食物平安国家标准食物微生物学查验肠杆菌科查验征求意见稿.docx
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食物平安国家标准食物微生物学查验肠杆菌科查验征求意见稿
食品安全国家标准
食品微生物学检验肠杆菌科检验
(征求意见稿)
1前言
本标准参照ISO21528-1:
2004食物和动物饲料微生物学肠杆菌科检测和计数方式第1部份:
带前增菌的MPN法(ISO21528-1:
2004Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-HorizontalmethodsforthedetectionandenumerationofEnterobacteriaceae-Part1:
detectionandenumerationbyMPNtechniquewithpre-enrichment)、ISO21528-2:
2004食物和动物饲料微生物学肠杆菌科检测和计数方式第2部份:
平板计数法(ISO21528-2:
2004Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-HorizontalmethodsforthedetectionandenumerationofEnterobacteriaceae-Part2:
Colony-countmethod.)。
本标准与ISO21528:
2004相较要紧修改如下:
——培育温度37℃±1℃修改成36℃±1℃;
——增加了革兰氏染色确证实验;
——修改了葡萄糖琼脂发酵实验阳性结果描述;
——增加了平板计数法的计算公式。
本标准的附录A、附录B是标准性附录。
食物平安国家标准
食物微生物学查验肠杆菌科查验
11 范围
本标准规定了食物中肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的查验方式。
本标准第一法适用于肠杆菌科含量较低而杂菌含量较高的食物中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较高食物中肠杆菌科的计数。
12 术语和概念
12.1 肠杆菌科Enterobacteriaceae
在必然条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞短杆菌。
12.2 肠杆菌科计数countofEnterobacteriaceae
按本标准规定方式,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。
12.3 最可能数mostprobablenumber,MPN
基于泊松散布的一种间接计数方式。
13 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培育设备外,其他设备和材料如下:
13.1 恒温培育箱:
36℃±1℃。
13.2 冰箱:
2℃~5℃。
13.3 水浴箱:
46℃±1℃。
13.4 电子天平:
感量0.1g。
13.5 显微镜:
10×~100×。
13.6 均质器。
13.7 振荡器。
13.8 无菌吸管:
1mL(具mL刻度)、10mL(具mL刻度)或微量移液器及吸头。
13.9 无菌锥形瓶或等效容器:
容量150mL、500mL。
13.10 无菌培育皿:
直径90mm。
13.11 无菌试管:
18mm×180mm、15mm×150mm。
13.12 pH计或pH比色管或周密pH试纸。
14 培育基和试剂
14.1 缓冲蛋白胨水(BPW):
见附录A中。
14.2 煌绿胆盐葡萄糖肉汤(EE):
见附录A中。
14.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)或再水化干膜测试片:
见附录A中。
14.4 营养琼脂(NA):
见附录A中。
14.5 葡萄糖琼脂:
见附录A中。
14.6 革兰氏染色液:
见附录A中。
14.7 氧化酶试剂:
见附录A中。
14.8 无菌1mol/LNaOH:
见附录A中。
14.9 无菌1mol/LHCl:
见附录A中。
第一法肠杆菌科MPN计数法
15 查验程序
肠杆菌科带有前增菌的MPN计数法查验程序见图1。
图1肠杆菌科带有前增菌的MPN计数法查验程序
15.1 操作步骤
15.1.1 样品的稀释
15.1.1.1 固体和半固体样品:
称取25g样品置盛有225mLBPW的无菌均质杯内,8000r/min~10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLBPW的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打1min~2min,制成1:
10的样品匀液。
液体样品:
以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mLBPW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1:
10的样品匀液。
15.1.1.2 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1:
10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入9mLBPW的无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,使其混合均匀,制成1:
100的样品匀液。
15.1.1.3 依照对样品污染状况的估量及相关限量要求,按上述操作,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。
每递增稀释1次,换用1支1mL无菌吸管或吸头。
从制备样品匀液至样品接种完毕,全进程不得超过15min。
15.1.2 接种和培育
15.1.2.1 非选择性前增菌
每一个样品,选择3个适宜持续稀释度的样品匀液,每一个稀释度3管,共9管BPW于36℃±1℃培育18h±2h。
15.1.2.2 选择性增菌
从BPW各培育管中,移取1mL,别离接种于10mL的EE肉汤中,36℃±1℃培育24h±2h。
15.1.2.3 分离
用接种环从EE肉汤各培育管中,移取1环,别离划线接种于VRBGA平板,36℃±1℃培育24h±2h,观看平板上有无典型菌落。
15.1.3 典型菌落确认
典型菌落为直径≥0.5mm,有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。
从每一个平板上至少挑取3-5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;若是有不同形态的典型菌落,那么每种形态别离至少挑取1个菌落进行确认;有些肠杆菌科可能致使菌落或培育基脱色,因此,如无典型菌落时可挑取白色菌落进行确认。
15.1.3.1 纯培育
别离将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36℃±1℃,培育18h~24h,取培育物进行革兰氏染色和生化确认。
15.1.3.2 革兰氏染色
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌。
15.1.3.3 生化鉴定
a)氧化酶实验
用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂的滤纸上,滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色,视为阳性反映。
b)葡萄糖发酵实验
用接种针挑取少量氧化酶阴性的同一个菌落,穿刺于葡萄糖琼脂内,于36℃±1℃培育24h±2h,假设试管内的内容物变成黄色,视为阳性反映。
15.2 报告
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。
只要有1个菌落鉴定为肠杆菌科,其所代表的EE管即为肠杆菌科阳性,依据EE阳性管数查MPN表(见附录B),报告每g(mL)样品中肠杆菌科的MPN值。
称重取样以MPN/g为单位报告,体积取样以MPN/mL为单位报告。
第二法肠杆菌科平板计数法
16 查验程序
肠杆菌科平板计数法查验程序见图2。
图2肠杆菌科平板计数法查验程序
16.1 操作步骤
16.1.1 样品的稀释
按进行。
16.1.2 培育
16.1.2.1 选择2个~3个适宜的持续稀释度的样品匀液(液体样品能够选择原液),每一个稀释度接种2个无菌平皿,每皿1mL。
或吸取1mLBPW加入到测试片中,每一个稀释度接种两个测试片。
同时,吸取1mLBPW加入两个无菌平皿(或测试片)内作为空白对照。
16.1.2.2 将10mL~15mL冷却至46℃±1℃的VRBGA(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注于每一个平皿中。
警惕旋转平皿,使样品匀液与培育基充分混匀。
16.1.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层一样的培育基覆盖平板表层。
避免蔓延生长并使菌落特点更为明显。
16.1.2.4 待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板,36℃±1℃培育18h~24h。
测试片接种后直接进行培育。
16.1.3 计数和挑选菌落确认
典型菌落确认见。
再水化干膜测试片中典型菌落为带有气泡和/或黄晕的菌落。
记录稀释倍数和相应的菌落数量,平板计数以菌落形成单位(colony-formingunits,CFU)表示。
16.1.3.1 选取菌落数在15~150之间的平板(或测试片)计数。
大于150的可记录为多不可计。
16.1.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,那么不宜采纳,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;假设片状菌落不到平板的四分之一,而其余菌落散布又很均匀,即可计算半个平板后乘以2,代表一个平板菌落数。
16.1.3.3 当平板上显现菌落间无明显界限的链状生长时,那么将每条单链作为一个菌落计数。
16.1.3.4 从每一个平板(或测试片)上随机挑取5个有代表性的菌落(不足5个时,应全数挑选)纯培育后进行生化确认。
16.1.4 结果的计算
16.1.4.1 一样原那么
a)假设有两个持续稀释度的平板(或测试片)典型菌落数在适宜计数范围内,按公式
(1)计算。
公式
(1)
……………………………………………………
(1)
式中:
N—样品中肠杆菌科菌落数;
A—某一平板(或测试片)顶用于确认实验的菌落数;
b—某一平板(或测试片)中A个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,b≤A;
C—某一平板(或测试片)中典型菌落总数;
∑a—确证的肠杆菌科菌落数之和;
n1—第一稀释度(低稀释倍数)平板(或测试片)个数(含适宜范围典型菌落数)
n2—第二稀释度(高稀释倍数)平板(或测试片)个数(含适宜范围典型菌落数)
d—稀释倍数(第一稀释度)
例如1—两个持续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表1。
表1例如1中肠杆菌科平板计数结果
稀释度
1:
100(第一稀释度)
1:
1000(第二稀释度)
典型菌落数(CFU)
126
118
20
24
用于确认试验的菌落数(CFU)
5
5
5
5
确证的菌落数(CFU)
4
5
4
3
a
4/5×126=101
5/5×118=118
4/5×20=16
3/5×24=14
上述数据按数字修约后,表示为11000或×104。
例如2—两个持续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内,或两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,那么相应的平板不作为计数平板,数据见表2。
表2例如2中肠杆菌科平板计数结果
稀释度
1:
100(第一稀释度)
1:
1000(第二稀释度)
典型菌落数(CFU)
126
118
20
10
用于确认试验的菌落数(CFU)
5
5
5
/
确证的菌落数(CFU)
4
5
4
/
a
4/5×126=101
5/5×118=118
4/5×20=16
/
上述数据按数字修约后,表示为11000或×104。
例如3—两个持续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,数据见表3。
表3例如3中肠杆菌科平板计数结果
稀释度
1:
100(第一稀释度)
1:
1000(第二稀释度)
典型菌落数(CFU)
126
118
20
20
用于确认试验的菌落数(CFU)
5
5
5
5
确证的菌落数(CFU)
4
5
4
0
a
4/5×126=101
5/5×118=118
4/5×20=16
0
上述数据按数字修约后,表示为11000或×104。
b)假设只有一个稀释度平板(或测试片)上的典型菌落数在适宜计数范围内,按公式
(1)计算,n2(或n1)=0。
c)假设所有稀释度的平板(或测试片)上典型菌落数均大于150,那么对稀释度最高的平板进行计数,其他平板可记录为多不可计,结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。
16.1.4.2 低菌落数
d)所有稀释度的平板(或测试片)典型菌落数均小于15,那么按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
e)假设所有稀释度(包括液体样品原液)平板(或测试片)均无菌落生长,或典型菌落数均小于15且无证明的肠杆菌科菌落,那么以小于1乘以最低稀释倍数计算。
16.1.4.3 特殊情形
f)第一稀释度平板(或测试片)菌落数超过150,第二稀释度菌落数低于15。
若是第一稀释度的平均菌落数在167~150之间(置信区间的上限加权平均为150),依照公式
(1)计算结果。
若是第一稀释度平均菌落数大于167,那么计算第二稀释度的结果并得出一个估算值,若是估算值小于8(置信区间的下限加权平均值为15),这时两个稀释度的不同是不能同意的。
g)第一稀释度平板上(或测试片)的菌落数超过150,有证明的肠杆菌科菌落,和第二稀释度菌落数少于150个,其中,无证明的肠杆菌科菌落,结果依照小于1/第二稀释度CFU/g(mL)且大于1/第一稀释度CFU/g(mL)计算。
h)第一稀释度平板上(或测试片)的菌落数超过150,无证明的肠杆菌科菌落,和第二稀释度菌落数少于150个,无证明的肠杆菌科菌落,结果依照小于1/第二稀释度CFU/g(mL)计算。
16.2 报告
16.2.1 菌落数小于100时,以整数报告。
16.2.2 菌落数大于或等于100时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用10的指数形式来表示,采纳两位有效数字。
16.2.3 数字修约按“四舍五入”原那么进行。
16.2.4 假设所有平板上为蔓延菌落而无法计数,那么报告菌落蔓延。
16.2.5 假设空白对照上有菌落生长,那么这次检测结果无效。
16.2.6 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
附录A
培育基和试剂
缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1成份
蛋白胨
10.0g
氯化钠
5.0g
磷酸氢二钠
3.5g
磷酸二氢钾
1.5g
蒸馏水
mL
A.1.2制法
将各成份加热溶解,于25℃时调剂pH至±,分装于500mL广口瓶中,每瓶225mL,121℃高压灭菌15min。
煌绿胆盐葡萄糖肉汤(EE肉汤)
A.2.1成份
蛋白胨
10.0g
葡萄糖
5.0g
磷酸氢二钠(无水)
6.45g
磷酸二氢钾
2.0g
3号胆盐
20.0g
煌绿
mL(%水溶液)
蒸馏水
mL
A.2.2制法
将各成份溶于水中,加热煮沸至完全溶解,加热不宜超过30min,迅速冷却培育基,于25℃调剂pH至±,分装于灭菌的18mm×180mm试管中,每管10mL,不需高压灭菌,5℃±3℃可寄存一个月。
结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)
A.3.1成份
蛋白胨
7.0g
酵母浸膏
3.0g
3号胆盐
1.5g
葡萄糖
10.0g
氯化钠
5.0g
中性红
0.03g(或%酒精溶液5mL)
结晶紫
0.002g(或%水溶液2mL)
琼脂粉
10.0g~12.0g
蒸馏水
1mL
A.3.2制法
将各成份溶于水中,加热煮沸至完全溶解,25℃时调剂pH至±,分装于灭菌的三角烧瓶中,不需高压灭菌,用前制备。
营养琼脂
A.4.1成份
牛肉浸膏
3.0g
蛋白胨
5.0g
琼脂粉
10.0g~12.0g
蒸馏水
mL
A.4.2制法
将各成份溶于水中,加热煮沸,25℃时调剂pH至±,121℃高压灭菌15min。
葡萄糖琼脂
A.5.1成份
胰蛋白胨
10.0g
酵母浸膏
1.5g
葡萄糖
10.0g
氯化钠
5.0g
溴甲酚紫
0.015g(或%溴甲酚紫酒精溶液mL)
琼脂粉
10.0g~12.0g
蒸馏水
mL
A.5.2制法
将各成份溶于水中,加热煮沸,25℃时调剂pH至±,分装于15mm×150mm试管,每管约5mL,121℃高压灭菌15min后,试管垂直放置。
于5℃±3℃可寄存1周。
为去除培育基中的氧气,利用前可将葡萄糖琼脂试管置于滚水浴中15min,然后迅速冷却,备用。
革兰氏染色液
A.6.1结晶紫染色液
A.6.1.1成份
结晶紫
1.0g
95%乙醇
mL
1%草酸铵水溶液
mL
A.6.1.2制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.6.2革兰氏碘液
A.6.2.1成份
碘
1.0g
碘化钾
2.0g
蒸馏水
mL
A.6.2.2制法
将碘和碘化钾先行混合,加入少量蒸馏水充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
A.6.3沙黄复染液
A.6.3.1成份
沙黄
0.25g
95%乙醇
mL
蒸馏水
mL
A.6.3.2制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.6.4染色法
A.6.4.1将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
A.6.4.2滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
A.6.4.3滴加95%乙醇脱色约15~30s,直至染色液被洗掉,但不要过度脱色,水洗。
A.6.4.4加沙黄复染液,复染1min,水洗、干燥、镜检。
A.6.4.5革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
氧化酶试剂
A.7.1成份
N,N,N’,N’-四甲基对苯二胺盐酸盐
1.0g
蒸馏水
mL
A.7.2制法
将上述成份溶解于冷水中,少量新鲜配制。
A.7.3实验方式
用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。
在10s内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶实验阳性。
不变色者为氧化酶实验阴性。
无菌1mol/LNaOH
A.8.1成份
NaOH
40.0g
蒸馏水
mL
A.8.2制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
无菌1mol/LHCl
A.9.1成份
HCl
mL
蒸馏水
mL
A.9.2制法
移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121℃高压灭菌15min。
附录B
肠杆菌科最可能数(MPN)检索表
每g(mL)检样中肠杆菌科最可能数(MPN)的检索见表。
表肠杆菌科最可能数(MPN)的检索表
阳性管数
MPN
95%置信区间
阳性管数
MPN
95%置信区间
低
高
低
高
0
0
0
<
--
2
2
0
21
42
0
0
1
2
2
1
28
94
0
1
0
11
2
2
2
35
94
0
1
1
18
2
3
0
29
94
0
2
0
18
2
3
1
36
94
0
3
0
38
3
0
0
23
94
1
0
0
18
3
0
1
38
110
1
0
1
18
3
0
2
64
17
180
1
0
2
11
38
3
1
0
43
9
180
1
1
0
20
3
1
1
75
17
200
1
1
1
11
38
3
1
2
120
37
420
1
2
0
11
42
3
1
3
160
40
420
1
2
1
15
42
3
2
0
93
18
420
1
3
0
16
42
3
2
1
150
37
420
2
0
0
38
3
2
2
210
40
430
2
0
1
14
42
3
2
3
290
90
1,000
2
0
2
20
42
3
3
0
240
42
1,000
2
1
0
15
42
3
3
1
460
90
2,000
2
1
1
20
42
3
3
2
1100
180
4,100
2
1
2
27
94
3
3
3
>1100
420
--
1注:
①本表采纳3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)]、每一个稀释度接种3管。
②表内所列检样量如改用lg(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时,那么表内数字应相应增高10倍,其余类推。
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