携绿色荧光蛋白和调控元件的人胰岛素原基因在HepG2细胞的表达.docx

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携绿色荧光蛋白和调控元件的人胰岛素原基因在HepG2细胞的表达

携绿色荧光蛋白和调控元件的人胰岛素原基因在HepG2细胞的表达

【摘要】目的研究含绿色荧光蛋白（GFP）和人胰岛素原基因的逆转录病毒表达载体在HepG2细胞中的表达。

方法将IRESEGFP片段克隆到含调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体（pLXSNGIIns）中,构建得到表达质粒pLXSNGIInsEGFP,经脂质体介导转染HepG2细胞后,各孔分别加入含有不同浓度葡萄糖的培养液继续培养24h,在荧光显微镜下观察GFP基因的表达,检测细胞上清液中的胰岛素值及考察细胞中胰岛素mRNA的表达量。

结果成功构建逆转录病毒表达质粒pLXSNGIInsEGFP。

转染HepG2细胞后48h,葡萄糖浓度为,,mmol/L,表达GFP基因的细胞数目占总细胞数目的比值分别为（±）%,（±）%,（±）%;胰岛素分泌量分别为（±）,（±）,（±）mU/L,不同葡萄糖浓度诱导的胰岛素mRNA表达量明显不同。

结论含GFP和调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒表达载体能够在HepG2细胞中成功表达,并且GFP基因的表达量反映了人胰岛素的分泌量。

【关键词】绿色荧光蛋白质类胰岛素逆转录病毒科转染基因细胞培养遗传载体

I型糖尿病（TIDM）是一种T细胞介导的,以选择性易感人群胰岛β细胞损害、胰岛素分泌绝对减少为特征的自身免疫性疾病[1]。

近年来,I型糖尿病的基因治疗成为医学研究领域的热点问题之一,而基因治疗的关键是在体细胞中建立受葡萄糖浓度调控的胰岛素分泌功能,并且找到一种高效的基因转移载体和途径。

研究表明可以通过报告基因的表达情况来间接反映目的基因的表达量[34]。

目前绿色荧光蛋白基因已被广泛用作原核细胞和真核细胞的报告基因,是活细胞的理想标记活物。

笔者利用亚克隆技术将绿色荧光蛋白基因（GFP）插入到重组载体中,建立通过报告基因检验目的基因表达的系统,检测该种细胞在不同葡萄糖浓度下其胰岛素的分泌情况,确定报告基因GFP的表达和人胰岛素分泌量之间的关系。

1材料和方法

材料

质粒、菌株和细胞株质粒pLXSNGIIns、PA317包装细胞、NIH3T3由中国医科大学吴志香教授馈赠;质粒pIRESEGFP（美国Clontech公司）;DH5α（日本TaKaRa公司）;HepG2细胞（第四军医大学实验动物中心）;胰岛素检测采用双抗体酶联免疫试剂盒（瑞典Mercodia公司）。

主要药品和试剂限制性内切酶、T4连接酶、TaqDNApolymerase、DNAMarkerDL2000、λHi

ndⅢ（日本TaKaRa公司）;G418（美国Sigma公司）;LipofectamineTM2000转染试剂（美国Invitrogen生物制品有限公司）;质粒提取试剂盒（美国Qiagen生物有限公司）;TrizolReagent、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）试剂盒（美国Invitrogen公司）;DMEM（批号Cat*,美国Hyclone公司）;小牛血清（批号ATC:

9934,美国HyclonePierce公司）;其他试剂均为分析纯。

引物设计与合成根据胰岛素序列设计引物P1和P2,扩增长度为198bp;根据人βactin设计引物P3和P4,扩增长度为206bp,序列如下:

P1:

5′CAACACCTGTGCGGCTCAG3′

P2:

5′TTCCACAATGCCACGCTTCT3′

P3:

5′ATTGGCAATGAGCGGTTCCGC3′

P4:

5′CTCCTGCTTGCTGATGCACATC3′

方法

重组质粒pLXSNGIInsEGFP的构建及筛选质粒pIRESEGFP经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切、末端平滑化后,克隆入Tvector,得到pTIRESEGFP进行序列测定。

质粒pTIRESEGFP和pLXSNGIIns分别经BamHⅠ/HindⅢ双酶切,回收目的片段,用T4连接酶在16℃连接过夜,连接产物转化DH5α,在含Amp的LB平板上选择培养后,挑取菌落,提取重组质粒。

将重组质粒分别转染于HepG2细胞中,用无血清的DMEM50μL分别稀释质粒μg和脂质体μg,将两者混合后,于37℃放置15min使其形成LipofectaminTM2000复合物,使其与原有培养液混匀。

将培养板置于37℃、体积分数为的CO2条件下培养6h,分别加入,,mmol/L葡萄糖溶液,培养过夜,在倒置荧光显微镜下分别观察GFP基因的表达情况,并筛选阳性表达质粒。

　　基因的表达和胰岛素值的测定按文献方法将阳性质粒pLXSNGIInsEGFP经脂质体包裹导入PA317包装细胞,G418筛选后取其上清液转染NIH3T3细胞计算上清液中质粒浓度。

用4×105浓度的培养上清液再经脂质体包裹后转染HepG2细胞。

转染后24h,分别换用含,,mmol/L葡萄糖的DMEM,继续培养24h。

荧光显微镜下观察发绿色荧光的细胞数量,计算其在全部细胞的百分比。

取各孔培养上清液,化学发光法检测胰岛素水平。

胰岛素mRNA水平表达按照RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,采用TaqDNA聚合酶体系,以P1、P2引物扩增胰岛素基因,以P3、P4引物扩增人βactin基因。

用％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

逆转录反应条件:

30℃10min→42℃20min→99℃5min→5℃5min。

PCR反应条件:

94℃1min→（94℃30s→56℃30s→72℃30s）×29→72℃7min。

2结果

携GFP和调控元件的人胰岛素表达质粒受葡萄糖调控的携GFP和调控元件的人胰岛素表达质粒具体调控过程见图1。

该胰岛素调控系统分别受胰岛素抑制、葡萄糖激活,二者协同作用下使胰岛素的分泌量处于正常生理范围内。

其中,IGFBP1P可被胰岛素抑制性调控;GLRE3可被葡萄糖激活;IRES为ECMV病毒的内部核糖体结合位点。

基因表达葡萄糖浓度分别为,,mmol/L时,记数观察到的呈绿色荧光的细胞数量,其占总细胞量的比例分别为（±）％,（±）％及（±）％,说明构建的GFP基因具有随葡萄糖浓度的变化调节GFP蛋白表达的能力（图2）。

胰岛素值葡萄糖浓度分别为,,,mmol/L时,瞬时胰岛素分泌量分别为（±）,（±）,（±）及（±）mU/L，且随葡萄糖浓度的增加，胰岛素分泌的能力增强（图3）。

对于不含葡萄糖的细胞,构建质粒pLXSNGIInsEGFP和原始质粒（对照）的胰岛素水平无统计学意义。

胰岛素mRNA的表达pLXSNGIInsEGFP基础水平未检测到mRNA,加入不同浓度葡萄

1:

空白组（未加葡萄糖的空质粒pLXSN组）;2~5:

质粒LXSNGIInsEGFP组,葡萄糖浓度（mmol/L）分别为,,,与空白组比较,☆:

☆☆:

3讨论

1型糖尿病的基因疗法需要在患者的胰外组织建立呈生理模式调控的胰岛素分泌,要实现这一理想疗法,必须构建能够表达成熟的有生物活性的胰岛素的表达载体,还要有相应的调控元件使该重组胰岛素基因的表达和调控受葡萄糖和胰岛素的双重控制,本课题组已经完成该部分的构建工作[68]。

本实验设计以ECMV病毒的内部核糖体进入位点（IRES）连接目的基因和报告基因,构建双顺反子逆

转录病毒载体,在此载体中,上游单一的启动子转录

两个基因至同一mRNA上,然后两个基因以不同的方式翻译合成蛋白质,上游的基因以真核细胞帽依赖方式翻译合成蛋白质,下游基因以帽非依赖方式翻译合成蛋白质,避免了在转录调控水平上对两个基因表达的影响。

研究结果证实,成功插入GFP基因到含有调控元件的人胰岛素原基因逆转录病毒载体中,构建的GFP基因和人胰岛素基因两者都具有随培养液中葡萄糖的浓度变化调节自身表达的能力,并且两者的变化趋势一致。

该葡萄糖浓度范围与人或糖尿病动物模型经常测得结果一致,表明胰岛素的分泌基本在生理范围内波动。

因此本研究成功建立了利用报告基因检测目的基因表达的系统,简化了检测手段,为下一步动物实验奠定理论和实践基础的同时,也为基因治疗糖尿病的安全性研究和临床实验提供科学依据。

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