胰腺实性假乳头状肿瘤的无标记双光子激发荧光成像.docx
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胰腺实性假乳头状肿瘤的无标记双光子激发荧光成像
胰腺实性假乳头状肿瘤的无标记双光子激发荧光成像
【摘要】胰腺实性假乳头状肿瘤(SPT)是一种恶性较低的分泌性上皮肿瘤,此类肿瘤在胰腺肿瘤中较为罕见但在年轻女性中的发病率较高,根据世界卫生组织的研究,将该疾病命名为胰腺实性假乳头状肿瘤,患者通常表现为非特异性的临床症状,最常见的症状有腹部疼痛、腹部肿块,恶心等,少数患者还会出现包括黄疸、贫血、胃肠道梗阻和胰腺炎等症状。
目前,胰腺SPT诊断的国际标准主要依据的是病理学或细胞学,诊断的主要方法是通过苏木精、伊红染色剂对待测细胞进行染色,利用染色剂的特性突显出待测细胞的病理学或细胞学特征,之后利用传统光学显微镜观察其结构特征,从而达到诊断的目的。
但是,由于传统的染色法十分依赖染色剂的使用,在染色的过程中不仅时间长速度慢,而且染色剂的用量和染色时间也不好控制,因而容易造成染色不当引起的误诊。
本文介绍了一种新型的光学诊断技术,可以很好地在弥补传统染色法缺点的同时提高诊断的准确度。
具体方法是:
利用双光子激发荧光(TPEF)显微镜在无需苏木精、伊红(H&E)染色的前提下对人体正常胰腺组织和SPT组织的切片进行荧光成像,确定它们的组织结构、细胞形态以及细胞质的变化。
我们的研究结果显示:
所获得的正常胰腺组织的高分辨率TPEF图像可以较完整地显示出细胞的形态与结构,而胰腺SPT的高分辨率TPEF图像可以清晰地显示出其病理结构的特征。
此外,基于TPEF图像,我们还计算了胰腺SPT组织和正常胰腺组织的核质比,来定量描述他们在形态学上的差异。
以上的研究结果表明:
利用双光子激发荧光成像技术能够对胰腺组织切片进行无标记成像,与传统的染色法成像相比,不仅可以节省大量时间,而且还能提高诊断的准确率,是一种优于传统诊断方法的新型光学诊断方法。
【关键词】双光子激发荧光成像;光学诊断;胰腺实性假乳头状肿瘤;未染色组织切片
目录
1.引言……………………………………………………………………………………………………………4
2.材料与方法……………………………………………………………………………………………………5
2.1样品制备………………………………………………………………………………………………5
2.2荧光显微镜检测………………………………………………………………………………………5
2.3定量方法………………………………………………………………………………………………5
3.实验结果………………………………………………………………………………………………………6
3.1正常胰腺组织的TPEF显微成像………………………………………………………………………6
3.2胰腺SPT组织的TPEF显微成像………………………………………………………………………6
3.3对正常胰腺和胰腺SPT的定量分析…………………………………………………………………8
4.讨论……………………………………………………………………………………………………………8
5.结论……………………………………………………………………………………………………………8
6.致谢……………………………………………………………………………………………………………9参考文献………………………………………………………………………………………………………9
1.绪论
胰腺实性假乳头状肿瘤是一种分布于外分泌胰腺细胞中的低度恶性肿瘤[],发病人群主要集中于年轻女性,它由Frantz在20世纪50年代首次发现,并依照此类肿瘤的组织学特征,将该肿瘤命名为囊性-实性-乳头状上皮性肿瘤[]。
按照2000年世界卫生组织(WHO)的分类,胰腺SPT通常被定义为由围绕在毛细血管周围的单细胞组成的上皮性肿瘤,其形态表现为坚实的团块以及假乳头状的组织结构,并伴随着出血和囊性变性[,][]。
大约有75–80%的胰腺SPT是在胰腺中发育的,但其有可能会入侵邻近的器官或向远处转移,如肝、淋巴结、肠系膜、网膜、腹膜[,][],患者通常表现为非特异性的临床症状[],最常见的症状为疼痛和腹部肿块,少数患者还会出现包括黄疸、贫血、胃肠道梗阻和胰腺炎等症状[],从病理学的角度分析,如果这种肿瘤出现在神经、血管的周围或者是向其他器官转移,那表明胰腺SPT的恶性增强并且发展成转移性肿瘤[]。
由于胰腺SPT的起源和非特异性的临床症状都具有不确定性,所以该疾病经常会造成误诊[],目前在治疗此疾病的过程中,手术切除是做好的治疗方法[],据报道,95%的患者可以通过手术切除得到治愈[]。
在黄曦等人的临床研究和统计中,胰腺SPT在男性、女性中的发病率之比为1:
10,患者的平均年龄为33岁且集中在17~60岁之间。
在这些病例中,有4例在毫无症状的情况下被确诊,有7例表现出明显的临床症状,如腹痛、呕吐、食欲不佳等,有5例的发病部位在胰头部,剩下的患者的发病部位都为胰体和胰尾部[](如表1)。
所以,尽早了解SPT的变化就显得尤为重要,这将有助于在手术前提高诊断的准确性。
病例
性别
年龄(岁)
部位
1
女
26
胰头
2
女
37
胰体、胰尾
3
女
34
胰体、胰尾
4
女
17
胰头
5
女
25
胰体、胰尾
6
女
60
胰头
7
女
29
胰体、胰尾
8
女
23
胰头
9
女
31
胰体、胰尾
10
女
24
胰头
11
男
58
胰体、胰尾
表1:
11例胰腺SPT的临床情况
目前,胰腺SPT的病理学诊断方法主要依靠传统的H&E染色、B超、CT和MRI法。
H&E染色法虽然能呈现较为完整、准确的胰腺SPT图像,但是存在耗时长、染料用量难以把握、染色时间难以确定、染料污染严重等缺点;而B超、CT和MRI法虽然无需染色,但其比较容易造成误诊,原因在于当胰腺SPT的直径较小时,其囊性结构不够明显,主要表现为实性结构,这样的影像学结构与胰腺癌的特称相似,两者很难区分;而且,胰腺SPT还有低恶性,生长速度较低,具有扩散生长成巨大肿瘤的能力等特点,这些特点决定了胰腺SPT从影像学的角度无法确定其来源这一事实[]。
因此,目前较为常用的诊断方法仍是利用H&E染色等病理分析法,但如果能开发出一种快速、准确、无污染的诊断成像工具,同时这种工具还能获得在分辨率和图像质量上能媲美H&E染色图像,那么这种方法将会改变诊断SPT的现状。
近年来,双光子激发荧光(TPEF)成像技术已广泛应用于组织结构、未染色组织细胞的成像[]。
这种技术提供了一种在不添加任何外源性荧光剂且保持组织活性的情况下,对细胞和亚细胞结构进行非侵入性的高分辨率激光扫描[-][][]。
TPEF与传统的光学成像技术相比,具有更深的穿透深度、更高的分辨率和较低的光漂白、光毒性,最重要的是,由生物组织内荧光产生的TPEF信号可以清楚地呈现细胞的形态。
在本文中,我们试图利用TPEF成像技术得到SPT的病理信息,并分析、对比正常胰腺组织和胰腺SPT组织的区别,归纳、总结出利用TPEP图像诊断胰腺SPT的方法,从而验证TPEF显微镜具有无需通过H&E染色就能诊断胰腺SPT的能力。
2.材料与方法
2.1样品制备
此次研究中所用到的胰腺SPT样本来自于一位被诊断出在胰尾处患有SPT的27岁女性,该患者在进行手术切割治疗前便得知了术后切除的病灶将作为本次研究的实验样本,而且得到了患者的同意,并经福建医科大学第一附属医院审查委员会批准。
样本于2012年9月由福建医科大学第一附属医院的医生负责进行提取,提取的样本中还包括病变组织周围2厘米的正常胰腺组织。
手术切除后,该样本被分为若干组SPT样品并放置在包含10%固定剂(甲醛)、脱水酒精和石蜡填充剂的石蜡块中进行保存。
在对样品进行TPEF显微成像之前,每个样品都进行了乙醇和二甲苯的脱蜡处理,以保证排除石蜡等残留物质对实验的影响,然后将每份样品放入恒冷箱切片机中切片,每片5um厚[2]。
所制得的每小片样品都用TPEF成像技术进行成像,并经由同一名病理学家进行比较和分析。
2.2荧光显微镜检测
双光子荧光显微镜是一种基于双光子激发荧光原理制成的新型荧光显微镜,由激光扫描共聚焦显微镜发展而来的,即在激光共聚焦显微镜的基础上结合双光子激发荧光技术。
双光子激发荧光的原理是:
在短脉冲激光的照射下,待测样本中的荧光探针分子几乎同时吸收2个波长较长的光子,在经过一个很短的激发态时间后,荧光团发射出一个波长较短的光子;其成像效果等于长波长一半的光子,如用910nm的近红外光去激发某荧光物质,其与用455nm波长的激光作为光源所达到的成像效果相同。
由于双光子荧光显微镜所采用的激发光源为高能量锁模脉冲飞秒激光器,其脉宽可达100fs,重复频率80至100MHz,所以其对细胞的损伤较小且光子密度高。
当使用高数值孔径(NA)的物镜将脉冲激光的光子聚焦时,物镜的焦点处的光子密度是最高的,而双光子激发也只发生在物镜的焦点上,所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔,从而提高了荧光检测效率。
在本研究中所使用到的TPEF显微系统由三个主要部分组成[,][]:
一台倒置显微镜、一台调谐范围在700–980nm的锁模钛:
蓝宝石激光器和一种高通量扫描倒置显微镜。
一台10W的全固态激光器(Verdi-10,Coherent)用于产生一束重复频率76MHz、脉宽约130飞秒的脉冲光,激光器的光强通过声光调制器进行控制。
在实验中所使用的激发波长为810nm,并通过Plan-Neofluar物镜(40×,NA¼0.75,CarlZeiss)将激发光束聚焦到组织样本上同时收集波长范围在350~710nm的后向内在TPEF信号,所测得的信号通过一个可调的HRZ200精密聚焦试验台合成为大面积的TPEF图像,所有图像具有12位的像素深度,每个像素点耗时2.56毫秒。
2.3定量方法
本研究中还引入了核质比的概念,它被定义为在每个组织细胞内,细胞核相对于细胞质大小的比值,核质比的作用是量化胰腺SPT和正常胰腺细胞的不同形态学特征,具体量化方式如下:
首先,通过观察TPEF图像中细胞核和细胞质的形态学特征,将细胞质与细胞核分开;其次,通过图像处理的方法计算出两者所占面积的大小,最后将二者的面积之比定义为核质比。
每个被观察的样本中都拥有20个完整且细胞质和细胞核轮廓清晰的细胞,以便可以得到较为普遍的结论,而且每个细胞都要通过一个可调节的精密聚焦试验台进行观察[]。
在定量分析的过程中,采用计算机处理的方式,运用SPSS16.0对样本进行统计学分析,该软件处理的主要数据为胰腺细胞的核质比,每一份样本的核质比数据由该样本内含有的20个细胞的核质比的平均值表示,它们的标准差则代表数据的偏差系数,偏差系数越低,样本越具有代表性。
正常组织和肿瘤组织的统计学差异情况采用单因素方差分析和最小差分分析进行判断,当P的值<0.05时,代表二者的差异具有统计学意义。
3.实验结果
3.1正常胰腺组织的TPEF显微成像
如图1所示,当激光照射到胰腺SPT组织内的双光子荧光探针时,荧光探针在激发态寿命内连续吸收两个810nm的光子,并发出一个短波长的光子,也就是所谓的激发荧光,接收装置收集这些荧光信号并反馈给处理器进行图像处理,最终生成胰腺SPT的TPEF图像。
图中绿色的部分代表正常胰腺细胞的形态,其余的部分由于不存在双光子荧光探针而呈现黑色。
由图中可以看出,通过TPEF信号得到的人类正常胰腺组织的非线性光学图像清晰地显示出规则的组织结构和细胞形态,从图中我们可以看出结合胶原纤维的明亮纤维结缔组织(白色三角符号)分布在小叶间导管的周围(白色实线),小叶间导管分部于由立方上皮细胞组成的导管壁周围。
从图中还可以看出正常胰腺组织的典型排列(白色虚线),由于细胞质的TPEF信号强,而细胞核的TPEF信号弱,故腺泡细胞(红色箭头)的形态也可以在此图中体现,从图中我们还发现腺泡细胞与细胞核的极性保持一致而细胞核呈圆形黑洞状[]。
以上所得出的结论与公认的H&E染色病理分析结果相类似,包括胰腺泡、小叶间导管、纤维结缔组织、和腺泡细胞的位置与形态信息等。
图1:
正常胰腺组织的双光子激发荧光图。
未染色的正常胰腺组织的高分辨率、大面积TPEF图像(460.68×460.68mm2)揭示了胰腺腺泡(白色虚线)、小叶间导管(白色实线),纤维结缔组织(白色三角符号)和胰腺腺泡细胞(红色箭头)的信息。
(图像单位长度100um)
3.2胰腺SPT组织的TPEF显微成像
胰腺SPT的组织学特征表现为实性假乳头区和囊性空间[]。
与正常胰腺组织的TPEF成像原理相似,胰腺实性假乳头状肿瘤组织中的双光子探针受到超短脉冲激光的激发后发出较短波长的荧光。
图2所示的是具有代表性的大面积胰腺SPT实性假乳头状区域的TPEF图像,由于肿瘤细胞的细胞质可产生强烈的TPEF信号,而细胞核却无法产生强TPEF信号,故可以很容易地辨别出单个细胞的位置。
从TPEF图像可以观察到,聚集状区域由轻度异型的单一多边形上皮细胞(白色箭头)组成,这些细胞是经由一个细胞分化形成的,细胞核呈卵形折叠状,有不明显的核仁和极少核分裂[],排列呈现一致性,并伴随着无数的毛细血管(红色箭头)。
这些毛细血管由于太脆弱以至于无法保持完整的结构,从而使其容易发生出血和坏死的现象[7]。
同时,典型的假乳头状结构(白色实线)也可以通过排列在毛细血管周围的细胞而观察到。
所有这些结论,包括上皮细胞,毛细血管和假乳头状结构的位置及组织学特点都与公认的胰腺SPT相关病理分析结果一致。
图2:
未染色的胰腺SPT切片的TPEF图像。
高分辨率、大面积TPEF图像(471.48×471.48mm2)清晰地揭示了胰腺SPT毛细血管(红色箭头),上皮细胞(白色箭头)和假乳头状结构(白色实线)的相关信息。
(图像单位长度100um)
胰腺SPT组织中的囊性空间是其呈现的另一个特点。
如图3所示,在已经得出的关于常见胰腺SPT囊性空间内的组织学研究结果也可由TPEF图像得到验证,作为该肿瘤的另一个特点,果冻状或囊性组织(红色箭头)的出血症状也可以被清晰的观察到。
此外,从图3中还可以看到细胞变性的证据,包括泡沫状细胞聚集体(白色箭头),透明基质聚集(白色三角符号)和胆固醇结晶(黄色箭头)。
在TPEF显微图像中我们也清楚地认识到上皮肿瘤细胞存在的聚集现象,但由于其粘附性差,故经常表现为核周的细胞质空泡化。
以上结果表明,在囊性空间中,TPEF显微图像能清晰地显示出其中各结构的组织学特征,而且这些组织学特征可以与采用传统方法得出的结果相一致,包括出血,泡沫细胞聚集体,透明基质聚集,和胆固醇结晶等。
图3:
在胰腺SPT的囊性空间中,由一张具有代表性大面积TPEF图像可以看出,在囊性空间中存在清晰的胆固醇结晶(黄色箭头),泡沫状细胞(白色箭头),透明基质(白色三角符号)和出血区域(红色箭头)。
(图像单位长度200um)
3.3对正常胰腺和胰腺SPT组织的定量分析
由于癌细胞具有无限增殖的能力,所以癌细胞的有丝分裂相对于正常细胞而言异常旺盛,这个特性在形态学中表现为细胞核区域变大,细胞质中与有丝分裂有关的结构增多[]。
因此,为了定量地描述胰腺SPT不同于正常胰腺细胞的形态学特征,我们基于TPEF图像对正常细胞和肿瘤细胞的核质比进行了计算,如图4所示。
实验结果表明,在统计学差异P<0.05(P<0.001)的情况下,基于TPEF图像所得到的正常细胞N/C比为0.30±0.07,而肿瘤细胞为0.94±0.12,这说明癌细胞的核质比远大于正常细胞,即癌细胞的细胞核体积明显大于正常细胞,符合癌细胞的结构学特点。
以上结果表明,TPEF显微成像技术具有对胰腺SPT光学诊断的能力而且无需H&E染色。
图4:
由TPEF图像计算出的正常胰腺组织、胰腺SPT的核质比,误差线表示的是标准偏差,P代表统计学差异。
4.讨论
由于胰腺SPT通常没有具体的临床症状而且病因未知,所以胰腺SPT常常造成误诊[]并且导致术后的复发和转移[10]。
目前,由于传统的H&E染色法既耗时费力又污染环境,所以诊断胰腺SPT的方法仍需要改进。
在此次研究中,我们证明了TPEF显微成像技术有能力对胰腺SPT的组织病理学特征进行成像,而且无需额外的染色,同时此方法还具有稳定,快速,无污染的优点。
实验表明,TPEF显微成像技术能清晰地显示正常细胞的细胞质、核仁和基质中的胶原,同时也能检测出胰腺SPT的变异情况,例如实性假乳头状结构,泡沫状细胞组织,透明基质和胆固醇结晶,基于胰腺SPT特殊的病理形态,还可对胰腺SPT、正常胰腺和其他胰腺肿瘤进行区分。
此外,从TPEF图像中提取的N/C比值可用于定量地区别胰腺SPT和正常胰腺组织,其结果与癌细胞的结构特点一致。
值得一提的是,未染色的组织切片避免了由于H&E染色过度或不足所造成的对比度、分辨率对成像质量的影响,同时,TPEF成像使得细胞核和核仁的位置更容易被定位,判断细胞核和核仁区域更准确,这在肿瘤诊断中具有很大的价值。
因此,TPEF成像技术可以从未染色组织的切片中提取在亚细胞水平上的高对比度、高分辨率的图像,从而诊断是否患有胰腺SPT,其结果能与传统方法相媲美。
在未来,它将在早期的组织学诊断中具有广阔的应用前景。
5.结论
综上所述,我们在本次研究中所提出的无需染色,仅通过使用TPEF显微镜就能呈现正常胰腺和胰腺SPT组织的方法,所得到的结果符合已经公认的病理结果[],而且通过TPEF显微成像,我们可以从未染色的组织切片中提取出正确的病理诊断信息,这与传统方法得出的诊断结果也是一致的。
在未来,TPEF显微镜有可能作为一种有效的诊断工具,对大量胰腺样本进行非入侵性检测。
6.致谢
论文写至此处暂告一个段落,自己的大学生涯也将就此结束,回首在福建师范大学度过的四年时光,不经感慨光阴似箭、岁月如梭,一路走来感受到了许多人的温暖,特别是在撰写毕业论文的几个月时间里,家人对我无微不至的关心与照顾,友人对我无条件的支持与帮助都给了我巨大的动力。
在此,我还要特别感谢我的导师朱小钦老师孜孜不倦的教诲,在撰写论文的过程中,朱小钦老师秉着对科学严谨、认真的态度,对我严格要求,事无巨细,我在圆满完成了自己本科毕业论文的同时也学到了对待科学、对待人生应有的严肃态度。
对于朱小钦老师教会我的专业知识与人生哲理,在此我表示衷心的感谢!
祝老师身体健康,阖家幸福!
参考文献
Two-photonExcitedFluorescenceImagingofthePancreaticSolid
PseudopapillaryTumorwithoutHematoxylinand
EosinStains
CollegeofPhotonicandElectronicEngineering
OpticalInformationScienceandTechnology
136022012096HangtaoGuoGuidanceteacherXiaoqinZhu
【Abstract】Solidpseudopapillarytumor(SPT)ofthepancreasisansecretoryepithelialtumorwithlow-grademalignantpotential.Thetumorsarerareinpancreatictumorsandpresentmorecommoninyoungfemales.AccordingtothestudyoftheWorldHealthOrganization,Peoplewouldbenamedthediseaseofsolidpseudopapillarytumorofthepancreas.Patientsusuallypresentwithnon-specificclinicalsymptoms.Themostcommonsymptomsisabdominalpain,abdominalmass,nauseaandsoon.Asmallnumberofpatientswillappearsymptomsincludejaundice,anemia,gastrointestinalobstructionandacutepancreatitisetc.Atpresent,thegoldstandardforaccuratediagnosisofpancreatictumorwasmostlydependingonthepathologicaland/orcytologicalevaluation.Themainmethodforthediagnosiswerestainedtotestcellsbyhematoxylinandeosinstaintreatment.Thepathologicalorcytologicalfeaturesofthecellstobetestedwerehighlightedbythecharacteristicsofthestainingagents,afterusingthetraditionalopticalmicroscopetoobserveitsstructurecharacteristics,soastoachievethepurposeofdiagnostic.However,duetotheuseoftraditionaldyeingmethodsrelyheavilyonthedyeingagent,inthedyeingprocess,notonlylongslowandstainingagentanddyeingtimeisnotgoodcontrol,thereforeitiseasytocausemisdiagnosiscaused.Inthiswork,anewtypeofopticaldiagnostictechnologyisintroduced,whichcanmakeuptheshortcomingofthetraditionaldyeingmethodandimprovetheaccuracyofthediagnosis.Thespecificmethod:
TPEFmicroscopywasappliedtoobtaintheimagesoftissuesectionsabouthumannormalpancreasandSPTofthepancreaswithouthematoxylinandeosin(H&E)staining,forthepurposeofidentifyingtheorganizationstructural,cellmorphological,andcytoplasmchanging,whichwerethencomparedtotheircorrespondingH&Estainedhistopathologicalresults.Ourresultsshowedthatimagesofhighresolutionofnorm
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