EP 5110 细菌内毒素测试使用指南中英文2.docx

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EP5110细菌内毒素测试使用指南中英文2

EP5.1.10细菌内毒素测试使用指南（中英文2/2）  

2015-12-2823:

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31|  分类：

 EP

Forroutinetestsonthisproduct,itmaybeexpedienttodilute1mLofthesolutiontobeexaminedto20mL（MVD/2roundedtothenextlowerwholenumber）.However,ifthistestresultispositivetheanalystwillhavetodilute1mLto41.67mLandrepeatthetest.Adilutionto41.67mLisalsonecessarywhenthetestisperformedtosettleadispute.

对于此药品的日常检查，可以取1ml供试液稀释至20ml（MVD/2四舍五入至最接近的整数）。

但是，如果该测试结果为阳性，则化验室要稀释1ml至41.67ml，重复测试。

如果有争议，仲裁测试也必须使用41.67ml的稀释。

3.RISKASSESSMENT 风险评估

Asstatedinsection1ofthisgeneralchapter,theconclusionisgenerallyjustifiedthattheabsenceofbacterialendotoxinsinasubstanceorproductimpliestheabsenceofpyrogeniccomponents,providedthepresenceofnon-endotoxinpyrogenicsubstancescanberuledout.Toruleoutthepresenceofnon-endotoxinpyrogensinsubstanceorproducts,theuseofthemonocyte-activationtest（2.6.30）isrecommendedatreleaseorduringdevelopmentoftheproductionprocess;ifanychangesaremadetotheproductionprocessthatcouldinfluencethequalityoftheproductregardingpyrogenicity,themonocyte-activationtestisrepeated.Examplesofsuchchangesincludetheuseofdifferentrawmaterials,adifferentproductionsiteanddifferentprocessparameters.

正如本通论第1部分所述，如果可以排除非内毒素热源物质的存在，则原料药或制剂中不存在细菌内毒素通常可以论述得到结论不存在热源成分。

为了排除原料药或制剂中存在非内内毒素热源，推荐在放行或生产工艺研发时使用单核细胞激活测试（2.6.30）。

如果对生产工艺进行了变更，可能会影响产品热源方面的质量，则需要重新进行单核细胞激活测试。

这类变更的例子包括使用了不同的原料、不同的生产场所和不同的工艺参数。

Thedecisiontousethetestforbacterialendotoxinsasthesolepyrogenicitytestistobemadeaftercarefulevaluationoftheriskofthesubstanceorproductcontainingnon-endotoxinpyrogens.Theriskassessmentismadewithconsiderationgiventoanyfactorthatcouldresultintheinclusionofpyrogensnotdetectedbythetestforbacterialendotoxins.Theitemsbelowconstituteanon-exhaustivelistoffactorstobeconsideredintheriskassessment.

使用细菌内毒素测试作为单一热源测试的决策要在对含有非内毒素热源的原料药或制剂进行谨慎的风险评估之后方可做出。

风险评估要考虑可能会导致产品含有不被细菌内毒素测试检出的热源。

以下所列项目是风险评估中要考虑的因素清单，并非完整清单，

Productionprocess （chemicalsynthesis,fermentation,biotechnologicalmethod）.

Forproductsoffermentation,theexpressionsystemistobeconsidered（prokaryotic,eukaryotic）and,foraprokaryoticexpressionsystem,whethergram-positiveorgram-negativebacteriaareused.Alsotheculturemediacomponentsareexaminedwithconsiderationgiventotheirorigin（synthetic,animal,plant）.

生产工艺（化学合成、发酵、生物技术方法）：

对于发酵产品，要考虑表达系统（原核、真核），对于原核表达系统，要看是否使用革兰氏阳性或革兰氏阴性菌。

对于发培养基成分，要检查其来源（合成、动物来源、植物来源）。

Bioburden.

Thepotentialpresenceofgram-positivebacteriaandfungiascontaminantsoftheactivesubstance,excipientsorstartingmaterialsandrawmaterialsusedintheproductionofthemedicinalproduct,andtheoriginoftherawmaterials（synthetic,animal,plant）havetobetakenintoconsideration.Thequalityofthewaterplaysanimportantroleontheoverallevaluation.

生物负载：

要考虑革兰氏阳性菌和霉菌可能会污染原料药、辅料，或药品生产用的起始物料和原料药，以及原料来源（合成、动物来源、植物来源）。

水的质量在总体评估中起着尤为重要的作用。

Capabilityofthedownstreamprocess.

Itmustbeverifiedwhetherbacterialendotoxinremovalstepsarepartofthedownstreamprocess.

下游工艺能力：

要确认下游工艺中是否有细菌内毒素清除步骤。

Safety.

Thetargetpopulationandtherouteofadministration（e.g.intravenous,intrathecal）havetobetakenintoaccountintheriskassessment.

安全性：

在风险评估中要考虑目标种群和给药途径（例如，静脉注射、鞘内）。

Stabilityofthedetectableendotoxins.

Ithastobeconsideredthattheabilitytodetectendotoxinscanbeaffectedbyinteractionwithcertaincomponents,storageconditionsorstoragetime,temperatureandhandlingofthetestsample.Proceduresthatdemonstratestabilityofthedetectableendotoxincontenthavetobeestablishedforstoring,handlingandmixingofsamples.

可检出内毒素的稳定性：

要考虑检出内毒素的能力会受到特定组份的相互反应、存贮容器或存贮时长、温度和测试样品的处理方式的影响。

证明可检出内毒素含量的稳定性的程序必须指定其存贮情况、处理情况和样品混和情况。

4.REFERENCEMATERIAL 对照物

EndotoxinstandardBRPisintendedforuseasthereferencepreparation.IthasbeenassayedagainsttheWHOInternationalStandardforEndotoxinanditspotencyisexpressedinInternationalUnitsofendotoxinpervial.TheInternationalUnitofendotoxinisdefinedasthespecificactivityofadefinedmassoftheInternationalStandard.

内毒素标准BRP是用作对照的物品。

它根据WHO国际内毒素标准进行了标定，其效价表述为国际单位内毒素/瓶。

内毒素的国际单位定义为指定质量的国际标准物的活性。

Forroutinepurposes,anotherpreparationofendotoxinmaybeused;providedithasbeenassayedagainsttheInternationalStandardforEndotoxinortheBRPanditspotencyisexpressedinInternationalUnitsofendotoxin.

日常工作中，也可以使用另一个内毒素对照品，但需要已根据国际标准内毒素或BRP进行了标定，且其效价表述为国际单位内毒素。

NOTE:

1InternationalUnit（IU）ofendotoxinisequalto1EndotoxinUnit（E.U.）

注：

1国际单位（IU）内毒素等于1内毒素单位（EU）。

5.WATERFORBET 细菌内毒素测试用水

WaterforBETissterilewaterthatisfreeofdetectablelevelsofendotoxin.Usuallyitiscommerciallyavailableandcertified.

BET测试用水为无菌水，内毒素低于可检测水平。

通常可能商业采购获取并有证书认可。

Generalchapter2.6.14.BacterialendotoxinsindicatesthatmethodsotherthantripledistillationmaybeusedtopreparewaterforBET.Reverseosmosishasbeenusedwithgoodresults;someanalystsmayprefertodistillthewatermorethan3times.Whatevermethodisused,theresultantproductmustbefreeofdetectablebacterialendotoxins.

通则2.6.14“细菌内毒素”说明三次蒸馏以外的方法也可以用于制备BET检测用水。

反渗透水的使用情况良好，一些化验员可能倾向于使用蒸馏3次以上的水。

不管使用哪种方法，所用的水中细菌内毒素必须低于可检测水平。

6.pHOFTHEMIXTURE 混合物的PH值

Inthetestforbacterialendotoxins,optimumgel-clotoccursforamixtureatpH6.0-8.0.However,theadditionofthelysatetothesamplemayresultinaloweringofthepH.

在细菌内毒素的测试中，混合物理想凝胶pH值为6.0-8.0.当然，将鲎试剂加入样品后可能会使得pH值降低。

7.VALIDATIONOFTHELYSATE 鲎试剂的验证

Itisimportanttofollowthemanufacturer’sinstructionsforthepreparationofthesolutionsofthelysate.

要根据生产商的指示对制备鲎试剂溶液。

Thepositiveend-pointdilutionfactorsingel-clotmethodsAandBareconvertedtologarithms.Thereasonisthatifthefrequencydistributionoftheselogarithmicvaluesisplotted,itusuallyapproachesanormaldistributioncurvemuchmorecloselythanthefrequencydistributionofthedilutionfactorsthemselves;infactitissosimilarthatitisacceptabletousethenormalfrequencydistributionasamathematicalmodelandtocalculateconfidencelimitswithStudent’st-test.

将凝胶方法A和B中的阳性终点稀释因子转换成log对数。

原因是如果这些对数值的频数分布画出后，通常会比稀释因子本身的频数分布更接近正态分布曲线。

由于其非常的相似，因此可以使用正态分布作为数学模型，并采用t检验来计算置信限度。

8.PRELIMINARYTESTFORINTERFEREINGFACTORS 干扰因素初步测试

Somesubstancesorproductscannotbetesteddirectlyforthepresenceofbacterialendotoxinsbecausetheyarenotmisciblewiththereagents,theycannotbeadjustedtopH6.0-8.0ortheyinhibitoractivateenzymaticreaction（suchas β-D-glucans）.

有些物质或制剂不能直接测试内毒素，因为它们无法与试剂混合，它们不能调节pH值至6.0-8.0，或它们的性质或活化酶反应（例如β-D-葡聚糖）。

Thereforeapreliminarytestisrequiredtocheckforthepresenceofinterferingfactors;whenthesearefoundtheanalystmustdemonstratethattheproceduretoremovethemhasbeeneffectiveandthatbyapplyingthisprocedure,anybacterialendotoxinspresenthavenotbeenremoved.

因此，需要进行初步试验来检查是否存在干扰因素。

如果化验员发现了干扰因素，则必须证明测试程序能有效清除它们，并且通过执行这些程序，不会清除任何细菌内毒素。

Theobjectofthepreliminarytestistotestthenullhypothesisthatthesensitivityofthelysateinthepresenceofthesubstanceorproducttobeexamineddoesnotdiffersignificantlyfromthesensitivityofthelysateintheabsenceoftheproduct.AsimplecriterionisusedinmethodsAandB:

thenullhypothesisisacceptedwhenthesensitivityofthelysateinthepresenceoftheproductisatleast0.5timesandnotmorethantwicethesensitivityofthelysatebyitself.

初步试验的目的是测试零假设（原假设），即鲎试剂在有原料药或制剂存在时的灵敏度，与没有原料药或制剂存在时灵敏度并无显著区别。

在方法A和B中使用了一个简单的标准：

当鲎试剂在有产品存在时，其灵敏度至少达到0.5倍，且不超过2倍鲎试剂自身的灵敏度，则零假定成立。

Thetestforinterferingfactorsingel-clotmethodsAandBrequirestheuseofasampleofthesubstanceorproductinwhichnoendotoxinsaredetectable.Thispresentsatheoreticalproblemwhenanentirelynewproducthastobetested.Hence,adifferentapproachwasdesignedforquantitativemethodsC,D,EandF.

在凝胶方法A和B中干扰因素测试要求使用原料药或制剂的样品，其中不允许检出内毒素，如果要测试的是一个全新的产品，这时理论上是行的通的。

因此，在定量方法C、D、E和F中，设计了不同的方法。

NotethatmethodsDandE,whichusedachromogenicpeptide,requirereagentsthatareabsentinmethodsA,B,CandF,andhencecomplianceofmethodsA,B,CorFwiththerequirementsforinterferingfactorscannotbeextrapolatedtomethodDormethodEwithoutfurthertesting.

注意，方法D和E使用了色谱多肽，要使用方法A、B、C和F中不曾使用的试剂，因此在没有进一步测试时，方法A、B、C或F符合干扰因素要求的结论就不能外推至方法或方法E。

9.REMOVALOFINTERFERINGFACTORS 干扰因素的消除

Theprocedurestoremoveinterferingfactorsmustnotincreaseordecrease（forexample,byadsorption）theamountofendotoxininthesubstanceorproducttobeexamined.Thecorrectwayofcheckingthisistoapplytheprocedurestoaspikedsampleofthesubstanceorproducttobeexamined,thatis,asampletowhichaknownamountofendotoxinhasbeenadded,andthentomeasuretherecoveryoftheendotoxinaftertheremovalprocesshasbeenconducted.

消除干扰因素的程序一定不能增加或降低受检原料药或制剂中的内毒素数量（例如，由于吸附）。

正确的检查方法是使用受检原料药或制剂的加标样品来测试，也就是说，将已知数量的内毒素加入一个样品，然后在实施了清除过程后，检测内毒素的回收率。

MethodsCandD. 方法C和D

Ifthenatureoftheproducttobeexaminedresultsinaninterferencethatcannotberemovedbyclassicalmethods（e.g.dilutionorcentriguation）,itmaybepossibletodeterminethestandardcurveinthesametypeofsubstanceorproductfreedfromendotoxinsbyappropriatetreatmentorbydilutionofthesubstanceorproduct.Theendotoxinstestisthencarriedoutbycomparisonwiththisstandardcurve.

如果受检产品的性质会导致一种干扰，而不能采用传统的方法消除（例如，稀释或离心），有可能通过对原料药制剂进行适当的处理或稀释，使用无内毒素的同类原料药或制剂来确立一个标准曲线。

然后通过与此标准曲线比较来进行内毒素测试。

Ultrafiltrationwithcellulosetriacetateasymmetricmembranefiltershasbeenfoundtobesuitableinmostcases.Thefiltersmustbeproperlyvalidated,becauseundersomecircumstancecellulose