兽医免疫学实验技术doc.docx
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兽医免疫学实验技术
兽医免疫学实验技术目录第一部分实验室工作手册第一章总则7附实验室一般规则第二章细则9第一节无菌室工作须知9第二节送洗须知9第三节试剂的保存和使用须知10第四节菌种、毒种和细胞株保存须知11第五节超低温冰箱和液氮罐使用须知13第六节高值仪器使用须知14第七节常用小型仪器使用须知第八节实验记录须知第九节值日工作人员的职责须知第十节文献资料查阅须知第十一节试验准备须知第十二节其他注意事项第二部分常用仪器的操作程序及使用注意事项第一节多功能紫外可见分光光度计第二节酶联免疫阅读仪第三节电子天平第四节各类显微镜及显微摄影技术第五节核酸蛋白检测仪第六节各类离心机第七节酸度计第八节各类冰箱的使用和保养第九节电泳装置第十节空调机、抽湿机、超静工作台第十一节自动颗粒制冰机第十二节其他仪器设备第三部分实验室常规试验程序第一章组织培养及常用溶液的配制第一节鸡成纤维细胞(CEF)、鸭成纤维细胞(DEF)培养第二节组织培养溶液配方第三节配制溶液注意事项第二章淋巴细胞杂交瘤技术及使用溶液的配制第一节配合程序第二节溶液配方第三节单抗制作技术中的其他方法第三章组织培养使用物品的准备第一节一般原则第二节玻璃器皿的准备第三节橡皮制或塑料制品的准备第四节其他用品的准备第五节纯水制备程序第六节新生犊牛血清的制备第四章酶联免疫吸附试验(ELISA)的程序第一节间接ELISA试验第二节直接ELISA试验第三节夹心ELISA试验第四节竞争ELISA试验第五节DOT-ELISA试验第六节酶标组化法第七节ELISA常用溶液的配方第八节酶标抗体的制备第五章免疫荧光试验的程序第一节脂多糖敏化甲醛化绵羊红细胞的制备第二节蛋白质敏化SPBC的制备第三节PHA试验程序第七章免疫胶体金试验程序第八章免疫球蛋白亚类测定第一节免疫扩散法第二节ELISA法第九章免疫血清制备第一节免疫球蛋白提取与纯化第二节几种常见抗原的制备第三节抗血清的制备程序第十章细菌学试验种的几个常用技术第一节细菌学总数估测第二节几种常用培养记得配方第三节常用细菌的分离鉴定程序第十一章细胞免疫学试验程序第一节玫瑰花环试验第二节淋巴细胞转化试验第十二章动物试验的一般规则第十三张电泳技术、层析技术第十部分家畜传染病学试验指导家畜传染病学试验规则、实验报告内容实验一炭疽的诊断实验二巴氏杆菌的诊断实验三结核杆菌病和布鲁氏杆菌的检疫实验四猪瘟的诊断实验五鸡新城疫的诊断I鸡新城疫病病毒的鸡胚分离II免疫荧光实验III血凝和血凝抑制实验实验六鸡马立克氏病的琼扩诊断实验七沙门氏菌快速检测技术实验八鸡白痢的检测第一部分实验室工作守则第一章总则
一、严禁在实验室内吸烟、饮食(办公室除外);严禁挪用公物。
二、所有物品用后立即归回原处。
三、菌种、毒种严禁带出实验室。
四、各种病毒材料在废弃前应做好无害化处理。
五、爱护仪器设备,用后做好清洁整理工作。
六、使用高值仪器前仔细阅读仪器说明书,严格遵守操作规程进行操作。
初次使用应在有关老师或工作人员指导下进行。
七、损坏器皿和仪器需登记,并及时向有关负责老师汇报。
八、坚持用水、用电安全,使用电炉时不得离开现场,下班时检查水电,锁紧门窗。
九、厉行节约。
在一切工作中树立节约精神,培养集和各种溶液用多少配多少,可以回收的东西及时回收。
节约用电,随手关灯。
十、值日人员应履行职责,并督促其他工作人员做好实验后的整理工作。
十
一、实验室内所有资料阅后放回原处,一般不得带出实验室,特殊情况下需借阅,应经过批准,并登记。
十
二、每进行一个试验需事先提出实验设计,列出所需材料及药品清单和经费预算(一式二份)。
报请批准后付诸实施(交批准任一份)。
十
三、领用或购置药品和器材需事先列出申请(一式二份),写明用途并报请批准(交批准人一份)。
十
四、新进入实验室工作的研究生须经过一段时间的工作训练。
熟悉实验室工作守则,掌握各种器材的清洗消毒等准备工作,掌握各种仪器的使用和保养方法。
十
五、每周六下午为教研室例会(学术汇报和讨论,工作总结和安排)和室内外卫生大扫除。
附
一、实验室一般规则
一、实验事是进行教学和科研的重要基地,是办好学校的基本条件之一。
实验室人员应忠诚党的教育事业,认真贯彻党的教育方针,为培养四化建设有用人才尽职尽责。
二、实验室要坚持改革,按照勤俭办学的原则,少花钱,多办事,办好事,注意提高效益,反对浪费。
三、实验室以实验教学为主,在保证教学和科研任务的前提下,可以充分利用现有的技术和设备条件,积极开展技术服务工作。
四、实验室应保持肃静、文明、整洁的工作环境和良好的秩序,实验室严禁吸烟,无关人员不得进入实验室,院外人员到实验室参观学习,须经主管部门同意或院领导批准。
五、加强科学管理,建立健全必要的规章制度如各类人员的岗位责任制,仪器设备和物资材料使用报关制度等。
六、加强安全,剧毒物品要严格领用。
对易燃易爆、有毒放射性等有害物品,单独存放,并且指定专人保管,严禁随意乱放和擅自挪用。
七、实验室人员和学生在实验前应做好充分准备,熟悉实验内容和操作规程,精心实验。
八、学生进入实验室学习,实验室人员应向学生进行勤俭节约、安全,以及有关科技保密等方面的教育,精心指导,确保实验课顺利进行。
九、实验人员对实验室仪器要定期清点,维护保养,开展以仪器完好率、安全、卫生等评比活动,对成绩显著的个人和集体进行表扬和奖励。
对工作不负责造成损失者进行批评教育直至经济处罚和行政处分。
第二章细则第一节无菌室工作须知
一、无菌室内非请莫入,非本实验室人员未经批准不得在无菌室内工作。
二、所有药品器材均为无菌室专用,一般不得带初无菌室,作为其他用处。
三、所有物品用后立即放回原处。
四、进入无菌室工作之前需修剪指甲,手清洗后在用1%新洁尔灭溶液洗手消毒,换鞋进入,使用超静台需着无菌室专用工作服并用酒精棉球擦手消毒。
超静台每次使用后都应仔细做好清洁整理工作。
五、卫生值日人员要勤打扫。
注意保持无菌室的相对无菌条件,经常用新洁尔灭溶液擦洗地面、桌面、台面和试剂厨。
经常将无菌室工作服送至洗涤室清洗消毒,使用后的鼠尸及鼠笼随手带出无菌室。
每日为除湿机倒水。
注意无菌时使用药品、物品的消耗,及时通知工人准备,或汇报负责老师以便补充。
六、配培养基和其他试剂都应有记录,瓶子上映注明品质、浓度、日期及配制人,使用过的培养基及无菌试剂应自觉注明使用人姓名,以防止交叉污染。
七、严格控制细胞之间或病原之间的交叉污染,容易发生交叉污染的细胞或病毒不能在同一超净台内处理。
八、扭力天平使用之后应休止,在将读数盘回零,托盘及天平表面擦洗干净,药勺也应洗净擦干。
使用后的药品应将盖拧紧,放回原处。
九、离心机使用时应注意平衡,使用后将离心杯、橡皮套管清洗干净,倒置晾干。
十、CO2孵箱为通气培养箱,应自觉维护箱内清洁,定期将托板、托盘换出消毒。
如培养瓶内培养基漏出,立即用酒精棉讲瓶外表面迹箱内污迹擦拭干净,箱内蒸发用水威无菌蒸馏水,应注意补充。
四周水箱内的水定期补加。
CO2浓度、温度控制器等零部件请勿动,发现问题及时报告。
十
一、组织培养用眼科剪刀镊子使用后应洗净烘干,防止生锈。
十
二、浸泡细胞培养板统一使用75%酒精(CP或AR)或医用酒精。
第二节送洗须知
一、送入洗涤室的所有物品均应分类置于指定的地方,以便洗涤。
二、被病原材料污染的器械物品等在送洗之前作无害化处理和面交洗涤室工作人员,并详细说明处理方法。
三、送洗的所有玻璃、塑料器皿都应冲洗后浸泡于自来水中。
使用的金属滤器应仔细冲洗后,完全浸泡于水中。
包扎滤器用的牛皮纸和纱布可重复使用,应置于干燥箱内烘干。
四、注意节约。
可以重复使用的物品如离心管塞、牛皮纸和沙布等不应废弃。
五、注射器、针头、剪刀、镊子、微量吸样器用塑料滴头,高速离心机用塑料离心管皆由使用者自己清洗、烘干,并放回原处。
六、每一实验若需较大量的物品或一些特殊用品,应提前通知洗第室工作人员准备,特殊洗涤要求要当面交待。
第三节试剂的保存与使用须知
一、化学试剂在保存与使用过程中往往会因为自身物理化学特性和环境条件的变化发生变质。
化学试剂的变质分为潮解、霉变、熔化、凝固、变色、聚合、氧化、腐蚀、挥发、风化、升华和失效等。
影响化学试剂变质的主要因素为水分、氧气、光辐射和温度等。
二、化学试剂的保存温度分为室温、4℃、冰冻(-20度)和超低温(-70度以下)等。
应根据化学试剂的物理化学特性和瓶签要求分别保存于不同温度条件下。
三、化学试剂一般都应密闭、干燥保存。
有些化学试剂(如氧化钙、乙酸钾、硝酸钙和氯化钙)极易从空气中吸收水分而潮解或分解变质。
这些化学试剂要特别注意密闭、干燥。
有些生物制剂(如酶和荧光素)不仅需要低温保存,而且很易吸潮而变质失活。
这类药品应置于干燥器中冰箱内保存,使用这类试剂要注意需待干燥器内温度升高时方可开启干燥器上盖,以防在干燥器内开成水汽。
四、根据试验要求选用不同纯度的化学试剂。
不可超级使用,但也不要降级使用。
(见附表)
五、使用进口药品和贵重药品需办理申请批准手续。
取用时进行登记。
六、有毒药品要由专人保管,使用过程中一定要注意个人保护和环境保护。
七、所有化学试剂使用后拧紧瓶盖,立即回到原保存条件下。
八、同一种药品一瓶未用完之前不得开启或领用新瓶。
九、每一种药品使用一个药勺。
注意防止试剂间相互污染。
药勺使用后应立即洗净。
十、严禁将化学药品用作食用或作燃料。
附表我国化学试剂的等级标志试剂级别中文名称代号瓶签颜色使用要求一级品保证试剂或“优级纯”G.R.绿色用作基准物质,主要用于精密的科学研究和分析鉴定二级品分析试剂或“分析纯”A.R.红色主要用于一般科学研究和分析鉴定三级品化学纯粹试剂或“化学纯”C.P.蓝色用于要求较高的有机或无机化学实验,也常用于要求较低的分析实验四级品实验试剂L.R.棕色或蓝色或其他颜色主要用于普通的实验和科学研究上,有时也用于要求较高的工业生产中第四节菌种、毒种和细胞株保存须知一,菌种、毒种和细胞严禁携出实验室。
其它实验室如需引进,须经过负责老师批准,并办理有关手续。
二,所有菌种、毒种和细胞都应专用登记本上按规定项目详细登记,请参阅有关登记本目录说明。
三,根据保存物不同要求保存于不同条件下。
一般分为-30,超低温(-70以下)和液氮保存。
四,越低温冰箱内按位置分类存放,液氮贮罐分类存放。
五,菌种、毒种和细胞在接种继代时应严格防止交叉污染。
六,取出时必须在登记本上登记。
第五节超低温冰箱和液氮贮罐使用须知一,超低温冰箱使用须知1,超低温冰箱仅限于存放毒种,菌种,血清抗体、单抗腹水、药品试剂和某些病料等。
2,放入箱内所有制物品必须按规定位置分类存放。
取放都应在登记本上登记。
3,箱门开启时应尽可能短暂,关门后锁紧扣好。
严禁在停电时开启箱门。
4,及时清理、剔除无保存价值的物品。
二,液氮罐使用须知1,液氮容器分为二类。
一类为贮存容器,这类容器保存液氮时间长,主要用于静置贮存液氮,存放时应保持垂直,切不可充装液氮后倾倒。
可以空载运输,但不可在充满液氮下作长或短途运输。
另一类为运输容器,这类容器耐冲击震动,可充装液氮后作长短途运输。
2,只能使用配套瓶封闭颈口,不可用其它不合格物代替。
否则会因液氮持续蒸发,形成压缩气压,导致致容器的损坏或爆炸。
3,容器首次充满液氮以及停用后重装,因内胆是常温,开始充装时切勿太快,以免液氮剧烈沸腾,向外飞溅。
1、2、容器首次充满液氮以及停用后重新充装,因内胆是常温,开始充装时切勿太快,以免液氮剧烈沸腾,向外飞溅。
3、加注液氮时不要将液氮冲在颈管上(应使用漏斗加注液氮),液氮不宜充装过满,切勿使液面高到与玻璃钢颈管接触。
4、取放冰存物时应细心谨慎操作,要注意尽量缩短颈口开放时间,避免吸入空气中水份影响贮存效果。
5、如发现液氮蒸损量突然增多或外壳上部的金属表面突然结霜,说明容器已经损坏,应立即停止使用。
6、存放细胞需使用统一规格的布袋,引绳要牢靠。
7、存放细胞后登记,并统一编号。
取出细胞后也在登记薄上登记,禁止取存细胞不登记不现象。
8、保持液氮罐的线头齐整,经常清理弃去无保存价值的细胞。
第六节高值仪器使用须知
一、使用高值仪器前需仔细阅读仪器说明书。
初次使用时应在有关人员指导下进行。
二、使用过程中如发现故障,应立即报告有关人员。
三、使用高值仪器必须登记,使用后做好清理工作,加盖防尘罩。
四、高值仪器由专人负责。
负责同志做好仪器的调试保养和监督使用工作。
五、非本室工作人员使用高值仪器需经批准。
并需由本室工作人员都督使用。
第七节常用小型仪器使用注意事项
一、电子交流稳妥压器1连续工作时间一般不要超过6小时。
2、关机后需待5分钟方可重新开启电源开关。
二真空泵1使用前查看没油位。
以停泵时注油标中心为宜。
2、泵进气口连续通畅大气运转不得超过1分钟。
三、电动吸引器使用前观察润滑油是否正常(油面应在油镜中央)。
若油面偏听偏低,应随时加注。
四、小型台式离心机1、电机要三个月加注润滑油一次。
2、碳刷磨损小于10mm时应调换新碳刷。
3、试管、试管套都应对称平衡。
严禁在重量非相等时使用。
五、手提式高压蒸气消毒锅1、每次使用前应检查器内水量是否保持3立升左右。
2、对溶液消毒,应灌注于耐热玻璃内,以不超过3/4瓶为妥。
3、消毒物品放置时互之间应留有空隙,有得于蒸汽穿透,提高消毒效果。
4每次消毒开始时应将放气阀打开,待器内空气逸出,有较急蒸汽喷出时,关闭放气阀进行消毒(也可开始时先关闭放气阀待加热至5磅/平方英寸放气)1、对器械、器皿消毒后,可立即打开安全阀,使蒸汽迅速排去。
对瓶装溶液消毒终了后,切勿立即放蒸汽,否则,瓶内溶液可因压力聚变而剧烈沸腾、溢出,甚至瓶子爆破。
2、刚消毒后的瓶装溶液不能直接置于水泥台面,否则因骤冷易发生爆炸。
3、消毒锅盖上装有工作压力1.4千克/平方厘米的安全阀,应经常将此阀开放数次,使之处于灵活状态。
六、电热干燥箱1、内室底板不宜放消毒物品,以免影响散热或被烤焦。
2、消毒时需开启鼓风机并适当旋开排气孔。
3、在加热过程中将加热开关旋至“2”(二组加热器工作)。
达到恒温后可关闭一组加热器(旋至“1”),以免功率过大,影响恒温灵敏度。
4、加热或恒温时如欲观察工作室试品,可开启箱门,在玻璃门外观察。
在温度高于100(度)时不得开启玻璃门,以防玻璃器皿骤冷炸裂。
第八节实验记录须知
一、实验记录统一用碳素水书写,要求字迹正规、条理清晰。
二、实验记录应注明年月日。
三、记录应详细。
每次实验所用的材料及所采用的方法都应详细记录,以备查证。
对观察的结果应作如实详尽的描述,必要时进行简单的归纳和说明。
发现与预料结果不符的现象应分析原因。
试验过程中发现的对试验结果有影响的意外情况诸如停电、污染等也应在记录本上注明。
四、实验记录应与实验同步进行,不要做回忆性记录。
五、试验进行一个阶段后应及时对所得的实验结果进行分析综合。
提出下一阶段工作重点(实验项目及所采取的技术路线等)。
六、实验记录为本实验室拥有,一般情况下不得带出实验室。
如需借用应经过批准。
七、课题结束后,记录应及时整理归档。
第九节值日工作人员的职责须知
一、完善值日制度,设专人管理。
二、值日人员应做好每天的清洁卫生工作,整理台面,检查仪器运行情况,并监督其他工作人员做好实验后的清洁整理工作。
三、注意安全工作,防盗放火防水。
下班时检查水电,关好门窗。
四、无菌室值日人员的职责参见第一节,注意督促大家执行。
五、及时向负责老师汇报用完或缺少的试剂、物品等,以便补充。
损坏的仪器设备,应即使报告,以免影响研究工作。
第十节文献资料借阅、复印须知
一、实验室所有的图书、期刊、文献资料等阅后放回原处,一般不得带出实验室,特殊情况下(包括外组工作人员)需借阅应经批准,并登记。
二、复印资料,需经负责老师批准,复印后做好登记工作,避免重复复印同一份资料。
三、课题结束后,应及时整理装订好所有文献资料,交给管理人员妥为保管。
四、借阅原始记录需经有关老师同意,注意防止遗失。
五、有关文献检索的方法,请查阅有关工具书。
第十一节实验准备须知
一、首先借阅文献,写出实验设计,并经行可行性论证。
二、提交所需材料药品清单和经费预算,力求节约。
三、交负责老师批准后,方可付诸实施。
四、需要特殊材料(包括实验动物)和药品等,应提早订购。
五、新进入实验室工作的研究生须先经过一段时间的工作训练。
在经行论文工作之前,必须提交开题报告。
六、阶段实验结束后,及时小结,提出下阶段的工作重点。
第十二节其它注意事项
一、配制一切试剂都应注明品名、浓度、日期和配制人。
二、操作挥发性浓酸(如冰乙酸)和挥发性有机溶液剂等应在通风有毒气体和有臭虫味气体均应在通风进行。
凡是发生烟雾、有毒气体和有臭虫味气体均应在通风处进行。
三、强酸强碱等废液不能直接倒在水槽中。
四、不能用凡士林封闭层析柱下口玻璃活塞。
五、台平用后擦净,二个托盘重合以保护刀口。
六、实验台用后立即做好清洁工作。
药品、试剂和器材放回原处,需要洗涤的物品送至洗涤室。
七、经常清理,剔除存放于冰箱,试剂橱内无保存价值的物品。
八、非本室工作人员借用仪器,药品和器材需经过批准,并办理借用手续。
九、工作人员之间要发扬合作精神,提倡导互相帮助。
第二部分常用仪器的操作程序及使用注意事项第一节多功能紫外可见光度计M750A型多功能紫外可见光光度计在开启仪器电源之前,请检查“光源选择钮位于”关“;”量程选择”钮位于“零”;“100T”钮位于“零”。
1、依据待测样品选择波长。
2、根据波长选择开启H灯(200.0360.0nm)或W灯360.0750.0nm,仪器预热5分钟.3、“量程选择”位于”校零”位置,用”调零”钮调零点.4、空白样液置于光路中,盖好样品室盖,”量程选择”置于”X1”档调节”100T”,使表头指针为”100”.5、重复调零和调100步骤至仪器完全稳定.6、拉出手柄使待测样品于光路中,读取A值.如样液浓度较高时可使用”X0.1”档,此时A值的读数为表头读数加1.0.7、“量程选择”钮位于”校零”位置,打开样品室盖取出比色皿.8、关机“量程选择”置于“校零”,“100T”逆时针旋至“零点”,“光源选择”置于“关”,拨下主机电源插头。
9、将仪器用罩子罩好。
10、在使用登记本上登记。
注意事项1、“量程选择”钮位于“X1”或“X0.1”时不得打开样品室上盖;2、在测量过程式中不读数,“量程选择”钮应置于“校零”位置,以延长光电管使用寿命;3、使用权用微量池或半微量池时,应用微量进样器进液,注液时不得溢出池外,也不得碰伤上端的石英窗。
4、H灯关后间隔10分钟才可再开启。
5、比色皿用后应用去离子水充分淋洗,倒置于吸水纸上,使其干燥。
第二节酶联免疫阅读仪DG3022型酶联免疫检测仪使用注意事项1、第一次使用该机的工作人员,使用前请务必仔细阅读使用说明书;了解并掌握操作方法开机调零工作选择(包括统计处理及其它功能)赋值测量必要时可在有关负责人员的指导下熟悉该2、关机后5秒内不要立即开机,仪器正在工作时,其交流电压不允许闪动。
3、仪器工作时,操作人员不要离开。
4、仪器运行中出现失常,应即时排除故障或汇报老师处理。
5、裁下一部份打印纸带时,应使用剪刀剪的方法。
6、仪器须注意防尘防潮,加外罩。
7、更换滤光片前必须关闭电源。
第一节电子天平MettlerAE240电子天平操作步骤1、轻按控制盘,几秒钟后显示盘显示“0,0000”或”0.00000”“0.0000”表示量称范围0.1mg200g,0.00000表示量称范围0.01mg40g。
2、如盘上显示的量程与要求的一致,则直接进入第三步,如不一致,则按如下方法改变量程范围
(1)轻按信控制盘,待rag200/40显示后松开。
(2)再轻按控制盘一下,从显示盘上可风量程转变为另一种。
(3)几秒钟后显示器显示0。
3、在称量盘上加一块称量纸,待显示盘上读数稳定之后,轻按控制盘以去皮。
4、待显示0后,加所需称量物品。
5、稳定性检测点消失之后,显示盘上的数据即为物品的重量。
6、向上轻掀控制盘以关闭显示器,取下称量物品和称量纸。
7、用专用毛刷将称量盘和天平内室扫干净。
8、关闭天平玻璃门,罩上防尘罩,不要拔下电源插头。
9、在使用用登记本上登记。
注意事项1、电子天平在开启使用之前需将电源插头接到220V电源(无需稳压器)上至少30分钟,校准天平时则需按在电源上1小时。
2、电子天平在使用之后不要拔下电源插头。
3、AE240电子天平有2种称量精确度,即0.1mg和0.01mg。
没有必要时不要选用0.01mg档。
4、洒落在天平称盘和天平室上的药品务必在称量后用毛刷拭去。
5、非保养仪器人员不要擅自对天平进行校准,不合格的校准操作很容易使天平损坏。
第三节各类显微镜及显微镜摄影技术显微镜系列使用注意事项1、显微镜应置于干燥、阴凉、空气流通的地方,避免受潮受热。
2、经常注意光学零件清洁,目镜有灰尘可用吹风球或软羊毛管将灰尘吹去或扫去,油浸物镜使用权用后要及时用抹镜纸醮少许二甲苯抹净油脂。
3、保持机械部份的灵活,经常上些润滑油。
4、调试好的各类显微镜,使用时请勿轻易调动,发现故障时,请及时报告负责制人员,及时排除。
5、荧光显微镜关闭后,必须间隔15分钟以上才能重新开启,用后要登记。
6、对所用显微镜(普通、倒置、相差、荧光)和显微镜摄影装置,若不熟悉,请事先详细阅读说明书,或在保管人员的指导下使用。
7、显微镜摄影装置务必在负责人员协助下进行。
摄影材料应精选,注意代表性,厉行节约。
第四节核酸蛋白检测仪ZW2080A紫外测仪操作步骤1、开机前,首先将电源、检测器和记录三部分电路连接,通上电源。
2、把波长旋钮旋到所需波长刻度上。
3、把主机量程开头拔到期100T档。
4、按通记录仪电
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