整理猪胃蛋白酶原A基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究.docx
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整理猪胃蛋白酶原A基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究
猪胃蛋白酶原A基因密码子优化及在毕赤酵母中表达的研究
摘要
天冬氨酸蛋白酶一般被称为酸性蛋白酶,在酸性条件下可催化水解蛋白质,是目前重要的工业用酶之一。
胃蛋白酶属于天冬氨酸家族,是研究蛋白质结构与功能关系的重要模型。
胃蛋白酶广泛存在于脊椎动物胃液中。
胃蛋白酶经济价值高,用途广泛,胃蛋白酶在制革、方便食品、奶、口香糖加工制造等行业也有一定的用处。
目前,商业、医药途径获得的胃蛋白酶主要从动物胃组织中提取,受动物脏器资源的限制,胃蛋白酶价格较高;容易残留一些动物自身的蛋白酶类,如一些组织蛋白酶等。
而微生物反应器具有效率高效,操作简单,能够降低成本等优点,所以,通过筛选微生物反应器,然后规模化生产胃蛋白酶颇有发展前途.本文利用基因工程开展胃蛋白酶的表达研究,为解决这些问题提供了新的研究方向。
第一,根据Genebank上公布的猪胃蛋白酶原A基因序列,进行引物设计,通过RT-PCR克隆获得了湖北白猪胃蛋白酶原A基因。
第二,在猪胃蛋白酶原A克隆和序列分析的基础上,构建了毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K-pA。
研究不同pH、不同诱导时间、不同启始浓度和甲醇诱导浓度等因素对表达量的影响。
第三,根据毕赤酵母密码子的偏嗜性,利用定点突变,对稀有密码子进行了优化,希望能够进一步提高重组酵母表达量。
关键词:
胃蛋白酶原A;毕赤酵母;克隆;表达;优化
Abstract
Asparticacidproteases,knownasacidicproteases,cancatalyzethehydrolysisofproteinundertheacidcondition.Pepsiniswildlypresentedingastricjuiceofvertebrate.Currently,commerciallyusedpepsinisgenerallyobtainedfromanimalstomachtissue,whichisveryexpensiveandun-purebecauseoftheanimalorgansresourceconstraintsandotherproteases.Therefore,agreatinteresthasbeenfocusedonthenewmethodofproducingpepA(PepsinogenA).Amongthese,themicrobialproductionissupposedtobethemostpromisingmethodbecauseofitshighyield,simpleproductionprocessandlowercost.Therefore,theobjectiveofthisstudyistryingtoproduceefficientlyrecombinantporcinepepsinwithgeneticengineeringtechnologyinmicrobialsystem.Asparticacidproteasesarewidelyappliedinthefieldsoffeedadditive,vintage,food,leatherandmedicine.PorcinepepsinA,whichistheimportantmodelforthestudyofstructure-functionrelationshipofprotein,belongstothefamilyofasparticprotease.Usinggeneengineeringtostudytheexpressionofpepsinwillsupplyanewwayforsolvingthesequestionsinthispaper.
Firstly,theprimersweredesignedaccordingtothesequenceJ04601inGenebank.AndthentheswinepepsinogenAcDNA,whichwasclonedbyRT-PCRfromtheHubeiWhiteswine.
Secondly,therecombinantplasmidofpPIC3.5K-pAwasconstructed.EffectsofdifferentpH,differentinductivetime,differentinductiveconcentrationandmethanolinductiveconcentrationontheexpressionyieldwerestudied.
Thirdly,basedonthecodonbiasofPichiapastorisandusedSMDtechnology,optimizationoftherarecodons,whichcouldinfluencetheyieldofrecombinant,wasdirectedsuccessfully.Thefurtherresearchisexpectedtoraisetheyieldofrecombinantyeast.
KEYWORDS:
PepsinogenA,Pichiapastoris,Cloning,Expression,Optimization
第一章酸性蛋白酶的研究进展
蛋白酶是一类可以水解蛋白质的酶,在生产、生活及科学研究领域的应用中占有重要地位。
根据活性部位上功能基团种类的不同,蛋白水解酶可分为四大类:
丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶[1]。
天冬氨酸蛋白酶是以两个天冬氨酸残基为活性中心的肽链内切酶,其代表性特征是能够在酸性环境条件下水解动植物蛋白质,将两个疏水氨基酸打断,通过内切作用将蛋白质水解为小肽和氨基酸[2]。
故通常将天冬氨酸蛋白酶称为酸性蛋白酶。
1.1酸性蛋白酶的种类
酸性蛋白酶被分为三个蛋白家族[3],分别是A1起消化作用,包括胃蛋白酶和凝乳酶;A2起溶酶体的蛋白降解作用,包括组织蛋白酶D和E;A3起荷尔蒙调节作用,主要是高血压蛋白原酶。
其中A1和A2蛋白家族具有较高的相似性,A3、A1和A2家族的相似性则相对较低。
微生物酸性蛋白酶则被分为两种[1]:
(i)由曲霉、青霉、根霉、链孢霉等产生的类胃蛋白酶;
(ii)由毛霉和内座壳属产生的类凝乳酶。
1.2酸性蛋白酶的来源
蛋白酶是有机体生存所必需的,在自然界中普遍存在,来源也呈多样性。
传统工艺中胃蛋白酶和凝乳酶主要是从猪、牛、羊等动物的胃粘膜中获得;素食食品加工业中应用的酸性蛋白酶主要是从木瓜、菠萝、无花果属植物中提取;现有的饲料用酸性蛋白酶主要来源于微生物产生。
能够产生酸性蛋白酶的微生物有:
黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉、根霉、微小毛霉、泡盛曲霉以及它们的变异株、突变株。
此外,在逆转录病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)等也有分泌酸性蛋白酶的报道[4-6]。
1.3酸性蛋白酶的性质
酸性蛋白酶是一类具有复杂理化性质的化合物,不同来源的酸性蛋白酶,虽具有一些共同性质,但在底物特异性、抑制剂、激活剂等方面均存在着一定的差异。
1.3.1最适作用pH和pH稳定性
酸性蛋白酶在pH值1.0~5.0之间均比较稳定,一般随着pH的升高酸性蛋白酶的活力会逐渐的降低,当pH大于6时,酶活力基本丧失。
不同来源的酸性蛋白酶的最适作用pH稍有不同。
1.3.2最适作用温度和温度稳定性
酸性蛋白酶一般在50℃以下较为稳定,但是随酶的来源不同而有所差异。
如猪的胃蛋白酶最适温度为40℃,在50℃水浴中保持20min,其剩余酶活力为30%,65℃水浴中保持10min其酶活力基本丧失[7]。
1.3.3抑制剂
一般情况,酸性蛋白酶的抑制剂主要是重氮酮化合物和十二烷基硫酸钠。
霉菌酸性蛋白酶通常不受胃蛋白酶抑制剂对-苯的抑制,但却对N-溴代琉珀酰亚胺和高锰酸钾敏感。
此外,并非每种酸性蛋白酶都会被胃蛋白酶抑制剂或链霉素胃蛋白酶抑制剂抑制,如黑曲霉产的蛋白酶A1,A2和Scytalidiumligrcolum产的蛋白酶B对其均不敏感。
1.3.4金属离子对酸性蛋白酶的影响
有多数实验证明[8,9],Cu2+、Mn2+等离子在低浓度(小于5mmol/L)下,对酸性蛋白酶具有显著的激活作用;Ag+对酸性蛋白酶具有显著但相对较弱的抑制作用;金属离子浓度对蛋白活性的影响较大,一般浓度大于10mmol/L时,Cu2+、Mn2+也会表现出不同的抑制作用;另外,酸性蛋白酶的作用底物不同,金属离子对活性的影响也有差异,但抑制或激活的趋势却不变。
1.4酸性蛋白酶基因工程研究进展
一般在工业中应用的酸性蛋白酶对其本身的性质都有特殊的要求。
而蛋白质工程使重新设计基因,合成具有特殊功能重组酶成为可能。
重组DNA技术和定点突变(SDM)技术又推动了蛋白质工程的快速发展。
利用基因工程技术改善酸性蛋白酶性质以实现其在工业上的应用,是酸性蛋白酶的新的研究方向[1]。
1.4.1国内外酸性蛋白酶基因工程研究
目前,国内在医药与食品领域中应用的酸性蛋白酶,主要是胃蛋白酶和凝乳酶,是
从猪、牛、羊等动物粘膜中提取,产量较低,价格昂贵,难以满足市场需要。
在饲料添
加剂领域中应用的酸性蛋白酶主要来源于微生物生产,国内微生物酸性蛋白酶的研究主
要通过辐射、紫外线和亚硝基胍等物理和化学方法诱变选育产酶活力高、抗逆性好的菌
种,获得了一些很有应用前途的产酶菌株[7,8]。
酸性蛋白酶的基因工程方面的研究近年才开展,邱重晏等[9,10]成功克隆出微小毛酶凝乳酶结构基因并在毕赤酵母中得到表达,还进行了粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因的克隆。
而胃蛋白酶的基因工程研究还未开展。
在国外,酸性蛋白酶基因工程方面的研究开展较早,相关的报道较多,重组凝乳酶
产品已经获得上市,并取得了显著的经济效益。
1.4.1.1胃蛋白酶
在天冬氨酸家族中胃蛋白酶的特异性和动力学,催化和抑制机制以及胃蛋白酶原的激活机制的研究最为深入,而且猪胃蛋白酶原和胃蛋白酶是蛋白质相关结构和功能关系的重要模型。
胃蛋白酶是由一条单链组成的单体酶,属天冬氨酸蛋白酶家族,是一种内切酶,有326(7)个氨基酸残基,含有2个构象相似的结构域,2个活性位点Asp32:
、Asp215:
(一个是以一COOH形式存在,另一个是以一COO-一的形式存在),6个半肤氨基酸残基,3对二硫键,5个色氨酸残基,16个酪氨酸残基,14个苯丙氨酸残基。
分子量约为34.SKD。
胃蛋白酶在pH范围1-3时活性较高,最适pH在2左右,当pH大于6时,胃蛋白酶便失去了活性,而且是不可逆失活[11]。
胃蛋白酶的前体被称为胃蛋白酶原。
猪胃蛋白酶原是多肽链,包括15个氨基酸信号肽,44个氨基酸活性肽,327个氨基酸胃蛋白酶成熟肽,从mRNA得到的cDNA约有1.2kb。
A、B、C、D四种类型胃蛋白酶原中氨基酸组成有较大变化,Pro-5,Leu-6,Arg-8在A-C型中相同,Asp-32,Asp-215是活性中心的两个天冬氨酸残基,它们的初级和高级结构与其他天冬氨酸家族成员有很高的同源性[12]。
1.5酸性蛋白酶的应用
酸性蛋白酶发现于二十世纪初,包括有胃蛋白酶、凝乳酶和一些微生物蛋白酶等而微生物因为其广泛的生化多样性和基因容易改造而成为理想的蛋白酶资源。
酸性蛋白酶现已广泛应用于饲料、食品、酿造、毛皮与皮革、医药、胶原纤维等各个行业之中。
近年来,酸性蛋白酶在作为高效率酒精发酵的优选促进剂和新型饲料添加剂上的应用得到人们广泛的重视[5,13,14,15]。
1.6本研究的目的和意义
饲料资源不足一直是我国养殖业面临的一个大问题,在耕地和水资源严重紧缺的情况下,粮食产量的提高已很困难。
我国动物生产中饲料转化率低,猪、鸡、奶牛等饲料转化率均比国际先进水平低0.3~0.6个百分点,使得饲料资源不足的问题更加严峻。
解决饲料资源不足的问题,可以从开源和节流两方面着手。
开源即开发各种饲料资源,尤其是非常规饲料资源,节流即提高现有饲料资源利用率。
饲料用酶制剂的开发和应用极大的缓解了饲料资源的不足。
添加外源性的消化酶可以补充内源消化酶的不足,提高饲料的利用率;消除饲料中的抗营养因子,降低动物消化道食糜的黏度,改善消化机能;改善肠道菌群分布,提高动物健康状况;参与动物内分泌调节,提高畜禽体内激素代谢水平;减轻畜牧生产对环境的污染;促进细胞包围的淀粉、蛋白质、脂肪的释放,通过水解细胞壁,使营养物质被充分吸收。
因此,饲料用酶制剂在养殖业有着广阔的应用前景。
1.6.1本研究的目的
胃蛋白酶在饲料、皮革、酿酒、医学等领域具有很高的经济价值。
但到目前为止,市场上的胃蛋白酶主要来源于动物的胃组织,如牛、羊、猪等的胃组织。
动物源胃蛋白酶存在很多的问题,受动物脏器资源的限制,胃蛋白酶产量小,价格高,且酶活性低、质量不稳定,易产生有害化学物质残留。
通过基因工程方法,如筛选高产菌株或者胃蛋白酶DNA重组后构建高产工程菌株,是解决胃蛋白酶目前应用“瓶颈”的一个有效方法。
很多学者在这方面做了很多的研究,探索工业发酵生产胃蛋白酶,但目前国内外尚未见到通过基因工程发酵大规模生产胃蛋白酶的报道。
本研究拟通过RT-PCR法,从猪胃腺细胞获得含猪胃蛋白酶原A编码区的DNA片段,并在毕赤酵母系统中表达,选用胃蛋白酶的前提物胃蛋白酶酶原A基因进行表达,这样可以避免胃蛋白酶对表达宿主的毒害作用,可提高宿主的表达产量。
1.6.2本研究的意义
胃蛋白酶是动物消化道种含有的一种主要的水解酶类,由胃底腺细胞分泌,用于消化饲料中的蛋白质。
同时,胃蛋白酶作为饲料用添加剂,能够显著的提高饲料的利用率,促进动物生长,降低幼龄动物对饲料蛋白质消化能力较差而引起的腹泻的发生率,应用于动物生产中具有良好的经济效益和社会效益。
现有的很多商品化的蛋白酶产品,多数是通过微生物发酵制得,来源于动物的胃蛋白酶主要是从动物体中提取。
饲料添加剂中使用的蛋白酶其耐热性能较差,而且生产菌株产酶水平较低,所占由得比重很小,还有非常多的研究工作需要开展。
本研究,以可作为饲用酵母且安全性好的毕赤酵母作为宿主菌,利用基因工程技术开展胃蛋白酶在毕赤酵母中表达研究,以期为生产蛋白酶奠定分子生物学基础。
第二章猪胃蛋白酶原基因在毕赤酵母胞内表达及其培养条件的
优化
1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效表达系统,引起人们越来越大的重视。
已成为分子生物学领域用于表达重组单摆的标准工具之一。
到现在已有400多种外源蛋白在巴斯德毕赤酵母中获得成功表达。
2.1材料和方法
2.1.1菌株、质粒、基因
毕赤酵母胞内表达载体pPIC3.5K、毕赤酵母GS115菌株都是购自Invitrogen公司;克隆质粒pGEM-T购自TaXara公司;PepsinogenA基因由湖北省农业科学院畜牧所克隆、保存。
2.1.2工具酶及其他试剂
限制性内切酶VamHI、EcoRI、NotI、SacI、以及T4DNA连接酶、LATaqTM聚合酶和限制性内切酶均购自TaKaRa宝生物工程公司;T4DNA连接酶及连接试剂盒购自Progmega公司;DNA胶回收试剂盒购CLONTECH公司;DL2000标准分子量购于广东东盛生物有限公司;HindIII标准分子量购于宝生物生物工程公司;N,N,-甲叉双丙烯酰胺、SDS、胃蛋白酶、购于Sigma;过硫酸铵、TEMED购自AMRESCO;干酪素、Folin试剂、硫酸铵、试剂购于中西仪器大全;DAB显色试剂盒、Bradford试剂盒购于上海申能博彩生物科技有限公司;其余试剂为国产、进口分析纯。
2.1.3试验仪器
凝胶电泳装置、电转移槽、电转化仪(Bio-rad);分光光度计(光径1.0cm比色杯);凝胶成像分析系统;超声波仪;震荡器;酶标仪;生化培养箱、电子分析天平、超净工作台、台式高速离心机(CR21G)、-70℃医用冰箱、低温离心机(HITACHICR21G)、Bid-rad电泳仪、台式高速离心机、水平电泳仪、PCR扩增仪、自动高压灭菌(SA-300VA)、恒温水浴锅、紫外透射议。
2.1.4培养基及溶液配制
2.1.4.1培养基
LB培养基:
蛋白胨10g,酵母提取物5g,氯化钠10g,溶于800mL去离子水中,用2MNaOH将pH值调至7.0~7.2,定容至1000mL,高压灭菌(1.034×105Pa)20min;(固体培养基含1.5%的琼脂粉;氨苄青霉素抗性培养基,Amp终浓度为100mg/mL。
)
MD培养基:
YNB13.4g/L,葡萄糖20g/L,生物素4×10-4g/L,琼脂粉20g/L;
MM培养基:
YNB13.4g/L,甲醇5mL/L,生物素4×10-4g/L,琼脂粉20g/L;
YPD培养基:
酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,葡萄糖20g/L(固体培养基1.5%~1.8%琼脂粉)。
BMGY培养基:
酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,YNB13.4g/L,生物素4×10-4g/L,甘油10mL/L,100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0);
BMMY培养基:
酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,YNB13.4g/L,生物素4×10-4g/L,甲醇5mL/L,100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0);
上述培养基中,YNB、甲醇、生物素、氨基酸需过滤除菌,含葡萄糖培养基需在108℃灭菌30min,其余均在121℃灭菌20min。
2.1.4.2WB(WesternBlotting)用试剂
(1)2×样本缓冲液Tris-HCl125.0mmol/L,SDS4.0%(W/V),BromophenolBlue0.005%(W/V),Sucrose350.0mmol/L,DTT150.0μL,pH=6.8。
(2)30%丙烯酰胺贮备液:
丙烯酰胺30g,双叉丙烯酰胺0.8g,溶于超纯水,终体积为100mL以定性滤纸过滤存放于4℃。
(3)3.8倍分离胶缓冲贮备液:
Tris-HCl(pH=8.8)3.0mol/L,SDS1.0%(W/V),存放于4℃备用。
(4)4倍浓缩胶缓冲液贮备液:
Tris-HCl0.5mol/L,SDS0.4%(W/V),pH=6.8存放于4℃备用。
(5)浓缩胶贮备液:
丙烯酰胺贮备液16.7%(V/V),4倍浓缩胶缓冲液贮备液25%(V/V)。
(6)10%过硫酸胺(W/V):
取1g过硫酸胺加入10mL超纯水,使用前新鲜配制。
(7)Tris-甘氨酸电泳缓冲液:
Tris-Base25mmol/L,Glycine250mmol/L,SDS0.1%,pH=8.3。
(8)转移槽电极液:
Tris-Base25mmol/L,Glycine192mmol/L,甲醇20%,pH8.3。
(9)丽春红染色液:
丽春红S2g、三氯乙酸30g、璜基水杨酸30g加水至100mL。
用一份上述储存液加9份去离子水即成丽春红S使用液。
(10)TBST(Tris盐含Tween-20缓冲液):
Tris-Base20mmol/L,NaCl137mmol/L,Tween-200.3%(V/V),pH=7.6。
(11)抗体封闭液:
用TBST缓冲液配制5%脱脂奶粉。
2.1.4.3胃蛋白酶活力测定试剂
(1)0.55M碳酸钠溶液
(2)10%三氯乙酸
(3)0.05mol/LpH=2.0乳酸-乳酸钠缓冲液
A液:
称取10.6g80%~90%乳酸加蒸馏水定容至1000mL。
B液:
称取16g70%乳酸钠加蒸馏水定容至1000mL。
取A液16mL与B液1mL稀释1倍即成0.05mol/LpH2乳酸-乳酸钠缓冲液
(4)0.5%干酪素:
0.5g,以0.5NNaOH1mL湿润。
再加少量0.02MpH=7.5磷酸缓冲液稀释。
在热水浴中溶解,定容至100mL,冰箱中可保存一周。
2.1.4.4其他试剂
酵母细胞裂解液:
5mMEDTA0.18612g,150mMNaCl0.8766g,50mMTris-HCl,1%TritonX-1001mL。
蒸馏水94mL,4℃保存,使用前加入1mMPMSF。
100%饱和硫酸铵:
在100mL水中加入过量硫酸铵,加热至50℃~60℃,保温0.5h,趁热过滤除菌去沉淀,用氨水调节pH至7.5,4℃保存。
2.1.5引物设计
根据Genbank发表的EF108301猪胃蛋白酶原A序列,以带有猪胃蛋白基因(pA)的pGEM-T为模板设计PCR扩增引物,正向引物:
5′-CTTGAATTCTGGGAGCCAGGAA-3′,其中斜体部分为EcoRⅠ酶切位点,反向引物:
5′-TATGCGGCCGCGATAGAACCAAGGCG-3′,其中斜体部分为NotⅠ酶切位点。
PCR反应条件按常规设置进行:
94℃预变性3min;94℃变性45s,57℃复性45s,72℃延伸2min,35个循环,最后72℃延伸10min。
2.1.6PCR产物的酶切及回收
PCR反应条件按常规设置进行:
94℃预变性3min;94℃变性45s,57℃复性45s,
72℃延伸2min,35个循环,最后72℃延伸10min。
取5μLPCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
然后用EcoRⅠ、NotⅠ双酶切该PCR产物,双酶切体系为:
10×Multibuffer1μL,100×BSA0.1μL,EcoRⅠ(10U)0.5μL,NotⅠ(10U)0.5μL,PCR产物5μL,ddH2O2.4μL,总体积10μL。
37℃酶切3h。
2.1.7酵母表达载体的构建与鉴定
图2-1.重组表达载体构建示意图
Fig2-1.ConstructionofrecombinantexpressionvectorpPIC3.5k-pA
重组表达质粒的构建如图2-1,利用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ从PCR产物上双酶切含猪胃蛋白酶原A基因的DNA片段,克隆到载体pPIC3.5K上,得到pPIC3.5K-pA。
用DNA回收试剂盒,回收该产物,对重组子用
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