了用等位基因特异PCR(allele-specificPCR)检测人抗胰岛素基因缺陷。
缺口PCR(gapPCR)可用于地中海贫血的筛查。
PCR还广泛应用于怀孕早期诊断,防止有遗传性疾病婴儿出生,有利于优生优育,提高人口质量。
(二)在肿瘤研究中的应用PCR也已广泛应用于肿瘤的病因与发病机制研究以及肿瘤诊断与治疗的研究。
例如用差异显示PCR能针对不同肿瘤寻找其特异而敏感的标志物,用于早期诊断、判断预后及疗效评估。
化学治疗、放射治疗和骨髓移植使癌症患者的存活率明显提高,不过,复发的风险仍然是完全治愈的显著障碍。
这样,用定量PCR检测微小残留病灶成为进一步改进治疗方案的关键步骤。
对于检测这类复发在分子水平上产生的变化,以致能根据不同病人在分子水平上出现的反应作出治疗决定。
癌症的起因最终也可归结于单个细胞的分子发生改变,从而引起细胞的正常生理发生改变,导致细胞的异常增殖。
单细胞PCR能找到单个细胞内的分子改变情况,从而促进对肿瘤的病因及发病机制的研究c12j。
(三)检测病原体PCR在临床上的应用主要是检测病原体,包括患者是否受到某种病原体的感染,食物中各种病原体的含量是否超标。
有多种PCR方法可以用来检测病原体,原则上讲凡是已知有特异标记的病原体都可用PCR进行鉴定。
可用PCR检测的病原体包括各种细菌、病毒、沙眼衣原体、支原体、寄生虫等。
(四)在基因分型中的应用序列特异性寡核苷酸多态性PCR(PCR-sequencespecificoligonucleotidepolymor—phism,PCR-SSOP)常用于对人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)进行分型c13)。
当患者需要进行骨髓或器官移植时,首先必须进行组织配型工作。
如果捐受双方的遗传基因型相符合,那么受者发生“排斥反应”的概率减小,移植的成功率也相对提高。
因此,捐受双方遗传基因型检测的准确度是关键。
PCR-SSOP法可提供精确配型,使骨髓移植成功率急速跃升。
PCR-限制性片段长度多态性也可用于HLA的分型,用于器官移植免疫学。
PCR除了用于对人类白细胞抗原进行基因分型外,还广泛应用于微生物、昆虫、植物和动物。
微生物分型可用于流行病学调查。
对动植物的基因分型可对物种亲缘关系进行鉴定。
Black等率先将任意引物PCR技术应用于4种蚜虫的鉴别比较,他们用10个碱基的任意引物对4种蚜虫进行任意引物PCR,结果表明,根据电泳图谱能明确区分这4个种。
PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)是一类更为精细的技术,它可以区分某一个基因内单个核苷酸的差异,被广泛应用于细菌、病毒及寄生虫等的分类,它不仅可区分不同的种,而且能把同一种的不同株区分开来。
三、在法医学中的应用最早发现的DNA多态性是由单碱基变化造成的限制性片段长度多态性,于是人们就将PCR-RFLP用于法医学个体识别和亲子鉴定。
后来发现DNA特别是非编码DNA有着丰富的多态性,例如短串联重复序列存在于真核生物基因组的编码序列区和非编码序列区中,其重复次数在个体内存在差异。
因此,大多数短串联重复序列具有多态性,可作为重要的遗传标记,因此可使用短串联重复PCR对短串联重复序列多态性进行检测Ll‘],应用于法医学个体识别和亲子鉴定。
应用PCR做法医学鉴定的优点是样品用量小,只需要ng级、甚至踞级的DNA模板。
由于短串联重复的片段较短,很容易通过PCR扩增、电泳分型,更适用于对高度降解检材的检测。
可变数目串联重复序列(variablenumbertandemrepeat,VN—TR)PCR也可用于法医学个体识别和亲子鉴定。
以上只列举了PCR的一些主要应用,PCR技术在生命科学领域中的其他应用见表l—2
参考文献:
《PCR最新技术原理、方法及应用》黄留玉主编、化学工业出版设,2004.11
《周口师专学报》《PCR的新进展及应用》第十一卷,第四期,1994.12
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