生物质谱技术应用基本原理与应用.ppt
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生物质谱技术原理及应用,扬州大学测试中心-色质谱机组王郁杨,质谱的概念,质谱分析法是通过对被测样品离子的质荷比(m/z)的测定来进行分析的一种分析方法。
它可用于未知化合物的鉴定、定量分析、分子结构及化学特性的确定等方面。
被分析的样品首先要离子化,然后利用不同离子在电场或磁场的运动行为的不同,把离子按质荷比分开而得到质谱,通过样品的质谱和相关信息,可以得到样品的定性定量结果。
质谱技术的发展,自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源,到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化,质谱基本上处于理论发展阶段。
随后质谱在电离技术和分析技术上的发展和完善,使之很快应用于地质、空间研究、环境化学、有机化学、制药等多个领域。
然而,即使在等离子体解吸(plasmadesorption,PD)和快原子轰击(fastatombombardment,FAB)两项软电离质谱技术出现以后,质谱分析的相对分子质量也只是在几千左右。
生物质谱,真正意义上的变革以80年代中期出现的两种新的电离技术为代表:
电喷雾电离(electrosprayionization,ESI)基质辅助激光解吸电离(matrix-assistedlaserdesorptionionization,MALDI)这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围,使得在fmol(10-15)乃至amole(10-18)水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能,从而开拓了质谱学一个崭新的领域生物质谱,促使质谱技术在生命科学领域获得广泛应用和发展,为蛋白质组研究提供了关键的技术手段。
质谱的结构和工作原理,质谱分析法主要是通过对样品的离子的质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。
因此,质谱仪必须有电离装置把样品电离为离子,有质量分析装置把不同质荷比的离子分开,经检测器检测之后可以得到样品的质谱图,不管是哪种类型的质谱仪,其基本组成是相同,包括离子源、质量分析器、检测器和真空系统。
离子源,离子源的作用是将欲分析样品电离,得到带有样品信息的离子。
质谱仪的离子源种类很多,主要有:
电子电离源(ElectronIonization,EI)化学电离源(ChemicalIonization,CI)快原子轰击源(FastAtomicbombardment,FAB)电喷雾源(ElectronsprayIonization,ESI)大气压化学电离源(AtmosphericpressurechemicalIonization,APCI)基质辅助激光解吸电离源(MatrixAssistedLaserDescriptionIonization,MALDI),电喷雾源(ESI源)利用高电场使质谱进样段的毛细管柱流出的液滴带电,在N2气流的作用下,液滴溶剂蒸发,表面积缩小,表面电荷密度不断增加,直至产生的库伦斥力与液滴表面张力达到雷利极限,液滴爆裂为带电的子液滴,这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈雾滴状,这时的液滴表面电场非常强大,使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子形式进入质量分析器。
(如下图)流出液在高电场下形成带电喷雾,在电场力作用下穿过气帘;气帘的作用:
雾化;蒸发溶剂;阻止中性溶剂分子,电喷雾电离源是一种软电离方式,即便是分子量大,稳定性差的化合物,也不会在电离过程中发生分解,它适合于分析极性强的大分子有机化合物,如蛋白质、肽、糖等。
电喷雾电离源的最大特点是容易形成多电荷离子。
这样,一个分子量为10KD的分子若带有10个电荷,则其质荷比只有1000,进入了一般质谱仪可以分析的范围之内。
根据这一特点,目前采用ESI,可以测量分子量在300KD以上的蛋白质。
MALDI离子源待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发,使分析物与基质成为晶体或半晶体,用一定波长的脉冲式激光(337nm的氮激光)进行照射时,基质分子能有效的吸收激光的能量,使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。
质量分析器质量分析器的作用是将离子源产生的离子按m/z顺序分开并排列成谱。
质量分析器有A、磁式单聚焦分析器(SingleFocusing)B、磁式双聚焦分析器(DoubleFocusing)C、四极杆分析器(Quadrupole)D、离子阱分析器(IonTrap)E、飞行时间分析器(TimeofFlight)F、傅立叶变换回旋共振分析器(FourierTransformIonCyclotronResonance,FTICR),四极杆分析器,由两对四根高度平行的金属电极杆组成的,精密地固定在正方形的四个角上,其中一对电极加上直流电压Vdc,另一对电极加上射频电压V0cost(V0为射频电压的振幅,为射频振荡频率,t为时间),即加在两个极杆之间的总电压为(Vdc+V0cost)。
由于射频电压大于直流电压,所以在四极之间的空间处于射频调制的直流电压的两种力作用下的射频场中,离子进入此射频场时,只有合适m/e的离子才能通过稳定的振荡穿过电极间隙而进入控制器,其它m/e的离子则与极杆相撞而被滤去。
只要保持Vdc/V0值及射频频率不变,改变Vdc、V0可以实现扫描。
是一种无磁分析器,体积小,重量轻,操作方便,扫描速度快,分辨率较高。
是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比。
反射飞行时间质量检测器,飞行时间分析器,飞行时间质量分析器的主要部分是一个离子漂移管。
离子在加速电压V作用下得到动能,则有:
1/2mv2=eV或v=(2eV/m)1/2离子以速度v进入自由空间(漂移区),假定离子在漂移区飞行的时间为T,漂移区长度为L,则:
T=L(m/2eV)1/2可以看出,离子在漂移管中飞行的时间与离子质量的平方根成正比。
也即,对于能量相同的离子,离子的质量越大,达到接收器所用的时间越长,质量越小,所用时间越短,根据这一原理,可以把不同质量的离子分开。
适当增加漂移管的长度可以增加分辨率。
飞行时间质量分析器的特点:
质量范围宽,扫描速度快,既不需电场也不需磁场。
但是,长时间以来一直存在分辨率低这一缺点,造成分辨率低的主要原因在于离子进入漂移管前的时间分散、空间分散和能量分散。
这样,即使是质量相同的离子,由于产生时间的先后,产生空间的前后和初始动能的大小不同,达到检测器的时间就不相同,因而降低了分辨率。
目前,通过采取激光脉冲电离方式,离子延迟萃取技术和离子反射技术,可以在很大程度上克服上述三个原因造成的分辨率下降。
现在,飞行时间质谱仪的分辨率可达20000以上。
最高可检质量超过300000Da,并且具有很高的灵敏度。
MALDI-TOF,检测器,质谱仪的检测主要使用电子倍增器,也有的使用光电倍增管。
由四极杆出来的离子打到高能打拿极产生电子,电子经电子倍增器产生电信号,记录不同离子的信号即得质谱。
真空系统,为了保证离子源中灯丝的正常工作,保证离子在离子源和分析器正常运行,消减不必要的离子碰撞,散射效应,复合反应和离子-分子反应,减小本底与记忆效应,因此,质谱仪的离子源和分析器都必须处在优于10-5mbar的真空中才能工作。
一般真空系统由机械真空泵和扩散泵或涡轮分子泵组成。
机械真空泵能达到的极限真空度为10-3mbar,不能满足要求,必须依靠高真空泵。
扩散泵是常用的高真空泵,其性能稳定可靠,缺点是启动慢,从停机状态到仪器能正常工作所需时间长;涡轮分子泵则相反,仪器启动快,但使用寿命不如扩散泵。
但由于涡轮分子泵使用方便,没有油的扩散污染问题,因此,近年来生产的质谱仪大多使用涡轮分子泵。
涡轮分子泵直接与离子源或分析器相连,抽出的气体再由机械真空泵排到体系之外。
质谱联用技术,质谱仪是一种很好的定性鉴定用仪器,对混合物的分析无能为力。
色谱仪是一种很好的分离用仪器,但定性能力很差。
二者结合起来,则能发挥各自专长,使分离和鉴定同时进行(色谱-质谱联用)。
这样,使质谱仪无论在定性分析还是在定量分析方面都十分方便。
同时,为了增加未知物分析的结构信息,为了增加分析的选择性,采用串联质谱法(质谱-质谱联用),也是目前质谱仪发展的一个方向。
MALDI-TOFMSMALDI-TOF-TOFMSESI-Q-Q-QMSESI-ITMSESI-IT-TOFMSESI-Q-TOFMSESI-FTICRMS,生物质谱,目前商业化的生物质谱仪主要是:
液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱仪(LC-ESI-MS-MS)与带有串联质谱功能的MALDI-TOF质谱仪。
前者是在传统的电喷雾质谱仪的基础上采用飞行时间质量分析器代替四极杆质量分析器,大大提高了仪器的分辨率、灵敏度和质量范围,其商品名有Q-TOF和Q-STAR等;后者是在质谱中加入了源后降解(post-sourcedecay,PSD)模式或碰撞诱导解离(collisionallyinduceddissociation,CID)模式,从而使生物大分子的测序成为可能。
ESI-MS可以和液相色谱、毛细管电泳等现代化的分离手段联用,从而大大扩展了其在生命科学领域的应用范围,包括药物代谢、临床和法医学的应用等。
MALDI-TOF-MS的特点是对盐和添加物的耐受能力高,且测样速度快,操作简单。
此外,可用于生物大分子测定的质谱仪还有离子阱质谱和傅里叶变换离子回旋共振质谱等。
质谱在蛋白质组学中的应用,1、蛋白质组学的定义和基础知识2、质谱在蛋白质学中重要应用蛋白质鉴定差异表达蛋白质定量,什么是蛋白质组学,蛋白质组学是大规模研究蛋白质,特别是蛋白质的结构和功能的学科。
蛋白质组学这个概念是相对应于基因组学产生的,而且通常被视为是基因组学的下一步,且复杂程度远远超出基因组学。
更重要的是,基因组的存在是相对稳定的,而细胞和细胞之间的蛋白质组则是随蛋白质和基因以及环境的生物化学反应而变化的。
同一生物在生物体的不同部位、生命的不同时期以及不同的环境中,具有不同的蛋白质表达。
MALDI源生物质谱,MALDI-TOF-MS基质辅助激光解吸电离离子源(MALDI)飞行时间质量分析器(TOF),MALDI离子源待测物质的溶液与基质的溶液混合后蒸发,使分析物与基质成为晶体或半晶体,用一定波长的脉冲式激光(337nm的氮激光)进行照射时,基质分子能有效的吸收激光的能量,使基质分子和样品分子进入气相并得到电离。
MALDI基质应具有的特性能够嵌入样品分子间并能起到隔离样品分子之间的相互作用(如形成共结晶);能溶解于可溶解样品分子的溶剂;在真空状态下是稳定的;可吸收激光,既与激光形成共振吸收;可激发样品分子离子化.,常用的MALDI基质,是离子在电场作用下加速飞过飞行管道,根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比(m/z)与离子的飞行时间成正比。
反射飞行时间质量检测器,飞行时间分析器,TOF-TOF,MALDI-TOF/TOF,MALDI源可以电离分子质量为102106Da的生物分子并用于质谱分析。
MALDI产生的离子采用飞行时间(TOF)检测器来检测,因此适用于蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子的测定。
通过第一级TOF选择特定多肽和蛋白,而后送入碰撞池进行裂解,再进入第二级TOF进行序列和修饰等结构解析,完成蛋白质的精确鉴定。
根据测定蛋白质酶解后的肽质量指纹图谱、肽序列标签以及一级质谱(MS)结合串联质谱(MS/MS)法去检索核酸或蛋白质序列库,可达到对蛋白质的快速鉴定和高通量筛选。
LCMALDITOF/TOF分析与ABSCIEXTOF/TOF5800系统,5800MALDITOF/TOF串联飞行时间质谱主机,TempoLCMALDI点样系统,Mascot2.3结合MascotDeamon搜索引擎,ProteinPilot4.0蛋白分析工具,TempoLCMALDI点样系统,MALDI的特点,图谱相对简单;激光具有一定的频率,和TOF完美匹配;理论上待测物没有分子量范围限制;样本消
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